Ribeirão Preto
2010
INTRODUÇÃO
OBJETIVO
O presente estudo tem por objetivo, testar parâmetros de toxicidade ao uso do Metil
Jasmonato no tratamento do câncer. Estudar os mecanismos envolvidos no processo de
inibição da angiogênese tumoral, bem como os fatores quimiopreventivos ao
desenvolvimento de células neoplásicas.
MATERIAIS E MÉTODOS
ANIMAIS
CAMUNDONGOS
Camundongos sob condições de controle livre de patógeno de linhagem Balb/c
padrão (24-28g), e de linhagem C57BL/6J padrão (24-28g) serão fornecidos pela Faculdade
de Medicina da Universidade de São Paulo. Sendo mantidos sob ciclos de luz/escuridão de
12/12h em temperatura controlada (23 ± 1 oC). Serão acondicionados em grupos de cinco
animais por caixa, totalizando 15 camundongos Balb/c e 45 camundongos C57BL/6J
recebendo alimentação na forma de ração padrão e água de torneira ad libitum. Todos os
animais serão mantidos segundo as normas da Comissão de Ética em Experimentação
Animal da FMRP-USP.
METIL JASMONATO
O Metil Jasmonato ou metil, composto de origem vegetal, (1R, 2R)-3-Oxo-2-(2Z)-
2-pentenil-cyclopentanoacetato (metildihidroxijasmonato 96% Sigma Aldrich – Missouri –
USA), fórmula: C13H22O3 e peso molecular de 226.31, será diluído para uso em n-hexano ou
etanol absoluto (Merck) e analisado por cromatografia gasosa acoplada a espectrômetro de
massa (CG-MS), como descrito (MUELLER et al., 2006). Amostras de material biológico
associado a MeJa serão extraídas com n-hexano P.A., na proporção de 1:10 v/v. A extração
líquido-líquido será conduzida sob agitação em vórtex Phoenix AP56 durante 1min, depois
a amostra será centrifugada por 5 min a 10.000 rpm em uma microcentrífuga. A fração
orgânica contendo o MeJ será coletada e seca sob fluxo de nitrogênio, o extrato seco será
redissolvido em etanol absoluto e analisado por cromatografia gasosa acoplada à
espectrometria de massa (CG-MS). O espectro obtido será comparado com relatos de
literatura (Schmelz et al., 2003; Mueller et al, 2006). O MeJa, 3 mg/mL será incorporado à
nanopartículas lipídicas a um volume de 500 µL de suspensão de LDE (40 mg de
fosfatidilcolina, 20 mg de oleato de colesterol, 1mg de trioleína e 0,5 mg de colesterol secos
a vácuo, por 16h, a 4ºC). A mistura será agitada à temperatura ambiente por 15 minutos, e
incubada a 4ºC por 72h. A preparação será então dialisada duas vezes contra 200 ml
tampão estéril. A emulsão dialisada será analisada por CG-MS, para determinação da
quantidade de metiljasmonato remanescente na preparação.
DESENHO EXPERIMENTAL
TESTE DO MICRONÚCLEO
Para este teste, serão distribuídos três grupos compostos por cinco animais cada
(camundongos Balb/c), machos, pesando entre 24 e 28g. O MeJa será aplicado via
intraperitoneal, sendo 100µl diariamente usando-se seringa descartável com agulha para
insulina. O grupo I receberá o MeJa a 10%. O grupo II a 100% (puro) e o grupo III
avaliado como grupo controle, recebendo apenas veículo (PBS). Será coletado sangue
periférico (veia caudal) e confeccionado duas lâminas de esfregaço de cada animal para
analise do micronúcleo, nos intervalos de 24 e 48 horas, 7 e 28 dias. As lâminas serão
fixadas em metanol por 5 minutos e coradas com Giemsa após 24 horas da fixação. Para
cada lâmina serão contadas 1000 reticulócitos, totalizando 2000 células por animal, em
objetiva de imersão, e a freqüência de células micronucleadas deverá ser registrada.
TESTE DO COMETA
O tratamento dos animais seguirá o mesmo protocolo realizado no teste do
micronúcleo descrito acima, seguindo mesmos animais, mesma dosagem e mesmo período
de tratamento e intervalos de coleta. O sangue periférico será coletado pela veia caudal. As
amostras de sangue serão submetidas ao ensaio do cometa, no qual os eritrócitos serão
lisados, seu DNA relaxado e submetido à eletroforese. O material será fixado e corado com
Brometo de Etídeo. Para obtenção do escore de acordo com o dano encontrado, serão
contadas 100 células por animal em microscópio de fluorescência.
REFERENCIAS:
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