VALIDASI METODE PARAMETER LOD DAN LOQ

PADA TABLETPARASETAMOL MENGGUNAKAN

SPEKTROFOTOMETRI UV-VIS

 
I.                   Tujuan
 Praktikan dapat mengetahui dan melakukan validasi metode parameter batas deteksi (LOD)
dan batas kuantifikasi (LOQ) terhadap tablet parasetamol menggunakan spektrofotometri UV-
Vis.

II.                Prinsip
1.      Akurasi
2.      Presisisi
3.      Linieritas
4.      Spesifisitas
5.      LOD dan LOQ

III.             Teori Dasar
            Validasi metoda analisis adalah suatu tindakan penilaian
terhadap parameter tertentu, berdasarkan percobaan laboratorium, untuk membuktikan bahwa
parameter tersebut memenuhi persyaratan untuk penggunaannya. Validasi metode analisis
bertujuan untuk memastikan dan mengkonfirmasi bahwa metode analisis tersebut sudah sesuai
untuk peruntukannya (Gandjar, 2007).

            Klasifikasi Metode Analisis

Menurut USP 30-NF25 (2007), metode analisis diklasifikasikan dalam 3 kategori, yaitu:
a.      Kategori I :
Metode analisis yang digunakan untuk penetapan kadar komponen utama dalam
bahan baku obat dan sediaan obat jadi atau bahan aktif lainnya seperti pengawet
b.      Kategori II :
Metode analisis yang digunakan untuk penetapan cemaran dalam bahan baku obat
atau hasil degradasinya dalam sediaan obat jadi
c.       Kategori III :
Metode analisis yang digunakan untuk penetapan kinerja dan kualitas sediaan obat
jadi, seperti uji disolusi dan uji pelepasan obat (Gandjar, 2007).
Parameter Validasi Metode Analisis
Prosedur analisis yang harus divalidasi meliputi beberapa jenis pengujian, yaitu adanya
pengotor, uji limit untuk mengendalikan keberadaan pengotor, serta uji kuantitatif komponen
aktif atau komponen lain dalam produk obat-obatan. Selain itu, terdapat 8 parameter validasi
metode analisis yaitu spesifisitas, presisi/ketelitian, akurasi/ketepatan, linearitas, kisaran, limit
deteksi, limit kuantitasi, dan ketangguhan. Pemilihan parameter yang akan diuji tergantung dari
jenis dan metode pengujian yang akan divalidasi (Chan, 2004).
a.      Akurasi
Accuracy adalah ukuran yang menunjukkan derajat kedekatan hasil analis dengan kadar
analit yang sebenarnya. Accuracy dinyatakan sebagai persen perolehan kembali (recovery) analit
yang ditambahkan.  Kecermatan hasil analis sangat tergantung kepada sebaran galat sistematik di
dalam keseluruhan tahapan analisis. Oleh karena itu untuk mencapai kecermatan yang tinggi
hanya dapat dilakukan dengan cara mengurangi galat sistematik tersebut seperti menggunakan
peralatan yang telah dikalibrasi, menggunakan pereaksi dan pelarut yang baik, pengontrolan
suhu, dan pelaksanaannya yang cermat, taat asas sesuai prosedur  (Gandjar, 2007).
  Accuracy dapat ditentukan melalui dua cara, yaitu metode simulasi (spiked-placebo
recovery) atau metode penambahan baku (standard addition method) (Riyadi,
2009). Kecermatan hasil analis sangat tergantung kepada sebaran galat sistematik di dalam
keseluruhan tahapan analisis. Dalam metode simulasi, sejumlah analit bahan murni ditambahkan
ke dalam plasebo, lalu campuran tersebut dianalisis dan hasilnya dibandingkan dengan kadar
standar yang ditambahkan (kadar yang sebenarnya). Recovery dapat ditentukan dengan cara
membuat sampel plasebo (eksepien obat, cairan biologis) kemudian ditambah analit dengan
konsentrasi tertentu (biasanya 80% sampai 120% dari kadar analit yang diperkirakan), kemudian
dianalisis dengan metode yang akan divalidasi (Riyadi, 2009).
Dalam metode adisi (penambahan baku), sampel dianalisis lalu sejumlah tertentu analit
yang diperiksa (pure analit/standar) ditambahkan ke dalam sampel, dicampur dan dianalisis lagi.
Selisih kedua hasil dibandingkan dengan kadar yang sebenarnya. Pada metode penambahan
baku, pengukuran blanko tidak diperlukan lagi. Metode ini tidak dapat digunakan jika
penambahan analit dapat mengganggu pengukuran, misalnya analit yang ditambahkan
menyebabkan kekurangan pereaksi, mengubah pH atau kapasitas dapar, dll. Recovery
dinyatakan sebagai rasio antara hasil yang diperoleh dengan hasil yang sebenarnya. Biasanya
persyaratan untuk recovery adalah tidak boleh lebih dari 5% (Riyadi, 2009).
 b.      Presisi
Precision adalah ukuran yang menunjukkan derajat kesesuaian antara hasil uji individual,
diukur melalui penyebaran hasil individual dari rata-rata jika prosedur diterapkan secara
berulang pada sampel-sampel yang diambil dari campuran yang homogen. Presicion diukur
sebagai simpangan baku atau simpangan baku relatif (koefisien variasi). Precision dapat
dinyatakan sebagai repeatability (keterulangan) atau reproducibility
(ketertiruan). Repeatability adalah keseksamaan metode jika dilakukan berulang kali oleh analis
yang sama pada kondisi sama dan dalam interval waktu yang pendek. Repeatability dinilai
melalui pelaksanaan penetapan terpisah lengkap terhadap sampel-sampel identik yang terpisah
dari batch yang sama, jadi memberikan ukuran keseksamaan pada kondisi yang normal (Riyadi,
2009).
Reproducibility adalah keseksamaan metode jika dikerjakan pada kondisi yang berbeda.
Biasanya analisis dilakukan dalam laboratorium-laboratorium yang berbeda menggunakan
peralatan, pereaksi, pelarut, dan analis yang berbeda pula. Analisis dilakukan terhadap sampel-
sampel yang diduga identik yang dicuplik dari batch yang sama. Kriteria seksama diberikan jika
metode memberikan simpangan baku relatif (RSD) atau koefisien variasi (CV) 2% atau kurang.
Akan tetapi kriteria ini sangat fleksibel tergantung pada konsentrasi analit yang diperiksa, jumlah
sampel, dan kondisi laboratorium (Riyadi, 2009).

c.       Linieritas dan Rentang
Linearitas menunjukkan kemampuan suatu metode analisis untuk memperoleh hasil
pengujian yang sesuai dengan konsentrasi analit dalam sampel pada kisaran konsentrasi
tertentu. Sedangkan rentang metode adalah pernyataan batas terendah dan tertinggi analit yang
sudah ditunjukkan dapat ditetapkan dengan kecermatan, keseksamaan, dan linearitas yang dapat
diterima. Rentang dapat dilakukan dengan cara membuat kurva kalibrasi dari beberapa set
larutan standar yang telah diketahui konsentrasinya (Ermer & Miller 2005).
Persamaan garis yang digunakan pada kurva kalibrasi diperoleh dari metode kuadrat
terkecil, yaitu y = a + bx. Persamaan ini akan menghasilkan koefisien korelasi (r). Koefisien
korelasi inilah yang digunakan untuk mengetahui linearitas suatu metode analisis. Penetapan
linearitas minimum menggunakan lima konsentrasi yang berbeda. Nilai koefisien korelasi yang
memenuhi persyaratan adalah lebih besar dari 0.9970 (ICH, 1995).  Linearitas juga dapat
diketahui dari kemiringan garis, intersep, dan residual (Ermer & Miller 2005).
d.      Selektivitas (Spesifisitas)
Selektivitas atau spesifisitas suatu metode adalah kemampuannya yang hanya
mengukur zat tertentu saja secara cermat dan seksama dengan adanya komponen lain
yang mungkin ada dalam matriks sampel. Selektivitas seringkali dapat dinyatakan
sebagai derajat penyimpangan (degree of bias) metode yang dilakukan terhadap
sampel yang mengandung bahan yang ditambahkan berupa cemaran, hasil urai,
senyawa sejenis, senyawa asing lainnya, dan dibandingkan terhadap hasil analisis
sampel yang tidak mengandung bahan lain yang ditambahkan. Penyimpangan hasil
jika ada merupakan selisih dari hasil uji keduanya. Jika cemaran dan hasil urai tidak
dapat diidentifikasi atau tidak dapat diperoleh, maka selektivitas dapat ditunjukkan
dengan cara menganalisis sampel yang mengandung cemaran atau hasil uji urai
dengan metode yang hendak diuji lalu dibandingkan dengan metode lain untuk
pengujian kemurnian seperti kromatografi, hhanalisis kelarutan fase, dan Differential
Scanning Calorimetry. Derajat kesesuaian kedua hasil analisis tersebut merupakan
ukuran selektivitas (Riyadi, 2009).
e.      Limit Deteksi dan Limit Kuantitasi
            Limit deteksi merupakan jumlah atau konsentrasi terkecil analit dalam sampel yang dapat
dideteksi, namun tidak perlu diukur sesuai dengan nilai sebenarnya. Limit kuantitasi adalah
jumlah analit terkecil dalam sampel yang dapat ditentukan secara kuantitatif pada tingkat
ketelitian dan ketepatan yang baik. Limit kuantitasi merupakan parameter pengujian kuantitatif
untuk konsentrasi analit yang rendah dalam matriks yang kompleks dan digunakan untuk
menentukan adanya pengotor atau degradasi produk. Limit deteksi dan limit kuantitasi dihitung
dari rerata kemiringan garis dan simpangan baku intersep kurva standar yang
diperoleh  (ICH, 1995).

Asetaminofen

Parasetamol atau asetaminofen adalah turunan para-aminophenol memiliki khasiat

sebagai analgesik, antipiretik, dan aktivitas antiradang yang lemah. Parasetamol merupakan
analgesik non-opioid sering dicoba pertama untuk pengobatan gejala berbagai tipe sakit kepala
termasuk migrain dan sakit kepala tipe tensi.
Pemerian          : serbuk hablur, putih; tidak berbau; rasa sedikit pahit.
Berat jenis        : 1.263 g/cm3
Titik lebur        : 169°C (336°F)
Kelarutan         : dalam air 1,4 g/100 mL atau 14 mg/mL (20°C); larut
                           dalam air medidih, dan dalam NaOH 1 N; mudah larut
                           dalam etanol, methanol, tidak larut dalam kloroform,
               praktis tidak larut dalam eter, pentana dan benzene
Nama Kimia :  N-acetyl-p-aminophenol atau p-asetamedofenol atau
                           4’- hidroksiasetanilida
Rumus Empiris: C8H9NO2
Berat Molekul :  151,16
Jarak lebur       :  antara 168-172  (Depkes RI, 1995).
            Parasetamol memiliki serapan maksimum dalam larutan asam pada panjang
gelombang 245 nm (A11=668a) dan dalam larutan basa pada panjang gelombang 257
nm (A11=715a) sedangkan pada inframerah memperlihatkan puncak pada 1506,
1657, 1565, 1263, 1227, 1612 cm−1. (Moffat dkk, 2005).

Spektrofotometri UV-Visible
            Spektrofotometer UV-Vis adalah pengukuran panjang gelombang dan
intensitas sinar ultraviolet dan cahaya tampak yang di absorbsi oleh sampel.
Spektrofotometer UV-Vis biasanya digunakan untuk molekul dan ion anorganik atau
kompleks dalam larutan. Sinar ultraviolet berada pada panjang gelombang 200-400
nm, sedangkan sinar tampak berada pada panjang gelombang 400-800 nm. Sebagai
sumber cahaya biasanya di gunakan lampu hydrogen atau deuterium untuk
pengukuran UV dan lampu tungsten untuk pengukuran pada cahaya tampak
(Dachriyanus, 2004).

IV.              Alat dan Bahan

Alat dan gambar alat
No Alat Gambar Alat
1 Beaker glass
2 Bulb pipet

3 Labu Ukur

4 Mortir dan stamper

5 Neraca Analitik

6 Spektrofotometer UV
 7 Volume pipet

Bahan
1.      Etanol 95%
2.      Tablet parasetamol

V.                 Prosedur
Pembuatan kurva baku
            Parasetamol BPFI ditimbang sebanyak 5 mg secara seksama, kemudian dimasukkan ke
dalam labu ukur 50 ml. Kemudian dilarutkan dengan etanol dan di-add hingga tanda batas.
Diperoleh larutan baku stock 100 ppm. Dari larutan baku tersebut dibuat pengenceran hingga
diperoleh 5 konsentrasi yang berbeda yaitu 4ppm, 6ppm, 8ppm, 10ppm, dan 12 ppm. Masing-
masing konsetrasi diukur absorbansinya menggunakan sperktrofotometer UV pada panjang
gelombang 245 nm kemudian dibuat kurva baku.

Preparasi sampel dan pembuatan larutan stock parasetamol

            Tablet parasetamol sebanyak 20 tablet digerus menggunakan mortir dan stamper hingga
halus. Kemudian serbuk parasetamol ditimbang sebanyak 50 mg secara seksama, lalu
dimasukkan ke dalam labu ukur 50 ml. Ke dalam labu ditambahkan 20 ml etanol, dikocok
hingga larut lalu di-add etanol hingga tanda batas dan diperoleh konsentrasi 1000 ppm. Larutan
 tersebut dikocok hingga homogen, kemudian disaring menggunakan kertas saring dan filtratnya
diambil.

Pengenceran sampel parasetamol

1.      Larutan 100 ppm
Dipipet 2 ml larutan parasetamol 1000 ppm dan dimasukkan ke dalam labu ukur 20 ml.
Kemudian di-add etanol hingga tanda batas dan diperoleh konsetrasi 100 ppm. Larutan tersebut
dikocok hingga homogen.
2.      Uji LOD ,8415 ppm
Dipipet 0,17 ml larutan parasetamol 100 ppm dan dimasukkan ke dalam labu ukur 20 ml.
Kemudian di-add etanol hingga tanda batas dan diperoleh konsetrasi 0,8415 ppm. Larutan
tersebut dikocok hingga homogen.
3.      Uji LOQ  2,8052 ppm
Dipipet 0,56 ml larutan parasetamol 100 ppm dan dimasukkan ke dalam labu ukur 20 ml.
Kemudian di-add etanol hingga tanda batas dan diperoleh konsetrasi 2,8052 ppm. Larutan
tersebut dikocok hingga homogen.

VI.              Data Pengamatan dan Perhitungan

DATA PENGAMATAN AKURASI TABLET PARACETAMOL
        Pembuatan larutan tablet parasetamol
  Massa tablet rata- rata = 545,24 mg
  Dibuat konsentrasi larutan stok sampel
=  500 mg/ 50 ml
= 10000 ppm
  Diencerkan = 400 ppm
  Dibuat 3 variasi konsentrasi :
1.      12 ppm
V x 400 ppm = 20 x 12 ppm
V = 0.6 ml
2.      10 ppm
V x 400 ppm = 20 x 10 ppm
V = 0.5 ml
3.      8 ppm
V x 400 ppm = 20 x 8 ppm
V = 0.4 ml
        Nilai absorbansi
 Absorbansi
Konsentrasi Rata- rata
I II III
8 ppm 0.5256 0.5256 0.5254 0.5255
10 ppm 0.6888 0.6885 0.6888 0.6887
12 ppm 0.8231 0.8230 0.8241 0.8234
Persamaan garis larutan baku : y = 0.07012x – 0.091472

        Perhitungan konsentrasi sampel

1.      8 ppm
0.5255 = 0.07012x – 0.091472
x = 8,800 ppm
2.      10 ppm
0.6887 = 0.07012x – 0.091472
x = 11,126 ppm
3.      12 ppm
0.8234 = 0.07012x – 0.091472
x = 13,047 ppm

        Persen recovery
Persen recovery (%) =  x 100 %
Keterangan :
a = konsentrasi contoh + konsentrasi standar yang ditambahkan
b = konsentrasi contoh
c = konsentrasi standar teoritis yang ditambahkan

1.      8 ppm
=  x 100 % = 110 %
2.      10 ppm
=  x 100 % = 111,26 %
3.      12 ppm
=  x 100 % = 108,725 %
Dari hasil yang diperoleh, nilai ini masih dapat diterima akurasinya karena menurut
(AOAC, 1998), secara umum nilai akurasi yang dapat diterima sebesar 80- 120%.
DATA PENGAMATAN PRESISI TABLET PARACETAMOL
        Penimbangan Tablet dan Sampel

Berat 20 tablet  = 12,6672 gram

Berat 1 tablet    = 0,63336 gram

Jumlah parasetamol dalam tablet 0,63336 gram adalah 0,5000 gram atau 500 mg

Berat Sampel obat yang ditimbang                    = 0,0632 gram

Berat parasetamol dalam sampel adalah            = 0,4989 gram

        Perhitungan konsentrasi sampel

Kadar Sampel =  = 1995,6 ppm

        Pengenceran Sampel
V1 x N1           = V2 X N2
V1 x 1995,6     = 25 ml x 6 ppm
V1                   = 0,075 ml ...........  Ad hingga 25 ml

        Hasil Absorbansi

Pengulangan Absorbansi Kadar ( x ) ( x -  ) ( x -  )2

1 0,3315 108,5 7,49 56,1001
2 0,3072 100,56 -0,45 0,2025
3 0,3040 99,51 -1,5 2,25
4 0,3024 98,98 -2,03 4,1209
5 0,3028 99,12 -1,89 3,5721
6 0,3036 99,37 -1,64 2,6896

        Perhitungan Standar Deviasi

SD =  =  = 3,713

        Perhitungan RSD
 RSD =  = 0,0367
        Perhitungan CV

CV = 0,0367 X 100 % = 3,67 %

        Perhitungan CV Harwitz

CV (%) = 0,66 X 2 1 – ( 0,5 X 6 ) = 0,165 %

DATA PENGAMATAN LINEARITAS TABLET PARASETAMOL

Larutan baku paracetamol 100 ppm
Blanko H2O : NaOH (1:1)
Pengenceran (Volume 10 ml)
Volume standar (ml) Konsentrasi (ppm)
0,4 4
0,6 6
0,8 8
1,0 10
1,2 12

Pengukuran Absorbansi
Konsentrasi (ppm) A1 A2 A3 A4 A5 A6
4 0,2092 0,2097 0,2120 0,2106 0,2102 0,2097
6 0,3050 0,3048 0,3052 0,3061 0,3062 0,3055
8 0,4622 0,4618 0,4610 0,4621 0,4621 0,4620
10 0,6176 0,6176 0,6174 0,6170 0,6181 0,6147
12 0,7561 0,7549 0,7562 0,7550 0,7558 0,7545

Linearitas
Pengukuran R a b
1 0,9971 0,07032 -0,09654
2 0,99703 0,07016 -0,091152
3 0,99677 0,07003 -0,08988
4 0,99712 0,069985 -0,08972
5 0,997132 0,070155 -0,09076
 6 0,99714 0,070075 -0,09078
Rata-Rata 0,99704 0,07012 -0,091472

DATA PENGAMATAN SPESIFISITAS TABLET PARASETAMOL

a.       Berat tablet total (19 tablet)            = 13095,1 mg
b.      Berat satuan tablet (1/19 tablet)      = 677,6 mg
c.       Berat serbuk total   (19 tablet)        = 12900 mg
d.      Berat serbuk (1/19 tablet)               = 682 mg
e.       Konsentrasi filtrate tablet Parasetamol (larutan filtrate stock)
Konsentrasi = 5000 ppm
f.        Pengenceran filtran tablet parasetamol
-         400 ppm
M1 x V1 = M2  x V2
5000 ppm x V1 = 400 ppm x 25 mL
V1 = 2 mL
-         40 ppm
M1 x V1 = M2  x V2
400 ppm x V1 = 40 ppm x 10 mL
V1 = 1  mL
g.       Pembuatan larutan Saccharum Lactis
Konsentrasi = 5000 ppm
h.       Pembuatan larutan uji tablet parasetamol
No. Larutan Filtrat Larutan SL Pelarut Total
1. 2,5 mL 0 22,5 mL 25 mL
2. 2,5 mL 1 mL 21,5 mL 25 mL
3. 2,5 mL 2 mL 20,5 mL 25 mL
4. 2,5 mL 3 mL 19,5 mL 25 mL
5. 2,5 mL 4 mL 18,5 mL 25    L

i.         Perhitungan parasetamol teoritis

-         4 ppm
M1 x V1 = M2  x V2
400 ppm x V1 = 4 ppm x 25 mL
V1 = 2,5 mL
j.        Perhitungan saccharum lactis teoritis
-         200 ppm
M1 x V1 = M2  x V2
5000 ppm x V1 = 200 ppm x 25 mL
V1 = 1 mL
-         400 ppm
M1 x V1 = M2  x V2
5000 ppm x V1 = 400 ppm x 25 mL
V1 = 2 mL
-         600 ppm
M1 x V1 = M2  x V2
5000 ppm x V1 = 600 ppm x 25 mL
V1 = 3 mL
-         800 ppm
M1 x V1 = M2  x V2
5000 ppm x V1 = 800 ppm x 25 mL
V1 = 4 mL
k.      Pembuatan Kurva Baku Parasetamol
Konsentrasi = 100 ppm
Pengenceran :
-         4 ppm
M1 x V1 = M2  x V2
100 ppm x V1 = 4 ppm x 10 mL
V1 = 0,4 mL
-         6 ppm
M1 x V1 = M2  x V2
100 ppm x V1 = 6 ppm x 10 mL
V1 = 0,6 mL
-         8 ppm
M1 x V1 = M2  x V2
100 ppm x V1 = 8 ppm x 10 mL
V1 = 0,8 mL
-         10 ppm
M1 x V1 = M2  x V2
100 ppm x V1 = 10 ppm x 10 mL
V1 = 1 mL
-         12 ppm
 M1 x V1 = M2  x V2
100 ppm x V1 = 12 ppm x 10 mL
V1 = 1,2 mL

l.         Absorbansi Baku Parasetamol

Konsentrasi Absorbansi
(ppm) A1 A2 A3 A4 A5 A6
4 0,2092 0,2097 0,2120 0,2106 0,2102 0,2097
6 0,4622 0,4618 0,4610 0,4621 0,4621 0,4620
8 0,3050 0,3048 0,3052 0,3061 0,3062 0,3055
10 0,6176 0,6176 0,6174 0,6170 0,6181 0,6174
12 0,7561 0,7549 0,7562 0,7550 0,7558 0,7545

Persamaan Garis
-         y = 0,07032 x – 0,09254
r2 = 0,9971
-         y = 0,07016 x – 0,091152
r2 = 0,99703
-         y = 0,07003 x – 0,08988
r2 = 0,99677
-         y = 0,069985 x – 0,08972
r2 = 0,99712
-         y = 0,070155 x – 0,09076
r2 = 0,997132
-         y = 0,070075 x – 0,09078
r2 = 0,99714

rata-rata persamaan garisnya :

y = 0,070120833 x – 0,0908053

m.     Absorbansi Larutan Uji

No. A1 A2 A3 Rata-rata A
1 0,3063 0,3060 0,3059 0,3060
2 0,3166 0,3167 0,3163 0,3165
 3 0,3132 0,3133 0,3136 0,3134
4 0,3727 0,3726 0,3729 0,3727
5 0,3299 0,3294 0,3292 0,3295

n.       Perhitungan Konsentrasi Parasetamol nyata

y = 0,070120833 x – 0,0908053
x = 
1.     x =  = 5,66 ppm
2.     x =  = 5,81 ppm
3.     x =  = 5,76 ppm
4.     x =  = 6,61 ppm
5.     x =  = 5,99 ppm

o.      Perhitungan % Recovery
% recovery =  x 100 %
1.      % recovery =  x 100 % = 0,332 %
2.      % recovery =  x 100 % = 0,362 %
3.      % recovery =  x 100 % = 0,352 %
4.      % recovery =  x 100 % = 0,522 %
5.      % recovery =  x 100 % = 0,398 %

Rata-rata % Recovery = 0,3932 %

DATA PENGAMATAN LOD DAN LOQ TABLET PARASETAMOL

 Tabel Hasil Pengukuran Absorbansi

No Konsentrasi Absorbansi
1 4 ppm 0.21023
2 6 ppm 0.30547
3 8 ppm 0.46187
4 10 ppm 0.61752
5 12 ppm 0.75542
Rata-rata 0.4701

            Perhitungan pengenceran larutan baku

            Larutan Baku Stock  100 ppm

1.     

2.     

3.     

4.     

5.     

           
No Konsentrasi (x) Absorbansi (y) yi (y-yi)
1 4 ppm 0.21023 0.18961 0.000425
2 6 ppm 0.30547 0.32985 0.000594
3 8 ppm 0.46187 0.47009 0.0000674
4 10 ppm 0.61752 0.61033 0.0000517
5 12 ppm 0.75542 0.75057 0.0000235
Jumlah 0.00116

yi  didapat dari persamaan regresi y = 0.07012 x – 0.09087

x1  = 4 ppm       à y = 0.07012 x 4 – 0.09087  = 0.18961
x2  = 6 ppm       à y = 0.07012 x 6 – 0.09087 = 0.32985
x3  = 8 ppm       à y = 0.07012 x 8 – 0.09087 = 0.47009
x4  = 10 ppm     à y = 0.07012 x 10 – 0.09087= 0.61033
x5  = 12 ppm     à y = 0.07012 x 12 – 0.09087= 0.75057

            Tabel Hasil Pengukuran LOD dan LOQ

Konsentrasi Absorbansi Rata-rata
LOD 0.8415 ppm 0.0722 0.0722 0.0721 0.07217
LOQ 2.8052 ppm 0.0724 0.0723 0.0721 0.07227

            Larutan stock sampel  1000 ppm

Pengenceran stock
M1     x V1 = M2 x V2
1000 x V1 = 100 x 20
             V1 = 2 mL

Pengenceran larutan uji LOD

M1   x V1 = M2   x V2
100 x V1 = 0.8415 x 20
          V1 = 0.1683 mL

Pengenceran larutan uji LOQ

M1   x V1 = M2  x V2
100 x V1 = 2.8052 x 20
          V1 = 0.56104 mL

VII.                   Pembahasan Validasi LOD dan LOQ

Pada praktikum kali ini bertujuan untuk memahami kerja alat spektrofotometer
ultraviolet- visible, mencari panjang gelombang maksimum dan optimum suatu seyawa obat,
serta membuat kurva kalibrasi suatu senyawa parameter validasi (kurva validasi, akurasi, presisi,
LOD, LOQ) dan penetapan kadar dalam sediaan. Sampel yang digunakan adalah tablet
paracetamol dan menggunakan alat spektrofotometer UV-VIS. Waktu praktikum selama 2 kali
pertemuan.
         Spektrofotometer ultraviolet visible merupakan alat dengan teknik spektrofotometer pada
daerah ultra-violet dan sinar tampak. Alat ini digunakan untuk  mengukur serapan sinar ultra
violet atau sinar tampak oleh suatu materi dalam bentuk larutan.Prinsip dasar Spektrofotometri
UV-Vis adalah serapan cahaya. Bila cahaya jatuh pada senyawa, maka sebagian dari cahaya
diserap oleh molekul-molekul sesuai dengan struktur dari molekul senyawa tersebut. Serapan
cahaya oleh molekul dalam daerah spektrum UV-Vis tergantung pada struktur elektronik dari
molekul. Spektra UV-Vis dari senyawa-senyawa organik berkaitan erat dengan transisi-transisi
diantara tingkatan-tingkatan tenaga elektronik. Radiasi ultraviolet dan sinar tampak diabsorpsi
oleh molekul organik aromatik, molekul yang mengandung elektron-π terkonjugasi dan atau
atom yang mengandung elektron-n, menyebabkan transisi elektron di orbital terluarnya dari
tingkat energi elektron tereksitasi lebih tinggi. Besarnya serapan radiasi tersebut sebanding
dengan banyaknya molekul analit yang mengabsorpsi sehingga dapat digunakan untuk analisis
kuantitatif. Dalam hal ini, hukum Lamber beer dapat menyatakan hubungan antara serapan
cahaya dengan konsentrasi zat dalam larutan. 
      Spektrofotometer UV-VIS dapat menganalisa secara kualitatif dan kuantitatif.  Pada
analisa kualitatif karakteristik resapan suatu zat dalam pelarut tertentu, yaitu panjang gelombang
maksimum dan daya resapnya. Penentuan panjang gelombang maksimum dengan membuat
spektrum dengan cara membuat larutan baku primer/induk.
Langkah awal yang dilakukan adalah tablet parasetamol sebanyak 20 tablet digerus
menggunakan mortir dan stamper hingga halus. Kemudian serbuk parasetamol ditimbang
sebanyak 50 mg secara seksama, lalu dimasukkan ke dalam labu ukur 50 ml. Ke dalam labu
ditambahkan 20 ml etanol, dikocok hingga larut lalu di-add etanol hingga tanda batas dan
diperoleh konsentrasi 1000 ppm. Larutan tersebut dikocok hingga homogen, kemudian disaring
menggunakan kertas saring dan filtratnya diambil. Setelah tahap preparasi sampel, dilakukan
tahap pembuatan kurva baku. Parasetamol BPFI ditimbang sebanyak 5 mg secara seksama,
kemudian dimasukkan ke dalam labu ukur 50 ml. Kemudian dilarutkan dengan etanol dan di-add
hingga tanda batas. Diperoleh larutan baku stock 100 ppm. Dari larutan baku tersebut dibuat
pengenceran hingga diperoleh 5 konsentrasi yang berbeda yaitu 4ppm, 6ppm, 8ppm, 10ppm, dan
12 ppm. Masing-masing konsetrasi diukur absorbansinya menggunakan sperktrofotometer UV
pada panjang gelombang 245 nm kemudian dibuat kurva baku.

Pipet sejumlah volume larutan induk dan diencerkan kedalam labu hingga diperoleh
konsentrasi 10 um/mL . setelah  itu ukur serapannya dengan spektrofotometer untuk menentukan
panjang gelombang maksimum. Setelah dianalisis dengan spektrofotometer didapatkan panjang
gelombang maksimum untuk paracetamol adalah 243 nm. Berdasarkan literature,  panjang
gelombang paracetamol 245 nm. Sehingga hasil dari praktikum tersebut masih sesuai dengan
panjang gelombang maksimum sebenarnya karena hasilnya tidak terlalu jauh berbeda. Setelah
itu, membuat kurva kalibrasi berdasarkan data panjang gelombang maksimum yang diperoleh,
dibuat lima seri konsentrasi larutan  dari larutan induk dengan menggunakan rumus Lambert
Beer. Untuk membuat lima seri konsentrasi larutan sebelumnya, ditentukan nilai konsentrasi
minimum dan maksimum dengan rumus  A=a.b.c. Nilai konsentrasi minimum yang didapat
adalah 4 ppm dan nilai konsentrasi maksimumnya 12 ppm. Selanjutnya dibuat lima seri
konsentrasi larutan yaitu 4,6,8,10,12, ppm. Setelah itu ukur serapan masing-masing larutan pada
panjang gelombang maksimum baku. Sehingga didapatkan persamaan regresi linear yaitu
y=0,0702x - 0,09087. sehingga diperoleh nilai resapan 0,997 . 

Selanjutnya dihitung parameter validasi. Parameter validasi berguna untuk membuktikan

bahwa parameter tersebut memenuhi persyaratan dalam penggunaannya. Tujuan utama validasi
parameter adalah untuk menjamin metode analisis yang digunakan mampu memberikan hasil
yang cermat dan handal serta dapat dipercaya. Parameter yang diuji dalam validasi meliputi
akurasi, presisi, linearitas, rentang, limit deteksi, limit kuantitasi, sepesifikasi, ketangguhan,
kekuatan, stabilitas, dan uji kesesuaian sistem.

Setelah itu dicari batas deteksi (LOD) dan batas kuantifikasi (LOQ). Batas deteksi adalah
titik di mana suatu nilai yang terukur lebih besar dari ketidakpastian yang terkait dengannya. Ini
adalah konsentrasi terendah dari analit dalam suatu sampel yang dapat dideteksi namun tidak
selalu diukur. Batas deteksi sering bingung dengan sensitivitas dari metode ini. Sensitivitas dari
metode analisis adalah kemampuan metode ini untuk membedakan perbedaan-perbedaan kecil
konsentrasi atau massa analit uji. Dalam istilah praktis, sensitivitas kemiringan kurva kalibrasi
yang diperoleh dengan merencanakan respons terhadap konsentrasi analit atau massa.
Pada kromatografi, batas deteksi adalah jumlah injeksi yang menghasilkan puncak
dengan ketinggian minimal dua atau tiga kali lebih tinggi tingkat kebisingan baseline. Selain itu
sinyal / kebisingan metode, yang ICH menjelaskan tiga metode lebih lanjut:
1.                  Inspeksi visual: Batas deteksi ditentukan oleh analisis sampel dengan konsentrasi
analit dan dikenal dengan penentuan tingkat minimum yang analit dapat dipercaya terdeteksi.
2.                  Standar deviasi respon berdasarkan deviasi standar dari kosong: Pengukuran
besarnya respons latar belakang analitis dilakukan dengan menganalisis jumlah sampel yang
tepat kosong dan menghitung standar deviasi tanggapan ini.
3.                  Standar deviasi respon berdasarkan kemiringan kurva kalibrasi: Sebuah kurva
kalibrasi tertentu dipelajari dengan menggunakan sampel yang mengandung analit dalam kisaran
batas deteksi. Deviasi standar residu dari garis regresi, atau standar deviasi dari y-perpotongan
garis-garis regresi, dapat digunakan sebagai standar deviasi.

Gambar 1. Batas deteksi dan batas kuantisasi melalui sinyal terhadap kebisingan
 Batas kuantifikasi (LOQ) adalah jumlah minimum yang disuntikkan menghasilkan
pengukuran kuantitatif dalam matriks target dengan presisi diterima dalam kromatografi,
biasanya membutuhkan ketinggian puncak 1-20 kali lebih tinggi dari dasar suara.
Jika diperlukan presisi metode di batas kuantisasi telah ditentukan, EURACHEM
(Gambar 2) pendekatan dapat digunakan. Sejumlah sampel dengan penurunan jumlah analit
adalah disuntikkan enam kali. RSD persen dihitung dari ketepatan diplot terhadap jumlah
analit. Jumlah yang sesuai dengan yang dibutuhkan presisi didefinisikan sebelumnya adalah
sama dengan batas kuantisasi.Adalah penting untuk tidak hanya menggunakan standar murni
untuk tes ini tetapi juga matriks runcing yang erat merupakan sampel yang tidak diketahui.
Untuk batas deteksi, para ICH merekomendasikan, di samping prosedur seperti yang
dijelaskan di atas, inspeksi visual dan deviasi standar respon dan kemiringan kurva kalibrasi.

Gambar 2. Batas kuantisasi dengan EURACHEM metode.

 Berdasarkan hasil perhitungan tersebut, didapat yaitu nilai LOD 0.8415 dan nilai LOQ
yaitu 2.8052. LOD merupakan konsentrasi analit terendah dalam sampel yang masih dapat
dideteksi meskipun tidak selalu dapat dikuantifikasi. Sedangkan nilai LOQ merupakan
konsentrasi analit terendah dalam sampel yang masih dapat ditentukan dengan presisi dan
akurasi yang dapat diterima pada kondisi operasional metode yang digunakan.

VIII.                Kesimpulan

LOD merupakan konsentrasi analit terendah dalam sampel yang masih dapat dideteksi
meskipun tidak selalu dapat dikuantifikasi. Sedangkan nilai LOQ merupakan konsentrasi analit
terendah dalam sampel yang masih dapat ditentukan. Nilai LOD yaitu 0.8415 dan nilai LOQ
yaitu 2.8052.

Read more: http://laporanakhirpraktikum.blogspot.com/2013/07/aa.html#ixzz311CGPSPV