PEMERIKSAAN PENYARING HEMOSTASIS

PERSIAPAN SAMPEL, BAHAN DAN

PERALATAN UNTUK TES FAKTOR KOAGULASI
Eva Ayu Maharani

Tujuan Pembelajaran Praktikum :

Setelah mengikuti praktikum ini, mahasiswa mampu :
1. Melakukan tahapan pra analitik persiapan hemostasis, yang meliputi : pengambilan
sampel, persiapan sampel, bahan dan alat.
2. Melakukan tahapan analitik pemeriksaan penyaring hemostasis, yaitu : PT, a-PTT,
TT, fibrinogen, plasma rekalsifikasi.
3. Melakukan tahapan paska analitik, yaitu menuliskan laporan hasil pemeriksaan
laboratorium.
4. Menerapkan K3 selama praktikum berlangsung.
5. Mampu melaksanakan IQC pada pemeriksaan penyaring hemostasis, yaitu : PT, a-
PTT, TT, fibrinogen, plasma rekalsifikasi.
6. Mampu melaksanakan verifikasi hasil pada pemeriksaan penyaring hemostasis, yaitu
: PT, a-PTT, TT, fibrinogen, plasma rekalsifikasi.

Pendahuluan
Hemostasis adalah mekanisme untuk menghentikan dan mencegah perdarahan. Proses ini
merupakan suatu interaksi kompleks antara pembuluh darah, trombosit dan protein/faktor
pembekuan darah. Ketiga unsur inilah yang dapat menghentikan perdarahan sekaligus
menjaga darah tetap mengalir di dalam pembuluh darah.
Pada proses hemostasis, terjadi tiga reaksi yaitu reaksi vaskuler berupa vasokonstriksi
pembuluh darah, reaksi seluler berupa pembentukan sumbat trombosit dan reaksi biokimiawi
yaitu pembentukan fibrin. Pemeriksaan hemostasis dilakukan untuk : skrining terhadap
adanya kelainan pembekuan darah, diagnosis kelainan perdarahan, dan untuk terapi
monitoring. Pemeriksaan hemostasis digolongkan atas pemeriksaan penyaring dan
pemeriksaan khusus. Pemeriksaan penyaring terdiri atas :
 Percobaan pembendungan
 Masa perdarahan dan pembekuan
 Hitung trombosit

Hemotologi II_ Dewi A & Eva Page 1

A.M.
  Masa protrombin plasma (Protrombin time, PT)
 Masa tromboplastin parsial teraktivasi (Activated partial thromboplatin time, a-PTT)
 Masa trombin (Thrombin time, TT)

Pada pemeriksaan hemostasis, untuk parameter PT, a-PTT, TT dan pemeriksaan faktor
pembekuan lainnya, yang harus diperhatikan adalah proses pengambilan sampel atau
sampling dan prosesing sampel.
 Sampling atau pengambilan darah lebih diutamakan dengan menggunakan vacutainer
sistem. Jika sampling menggunakan spuit, maka ukuran diameter jarum harus sesuai,
jangan terlalu kecil karena akan mempermudah terjadinya hemolisis. Ukuran jarum
yang disarankan adalah ukuran 20 – 21 G untuk dewasa, ukuran 21 – 23 G untuk
pasien bayi. Gunakan volume syringe yang sesuai untuk ukuran sampel yang akan
diambil.
 Pembuluh darah vena yang dipilih untuk lokasi pengambilan darah harus sesuai. Vena
harus cukup besar dan akses untuk pengambilan tidak sulit. Hal ini mencegah
terjadinya reposisi, sehingga tidak terjadi aktivasi pembekuan lebih dahulu dan
mencegah adanya bekuan/clot pada sampel darah. Diusahakan pembendungan vena
tidak terlalu lama. Setelah darah terisi di tabung, maka segera homogenisasi sebanyak
lima kali, jangan mengocok sampel terlalu kuat dan sering.
 Wadah atau tabung penampung darah dianjurkan untuk menggunakan tabung dari
plastik.
 Jenis antikoagulan yang digunakan untuk pemeriksaan hemostasis, umumnya adalah
natrium sitrat atau sodium sitrat konsentrasi 3,2 % atau 0,109 M. Pada tabung
vacutainer, jenis antikoagulan ini sudah tersedia dengan konsentrasi dan rasio dengan
darah yang sesuai. Rasio perbandingan antara antikoagulan Na-Sitrat dengan darah
adalah 1 bagian Na-Sitrat dengan 9 bagian darah. Perbandingan darah dengan
antikoagulan harus sesuai, jika tidak maka hasil pemeriksaan tidak sesuai.
 Setelah sampel darah didapat, homogenisasi segera sebanyak 5-6 kali. Darah sitrat
harus segera dipisahkan antara sel darah dengan plasma. Proses pemisahan sel darah
dilakukan dengan sentrifus. Plasma sitrat yang dibuat , umumnya adalah plasma
rendah trombosit, maka darah disentrifus selama 20 menit dengan kecepatan 3000
rpm atau 2000 g selama 10 menit pada suhu 18 – 250 C.
 Perhatikan adanya bekuan, ikterus, hemolisis dan lipemik pada sampel setelah selesai
sentrifus. Sampel yang ada bekuan dan atau hemolisis tidak boleh dilakukan
pemeriksaan.
 Pemeriksaan hemostasis sebaiknya segera dikerjakan, karena beberapa faktor
pembekuan bersifat labil. Proses pemisahan plasma dilakukan maksimal satu jam
setelah pengambilan darah. Idealnya setelah dilakukan pemisahan plasma, segera
dilakukan pemeriksaan. Jika pemeriksaan ditunda, maka pemeriksaan dilakukan
maksimal empat jam setelah pengambilan darah.
 Hindari penyimpanan sampel pada suhu 40C dalam jangka waktu lama, maksimal
waktu simpan 4 jam.
 Jika plasma sitrat hendak di simpan dalam jangka waktu lebih lama, maka plasma
disimpan pada suhu – 700 C. Penyimpanan pada suhu – 200 C dapat dilakukan dengan
masa simpan maksimal dua minggu. Plasma sitrat disimpan dalam plastik tertutup dan
dalam keadaan beku. Hindari disimpan dalam freezer dengan program autodefrost.
 Pada saat melakukan pemeriksaan dari plasma beku, maka plasma harus segera
dicairkan pada suhu 370 C di waterbath (umumnya menggunakan waktu 3 – 5 menit
untuk mencairkan 1 – 2 mL plasma) dan homogenisasi perlahan untuk melarutkan
kriopresipitat.
 Jika sampel hendak dirujuk ke laboratorium lain, maka pengiriman sampel berupa
plasma sitrat. Untuk pemeriksaan a-PTT, bahan yang dikirim adalah plasma sitrat
dalam tempat plastik bertutup dan diberi pendingin, tetapi untuk PT dan agregasi
trombosit jangan diberi pendingin karena suhu dingin dapat mengaktifkan F VII tetapi
menghambat agregasi trombosit.

Pada praktikum PT, a-PTT, TT dan Fibrinogen akan diberikan SOP/petunjuk kerja
berdasarkan kit insert reagensia yang digunakan.
Tugas praktikum berupa menerjemahkan SOP di lembar kerja yang sudah disediakan.
 Tes Penyaring Hemostasis (Faktor Koagulasi)
Pemeriksaan masa protrombin plasma / Protrombin time (PT)

Tujuan pemeriksaan :
Memanjangnya PT mengindikasikan kelainan dari faktor pembekuan darah I, II, V, VII,
dan X, baik kelainan didapat atupun kongenital. Pemeriksaan PT dapat digunakan untuk
monitoring terapi antikoagulan oral, berkurangnya aktivitas vitamin K. Pemeriksaan PT dapat
digunakan untuk melihat kemampuan faktor pembekuan darah ekstrinsik dan jalur bersama.

Prinsip pemeriksaan :
Mengukur lamanya waktu terbentuknya bekuan setelah plasma sitrat ditambahkan faktor
jaringan (tromboplastin) dan kalsium. Rekalsifikasi plasma dikarenakan adanya faktor jaringan,
menaktivasi faktor Xa, terbentuknya trombin dan akhirnya bekuan fibrin yang tidak larut.

Persiapan reagen :
Dikeluarkan reagen dan buffer dari dalam penyimpanan ,lalu reagen diencerkan dengan
buffer perbandingan 1:1 ,dihomogenkan ,diinkubasi terlebih dahulu pada suhu 37oC selama 30
menit sebelum digunakan.

Stabilitas reagen :
Penyimpanan pada suhu 2-8oC dengan tertutup rapat dan stabil sampai batas
kadaluarsa.dan tidak boleh dibekukan

Persiapan Alat :
1. Tourniquette
2. Spuit dan Neddle
3. Tabung Na.Citrat 3,2 o/0
4. Sentrifuge dan tabungnya.
5. Mikropipet volume 100 uL dan 200 uL
6. Tabung reaksi plastik berukuran 10 x 200 mm
7. Waterbath 37 oC
8. Stopwatch
9. Tissue dan waste

Sampel : Plasma sitrat rendah trombosit

Persiapan sampel :
1. Sampel darah sitrat disentrifus dengan kecepatan 3000 rpm selama 20 menit.
2. Plasma sitrat dipisahkan ke tabung reaksi.

Cara kerja :
 Disiapkan reagen yang diperlukan
 Dipipet reagen 200 mikroliter dipindahkan ke tabung reaksi plastik dan diinkubasi
dengan suhu 370C selama 30 menit.
 Dipipet sampel sebanyak 100 mikroliter dan dimasukan ke dalam tabung reaksi plastik
yang berbeda dan diinkubasi dengan suhu 370C selama 30 menit.
 Ditambahkan reagen sebanyak 200 mikroliter dan segera nyalakan stopwatch
 Dihomogenkan sampel dan reagen di dalam waterbath
 Dilihat sudah terbentuk bekuan atau belum,jika sudah terbentuk matikan stopwatch,lalu
dicatat hasilnya

Nilai Normal : 10- 14 detik.

Hasil pemeriksaan PT dapat dilaporkan dalam bentuk detik, %, ratio dan INR. Untuk
menentukan hasil selain dalam bentu detik, maka hasil pemeriksaan dapat dilihat dari tabel
yang disediakan oleh Human (sesuai kit insert reagensia yang digunakanan).
Identitas Pasien :

Hasil

Kesimpulan :

Diskusi :

 Sebutkan dan jelaskan jenis pelaporan hasil PT dan fungsinya.

 Sebutkan faktor-faktor kesalahan yang dapat terjadi pada pemeriksaan PT (tahap pra
analitik, analitik sampai paska analitik).
 Jelaskan prinsip dasar pemeriksaan PT pada alat alat otomatisasi.
 Sebutkan jenis penyakit atau kondisi yang dapat menyebabkan hasil PT di luar nilai
normal.

Pembahasan :
 Tes Penyaring Hemostasis (Faktor Koagulasi)
Pemeriksaan tromboplastin parsial teraktivasi /
Activated Partial Thromboplatin Time (a-PTT)

Tujuan Pemeriksaan
Tes aPTT merupakan tes sederhana untuk mendeteksi defisiensi faktor pembekuan pada
plasma, kecuali faktor VII. aPTT dapat digunakan untuk mendeteksi defisiensi faktor XII, XI,
X, IX,VII, V, II, I dan prekalikrein.

Prinsip pemeriksaan :
Tes aPTT dilakukan dengan menambahkan reagensia aPTT yang mengandung aktivator
plasma dan phospolipid ke dalam sampel. Phospholipid berfungsi sebagai pengganti trombosit.
Campuran larutan kemudian diinkubasi, lalu dikalsifikasi dengan calsium chloride. Waktu
terbentuknya bekuan dicatat sebagai aPTT.

Persiapan reagen :
1. Reagensia 1 aPTT Human (berisi rabbit brain cephalin, allegic acid, buffer dan sodium
acide)
2. Reagensia 2 aPTT Human (berisi CaCl2 0,02 mol/L)
Reagen 2 dihangatkan terlebih dahulu pada suhu 37o C dan dihomogenkan
dahulu sebelum digunakan

Stabilitas reagen :
Stabil pada suhu 2-8oC selama 14 hari bila telah dibuka atau digunakan,Tidak boleh
dibekukan.

Persiapan Alat :
1. Sentrifuge
2. Water bath
3. Tabung reaksi plastik
4. Tabung Na.citrat 3,2o/o
5. Mikropipet 50 μL dan yellow tip
6. BdD vacutainer dan holder
7. Rak tabung
8. Stopwatch

Sampel : Plasma sitrat rendah trombosit

Persiapan sampel :
1. Masukkan 0,5 ml Na. Citrat 3,8 % ke dalam tabung sentrifuge.
2. Darah vena 4,5 mL masukkan ke dalam tabung yang berisi Na Citrat lalu homogenkan
dengan adekuat. (perbandingan sampel dan ragen 9:1)
3. Putar pada sentrifuge selama 20 menit pada 3000 rpm
4. Pisahkan plasma yang terjadi, masukkan kedalam tabung dan kalau plasma tidak segera
diperiksa masukkan kedalam lemari es.
 Sampel darah sitrat disentrifus dengan kecepatan 3000 rpm selama 20 menit.
 Plasma sitrat dipisahkan ke tabung reaksi.

Cara kerja :
1. Dipipet reagen 2 ke dalam tabung reaksi,lalu dihangatkan terlebih dahulu (prewarm).
2. Dipipet reagen 1 dan sampel masing-masing sebanyak 50 mikroliter kedalam tabung reaksi lalu
homogenkan dan inkubasi pada suhu 370C selama 3 menit.
3. Ditambahkan 50 mikroliter reagen 2 bersamaan dengan dinyalaknnya stopwatch .
4. Dilakukan homogenisasi di dalam waterbath,dilihat sudah terbentuk bekuan atau belum,jika
sudah terbentuk matikan stopwatch,lalu dicatat hasilnya
Nilai Normal : 11-27,9 detik

Identitas Pasien :

Hasil

Pembahasan :

 Sebutkan faktor - faktor kesalahan yang dapat terjadi pada pemeriksaan a-PTT (tahap
pra analitik, analitik sampai paska analitik).
 Jelaskan prinsip dasar pemeriksaan a-PTT pada alat alat otomatisasi.
 Sebutkan jenis penyakit atau kondisi yang dapat menyebabkan hasil a-PTT di luar
nilai normal.

Kesimpulan :
 TES PENYARING HEMOSTASIS (FAKTOR KOAGULASI)
PEMERIKSAAN MASA REKALSIFIKASI

Prinsip pemeriksaan :
Pada plasma sitrat rendah trombosit yang tidak terdapat ion Ca, ditambahkan sejumlah CaCl2.
Lamanya waktu untuk menyusun fibrin adalah masa rekalsifikasi.

Persiapan Alat :
 Mikropipet 100 µL
 Penangas air / waterbath
 Stopwatch
 Tabung reaksi
 Tissu

Persiapan Reagensia :
 CaCl2 0,025 M
 NaCl 0,85 %

Sampel
Plasma sitrat rendah trombosit

Persiapan sampel :
 Sampel darah sitrat disentrifus dengan kecepatan 3000 rpm selama 20 menit.
 Plasma sitrat dipisahkan ke tabung reaksi.

Cara Kerja :
 Tabung - tabung reaksi yang berisi larutan CaCl2, larutan NaCl dan plasma sitrat,
masing-masing diinkubasi dalam penangas air suhu 37 0 C terlebih dahulu supaya
larutan mencapai suhu tersebut.
 Ke dalam tabung reaksi dimasukkan 100 µL NaCl 0,85 % dan 100 µL plasma sitrat.
Campuran tersebut dihomogenisasi dan diinkubasi sebentar.
 Ke dalam campuran tersebut dimasukkan 100 µL CaCl2 bersamaan dengan dijalankan
stopwatch dan dihomogenisasi.
  Campuran tersebut diinkubasi selama 90 detik pertama.
 Setelah 90 detik, tabung reaksi diangkat dan diamati ada tidaknya bekuan atau clot.
Jika belum terbentuk bekuan, maka tabung diinkubasi di dalam penangas air selama
beberapa detik dan diamati kembali.
 Waktu di stopwatch dihentikan pada saat terjadinya bekuan, dan waktu tersebut
dicatat sebagai masa rekalsifikasi.

FORM CHECKLIST PRAKTIKUM PLASMA REKALSIFIKASI

No Tahap pemeriksaan Kegiatan Dilakukan
1 Pra analitik Persiapan petugas :
Memakai APD (jas lab, handskun)
Pengambilan sampel hemostasis :
Jenis sampel : ………
Volume : ……….
Kondisi sampel : ………..
Persiapan sampel :
 Sentrifus sampel darah sitrat
dengan kecepatan 3000 rpm
selama 20 menit.
 Pisahkan plasma sitrat ke
tabung reaksi.

Persiapan alat :
 Mikropipet 100 µL
 Penangas air / waterbath
 Stopwatch
 Tabung reaksi

2 Analitik
 Tissu
 Wadah limbah
Inkubasi tabung - tabung reaksi
yang berisi larutan CaCl2, larutan
NaCl dan plasma sitrat dalam
penangas air suhu 370 C.
 Memasukkan 100 µL NaCl 0,85 %
dan 100 µL plasma sitrat ke dalam
tabung reaksi.

Homogenisasi dan inkubasi

campuran tersebut sebentar.

Masukkan 100 µL CaCl2 ke dalam

campuran tersebut bersamaan
jalankan stopwatch dan
homogenisasi.

Inkubasi campuran tersebut selama

90 detik pertama.

Setelah 90 detik, amati ada

tidaknya bekuan atau clot.

Hentikan waktu di stopwatch pada

saat terjadinya bekuan, dan catat
waktu tersebut sebagai masa
rekalsifikasi.

3 Pasca analitik Menuliskan laporan hasil

pemeriksaan dengan benar
K3 :
Desinfeksi meja kerja

Membersihkan dan mencuci

peralatan kerja

Membuang sampel di tempat

limbah infeksius

Melepas Alat Pelindung Diri

(handskun, jas lab)
Nilai Normal : 90 – 250 detik

Identitas Pasien :

Hasil Pemeriksaan :

Pembahasan :

 Jelaskan faktor kesalahan yang dapat terjadi pada tahap pra analitik, analitik sampai
paska analitik yang dapat mempengaruhi hasil pemeriksaan PRT.
 Sebutkan perbedaan antara pemeriksaan PRT dengan a-PTT.
Kesimpulan :
 TES PENYARING HEMOSTASIS (FAKTOR KOAGULASI)
PEMERIKSAAN FIBRINOGEN

Tujuan Pemeriksaan :
Untuk pemantauan dan prognosis berbagai gangguan hemoragik. Kadar fibrinogen yang
tinggi dianggap sebagai faktor resiko penyakit kardiovaskuler.
Prinsip pemeriksaan :
Hemostat fibrinogen ddasarkan pada metode paling umum. Trombin dalam jumlah yang
optimal dtambahkan kedalam sampel plasma yang telah dilarutkan waktu pembekuan
yang diukur berbanding terbaik dengan fibrinogen dalam spesimen.

Persiapan reagen :
Diencerkan ROT1 dengan 2ml CAL dengan 1 ml air suling. Simpan reagen selama 30
menit pada suhu 18-25 oC, dicampur dengan perlahan. Hindari guncangan pada reagen.

Stabilitas reagen :
Simpan reagen untuk 30 menit pada suhu 18-25 oC. Stabil 3 hari pada suhu 22 oC, 5 hari
pada suhu 15 oC, dan 7 hari pada suhu 2-8 oC. Jangan bekukan CAL yang direkrontuksi
stabil selama 4jam pada suhu 22 oC. BUF siap digunakan, simpan pada suhu 2-8 oC.

Persiapan Alat :

 Humaclot junior
 Kuvet
 Yellow tip
 Tissu dan waste
 Mikropipet 50l dan 100 l
 Plasma rendah trombosit
 Reagen fibrinogen
Sampel :

Plasma citrat

Persiapan sampel :
 Dicentrifuge sampel darah selama 20 menit dengan kecepatan 3000 rpm
 Plasma yang terbentuk segera dipindahkan dalam tabung reaksi plastik

Cara kerja :

 Dilakukan pengenceran pada sampel dengan larutan buffer perbandingan 1:20

 Ditutup parafilm lalu homogenkan
 Dipipet 100 l sampel tersebut ke dalam kuvet, inkubasi 3 menit pada suhu 37 oC
 Ditambahkan 50 l reagen ( sebelum ditambahkan, tekan terlebih dahulu tombol merah, bila
terdapat bunyi “beep” segera tambahkan atau ketika tulisan dalam monitor “active ‘ reagen
segera ditambahkan
 Tunggu sampai keluar hasil
Nilai Normal
200-400 mg/dl

Identitas Pasien :

Hasil Pemeriksaan :

Pembahasan :

 Sebutkan faktor - faktor kesalahan yang dapat terjadi pada pemeriksaan Fibrinogen
(tahap pra analitik, analitik sampai paska analitik).
 Jelaskan fungsi kurva kalibrasi yang digunakan pada pemeriksaan fibrinogen.
 Jelaskan metode dan prinsip dasar pemeriksaan fibrinogen selain yang anda kerjakan.
 Sebutkan jenis penyakit atau kondisi yang dapat menyebabkan hasil fibrinogen di luar
nilai normal.

Kesimpulan :
 TES PENYARING HEMOSTASIS (FAKTOR KOAGULASI)
PEMERIKSAAN MASA TROMBIN / TROMBIN TIME (TT)

Tujuan Pemeriksaan :
Untuk mendeteksi adanya kelainan yag mengganggu terbentuknya fibrin dari fibrinogen,
dan juga untuk monitoring terapi heparin.

Prinsip pemeriksaan :
Trombin time adalah pemeriksaan penyaring sederhana untuk kondisi yang mengganggu
konversi fibrinogen menjadi firbin. Trombin ditambahkan ke dalam plasma murni dan
terbentuk bekuan lalu dicatat waktunya.

Persiapan reagen :
Rekayasa ulang 3 ml air suling, simpan reagen selama 30 menit pada suhu 18-25 oC,
dicampurkan perlahan, tidak boleh dikocok dan hindari kontak dengan reagen.

Stabilitas reagen :
Simpan pada suhu 2-8o C. Setelah diencerkan, reagen stabl selama 3 hari pada suhu 22
o
C, 5 hari pada suhu 15 oC, dan 7 hari pada suhu dalam botol gelas dan jangan
dibekukan.

Persiapan Alat :

 Mikropipet adjustable 20-200 l

 Yellow tip
 Tissu
 Tabung reaksi plastik
 Rak tabung
 Waterbath
 Stopwatch
 Bd vacutainer
 Holder
 Tabung Na Citrat
 Waste
 centrifuge
Sampel :
Plasma citrat

Persiapan sampel :
 spesimen darah dicentifuge selama 20 menit dengan kecepatan 3000 rpm
 plasma yang terbentuk segera dipindahkan daam tabung reaksi plastik

Cara kerja :

 tabung reaksi dihangatkan terlebih dahulu

 dimasukkan 50 l sampel
 diinkubasi selama 3 menit dalam suhu 37 o C
 ditambahkan 50 l reagen Tt, nyalakan stopwatch pada saat penambahan reagen
 dihomogenkan dalam waterbath, dilihat adanya bekuan seperti gel agar
 bila terbentuk bekuan matikan stopwatch
Nilai Normal
< 30 detik

Identitas Pasien :

Hasil Pemeriksaan :

Pembahasan :

 Sebutkan faktor - faktor kesalahan yang dapat terjadi pada pemeriksaan TT (tahap pra
analitik, analitik sampai paska analitik).
 Sebutkan jenis penyakit atau kondisi yang dapat menyebabkan hasil trombin time di
luar nilai normal.

Kesimpulan :
 Daftar Pustaka

1. DeLoughery TG. Tests of hemostasis and thrombosis.Switzerland: Springer Internatonal

Publishing, 2015.
2. Gandasoebrata R. Penuntun laboratorium klinik. Jakarta: Dian rakyat; 1999.
3. University of Washington department of laboratory medicine reference laboratory
service: Handbook of diagnostic hemostasis and thrombosis tests, c2005 (cited 2016 Aug
11). Available from: https://depts.washington.edu/hemostasis.pdf.
4. Mackie I, Cooper P, Lawrie A, Kitchen S, Gray E, Laffan M, Cooper P. Guidelines on the
laboratory aspect of assays used in haemostasis and thrombosis (serial online). 2012
(cited 2016 Aug 11). Available from: International Journal of Laboratory Hematology.
5. Setiabudy R.D, Oesman F, Tambunan K.L, S. Marcel, S. Sjafrizal, dkk. Hemostasis dan
trombosis Ln: Setiabudy R.D, editor. Edisi 5. Jakarta: FKUI; 2012.