DEPARTEMEN PATOLOGI KLINIK Blok GEH — Patologi Klinik BAHAN BACAAN Bagian IV FOTOMETER OLEH dr. Ibrahim Abd. Samad Sp.PK_ (Dosen Pengampu m.k GEH PK)t. FOTOMETER PENDAHULUAN Fotometri (foto = cahaya ; metri = pengukuran ) adalah suata metode peng intensitas cahaya atau kekuatan cahaya. Metode ini banyak digunakan untuk meneats Kader suatu bahan dalam larutan berwama. Penentuan konsentrasi baban dalam larutan Yang tidak diketahui dilakukan dengan membandingkan dengan konsentrasi bahan dalam Tarutan standar, Di laboratorium blink metoda ini banyak digunakan unfuk menentukan kadar suatu bahan didalam cairan tubub, sepesti darah,serum dan urin. |S Hakumchukum dalam teori Fisika dan Kimia menjadi dasar pembuatan dan juga menjadi dasar perhitungan hasil pengukuran dari alat-alat ini. - ‘Kemajuan dibidang elektronika sangat berpengaruh pada perkembangap alat-alat ini -yang rampak makin sempumna. Otomatisasi_dan Koraputerisasi alot ini sudah menjadi mode setiap pabrik pembuatan alat-alat laboratoriiim. ae 4 e = Sebelum pembahasan febih mendalam tentang fotometri dan fotemeter ada baiknya kita mengetahui sifat fisika dari cahaya. SIFAT CAHAYA Sinar atau cahaya adalah suatu gelornbang elektromagnetik: yang bersifat elektrik dan magnetik. Karakteristik atau sifat spesifik dari cahaya ialah : '* 1" Mempunyai panjang gelombang, yaitu jarak dari puncak gelombang yang satu ke puncak gelombang berikutnya, Panjang gelombang adalah faktor yang menentukan warna, 2. Mempunyai amplitudo atau tinggi gelombang yang menentukan intensitas cahaya Gambar |: cahava sebagat gelombang elektromagaetis ' Sinar yang mengelilingi kita adalah suatu campuran sinar yang parjang gelombang keseluruhan (sinar polikromatis) terlat berwarna putih dengan menggunakan peralatan optik tertentu, sinar putih dapat dipancarkan menjadi sinar ~ sinar yang berwarma Sesuai dengan panjang yelombang tertentu. mie [See su 4 ik Radio rg tt Jom 1pm Timm Im Thm 7 ww 10” 107 0 1 Gambur 2. Spektcun cathy.”a | Mata manusia dapat melihat gelombang elektromagnetik dengan panjang gelombang, 380 dan 780 nm. Sellangkan panjang gelombang pendek (ultra violet) dan panjang gelombang infra merah (IR) hanya dengan mata optik % Tabel 1. karakteristik dan sinar UV, Infrared, Sinar nyaia 3 Panjang gelombang Sinan Warne 380 am Ulveaviolet Tidak nyata ¢ | 380 nm - 440.00 ‘Sinar nyata Violet XN 4440 nm - $00 nm Sinarnyata 7 | Birw : 500 nm ~ $80 act ‘Sinac nyata Hijau a 580 nm - 600 am Sinar ayata Kuning ; | £600 nm - 620 am Sinar nyate Orange 4 | 620 nm-750 am ~ ~~ | Sinar nyata >| Merah . x tte 750 nm — 2000 nm Infrared Tidak nyata Sina Dan Zat Warna | Sinar dapat dibedakan atas :* : ¢ 1. Sinar monokromatis, yaitu sinar dengan satu panjang gelombang. 2 Sinar polikromatis, yaitu sinar dengan beberapa panjeng gelombang Wamna adalah spesifik (Khas) bagi suatu zat dan merupakan sifat yang khas pula bagi zat itu Warna bérhubungan dengan struktur elektron dari materi yang terjadi oleh Karena adanya interaksi antara elektron dan sinar. Sruktur kimia setiap zat itu tertentu, maka zat tersebut mengabsorpsi sinar pada daerah panjang gelombang tertentu pula, dan akan menghasilkan suatu spektrum absorpsi yang * Khas.” Apabila absorpsi sinar terjadi pada daerah Ultra violet dan Infra merah, maka arti fain bagi manusia tidak Lerwarna. Sebaliknya apabila terjadi dalam Keseluruhan daerah nyata, maka zat tersebut terlihat berwarna abu-abu sampai hitam, tergantung dari kekuatan absorbsinya, Tetapi apabila dari seluruh spektrum nyata hanya sinar dengan panjang gelombang tertentu yang terabsopsi (pita absorpsi), maka zat yang bersangkutan akan menunjukkan suatu wama yang disebut Komplimeter terhadap panjang gelombang dari absorpsi maksimal, * Tabel 2. Colors and complementary colors of the visible spectrum. § 1 Wavelength (nm) | Color Absorbed Complementary cofor ! 350 - 430 | Violet ~ Yellow - Blue \ | 430-475 | Blue Yellow i 475 - 498 | Green - Blue Orange i 495-505 | Glue -Green Red ] i $05 - $85 | Green | Purple ! $75, Yellow - Green i Violet 600 ‘Yellow » Blue = 650 Orange ‘Green - Blue Res ___ Blue Green _a IL.SPEKTRUM ABSORBSI Spektrum absortisi suatu zat.teryantung dari stcuktur molekuinya. Oleh karena itu S tu zat dlidentifikasi dart spektrunn-absorpsinyaa (Kuaiitati). Lebih tinggi konsenirasi dati zat yang mengabsorpsi, maka lebih besar intensitas wana dari larutan dan lebih banyak pula sinar yang terabsorpsi. Untuk dapat menentukan onsentrasi dari zat secara kuantitati maka diukur absorpsi sinar yang discbabkan oleh zat tersebut. Untuk pengukuran digunakan sinar dengan panjang gelombang ebsorbsi terkuat dan paling spesifik.”” ~ Dalam contoh di atas, larutan yang bérwama merah mengabsorpsi maksimal pada doerah panjang gelombang hijau, oleh karena itu untuk pengukuran digunakan sinar dengan panjang gelombang antara 500-580 nm. Spektrum absorpsi suatiyz2t didapatsan dengan cara apabila absobsi zat tersebut dikur dengan panjang gelombang dari pendek Ke Panjang, 3 ; cS NADH ? . mo 280-320 360400 Gambar 3. Spektrum absorpsi dari NAD dan NADH. IP PENGUKURAN SINAR Molekul dari suatu larutan yang diukur mengabsorpsi sebagian dari sinar yang masuk, Absorpsi tersebut tidak dapat diukur secara langsung, tetapi yang diuknr adalah imensitas sinar yang masuk dan intensitas sinar yang tembus atau yang tidak diabsorpsi a . ! lo Transmitans (T) adalah jumlah sinar yang diteruskan, trasmitan dinyatakan dalam essen Katena merupaken angka perbandingan (rasio) antara sinar yang diteruskan dan sinar yang dijatuhkan. ‘Teansmitan | atau 100% untuk bahan yang meneruskan seluruh sinar yang jatuh (bahan tidak menyerap sina seperti aquadest, udara)Transmitan 0 atau 0% untuk bahan yang tidak tembus sinar. * Gambar 4, Perbandingane dart intensitas sinar yang tems (1) dan yang masuk ea} dinamakait transmitan (1) atau daya tembus =Gambar di bawah ini menunjukkan pengukuran dari suatu zat dengan konsenteasi yang sama dalam kuvet yang diameter yang sama oon 0,903 a Gambar 5 : Proses pelemahan sinar melalui larutan berwarna.* Dalam lapisan-lapisan tersebut, Intensitas sinat berkurang sebanyak prosentase yang sama dari sinar yang masuk. Dengan demikian terdapat suatu ketergantungan logaritma yang didefenisikan sebagai absorbans atau ekstensi Absorbans = A=-log T= log? =2= tos 2 ‘Absorban adalah suatu ukuran yang tidak berdimensi atau tidak mempunyai satuan tertentu dan hanya disebut kesatuan absozban atau unit absorban. Absorban berkisat 0 dan c» (tidak terhingea). Absorban 0 untuk bahan yang tidak menyerap sinar atau bahan yang dilalui semua sinar yang jatuh, misalnya aquades atau udara. Absorban « (tidak terhingga) untuk bahan yang menyerap sinar atau bahan yang tidak tembus sinar, misalnya benda padat. Apabila dilaksanakan suatu pengukuran dengan panjang gelombang tertentu (sinar monokromatis), maka terjadi suatu hubungan langsung atau proporsional antara absorban daa konsentrasi iebal larutan (diameter kuvet), Hukum Lambert ~ Jika sinar monokromatik dijatuhkan pada suatu larutan bahan, dan jika kadar bahan meningkat secara Linier (lurus), sinar yang diteruskan akan berkurang (menurun) secara logaritmik. - Jumlah sinar monokromatik yang diserap oleh suatu bahan dalam larutan berbanding lurus dengan tebal larutan yang ditembus sinar. oI - Hukum Beer Jushlah sinar monokromatik yang diserap oleh suatu bahaii dalam farutan berbanding lurus dengan kadarnya. >1 A= lag (lambert = ) Log Log ly - Log 7 =Log 100 - Log t 2-Logt Konsentrasi ‘Sinar Monokromatis Absorban. “tT Gambar 6 : Hubungan antara Al %T = Transmitas = + x100% ty + f= 3 1 aehs 0,25 0,125 0,06 10 05 10 31 Y. PRINSIP FOTOMETER ‘Alat untuk: pengukuran abso f<—_—— Ba Surber sinar ornk On T Daafeagn Filter Jevenahromaions Gambar ~ 56 15 87 BAGIAN EKTROLIK a . Absorban} i %T Konsentrasi bsorbans dan Ttransmitans(%), Pe rsi sinar dalam larutan dinamakan fotometer. AGIAN = ————-H1 Ww Se ELEKTRONIK pny Ki [pny ieee Mag pesbacar cre “Tahap alos se Jr oo8 ‘Amplifier (Logaritmis) Siete pemibacean Bentuk dasur fitometer* digitatKomponen dasar fotometer 11. Sumber sinar ‘Sumber sinar yang memancarkan spektrum kontinyu a. Lampu tungsten (lampu wolfram, lampu pijar) Lampu ini dapat memencackan sinac dengan panjang gelombang yang tidak terputus-putus yang cukup lebar mulai dari sinar ultraviolet sampai inframerah.Tidak bisa digunakan dibawah panjang gelombgog 360 mm. Mempunyai /yetime yang panjang (aniara 2000 sid 5000 jam) dba: lain. 4 b. Lampu Hidrogen dan deuterium ‘ ~ . Lampu ini dipakai.untuk penentuan pada daerah ultraviolet. Menghasitkan cahaya dengan panjang gelombang yang tidak té:putus‘antara 200 nm sid 375m ~ 2. Sumber sinar yang memancarkan spekrum garis berupa merkuri dan xenon Lampu ini mempunyai pancaran sinar dengan panjang gelombang yang terpulus-putus Hal ini menguntungkan kacena panjang gelombang dapat dipancarkan terpisah sempuma schingga mudah untuk mendapatkan sinar monokromatis dengan berkas yang sempit. Kerugiannya tidak praktis karena hanya dapat digunakan dengan panjang gelombang tertentu IL Monokromator Merupakan peralatan untuk mengisolasi energ/sinar dari suatu sumber sinar sehingea menghasilkan cahaya yang monokromatis, Mutu monokromator ditentukan oleh Kemampuannya menghasilkan sinar monokromatik dengan berkas (bandpass, band widi lt) yang sempit.'? ck, a-~ Panjang gelombane maksimal 450 nm e ~ 80% = Trasmitans puncak 80 10 60 a Bandoass (20 nm 40 ‘ 30 ND 400-420, 440 460,480 Panjang velombans (nm) Gambar 8, Bandpass Bandpass atau bandwidth adalah rentang panjang gelombang sinar monokromatik yang dihasilkan monokromator, antara dua panjang gelombang yang mengapit panjal gelombang nominal, dimana transmitansnya setengah dari transmitans punsak Transmitans puncak adalah transmitans pada panjang gelombane nominal, vaitu paniang gelombang yang dipilDikenal dua _macam monokromator yaitu filter dan spe! menggunakan filter sebagai monokromator disebut filterfotometer dan yang menggunakan spesktroskop disebut spektrofotometer. '? op. F yang, Filter Filter atau saringan sinar dapat dibuat dari gelas berwama atau gelatin beAvama yang dijepit diantars dua lempeng gs ini hekerja dengan cara menyerap sinar- sinar yang tidak dipilih. Untuk mendapatkan sinar moniokromatik yang diinginkan kagang- kadang perlu menempel dua filter (cut off ilter) menjadi satu \ Filter Interferens - 4 * > Filter ini dibuat dengan cara menjepit suatu lempeng transparans, mempunyai indeks bias rendah dan tidak mengalirkan listrik, diantara dua perak yang semi transparan Tebal lempeng adalah separuh dari panjang gelombang cahaya yang akan diteruskan. Bila Panjang geiombang cahaya sesuai (dua kali tebal lempeng) maka cahaya akan saling menguatkan (consiructive interference). Sedang cahaya dengan panjang gelombang yang tidak sesuai akan saling memusnakan (destructive interference). Filter Interferens mengeluarkan bandpass antara 10-17 ~ Filter Multilayer Interferens Merupakan penyempumaan dari filter interferens dengan cara melipatgandakan lapisan, Filter ini mengeluarkan bandpass 8 nm. |? Spektroskop Prisma dan kisi-kisi adalah bahan dasar dari spektroskop yang merupakan alat dipakai untuk menguraikan cahaya polikromasi (sinar putih) menjadi komponen dengan panjang gelombang yang tertentu.atau wama-warna.” ; Bila cahaya putih dijatuhkan pada prisma, maka cahaya tersebut akan direfleksikan olch prisma membentuk spektrum. Disini terjadi reftaksi (pematahan cahaya) dimana panjang gelombang yang lebih pendek akan dipatahkan lebih banyak dari pada yang panjang Bagian spektrum yang dihasilkan difokuskan ke celah keluar (/:xi sli) schingga mendapatkan sinar monokzomati 20- Coking Eniranee sit ons Gambar 9: PrismaDiffraction grating) dibuat dengan memberi lubang atau menggores lempeng logam secara mema Dalam 1 inchi lempeng > 1000 - 10000 goresan. Transmitance Grating Jika kisickisi dibuat dengan memberi lubang pada lempeng logam, dan penguraian sinar terjadi sesudah penembusan. ‘ Reflectance Grating ‘ Bila ki dibuat dengan goresan dan permukaan dilapisi perak atau alumiiium maka spectrum cahaya akan direfleksikan dan penguraiannya terjadi_setelsh” pemantulan, maka habitu diserbut reflectance grating. Ini lebih disukat oleh katena ‘energi cahaya tidak berkurang. ““* | Ted order spectrum Second order spectrum First order spectrum Grating Normal Reversed spectrum White Light Entering groting, Gambar 10 : Transmitance Grating UL Kuvet ‘Merupakan tabung tempat sempel yang akan ditentukan kadamys. Kuvetperlu penanganan yang baik, harus transparan, bers, tidak ada goresan dan bebas kontaminasi Pembersihan kuvet harus ditakukan dengan kertas lensa, tissue atau kertas toilet Simpaniah kuvet pada tempat yang Kering, jangan membersikan kuvet dengan asam kromik dan; gunakan deterjen yang baik mutunya. Bentuk kuvet dua macam ada yang bundar dan persegi. Zaman sekarang digunakan kuvet persegs. Kebanyakan diameter dalamnya 1 em. Dalam Keadaan (ertentu, misalny Fonsentrasi zat yang sangat rendah atau koefisien ekstensi molar yang rendah pengukuran dilaksanakan dengan diameter dalam 2 em.**? TV. Detektor sinar 1 Merupakan alat untuk mengubah cahaya menjadi sinyal listrik, Dikenal 4 macam :‘* 1. Foto Voltaic Cell Logam dilapisi selenium merupakan semi konduktor, Arus listrik terbentuk begite detektor terkeina cahayaForo Condulif Merupakan semi konduktor yang berubsh konduktivitasnya begitu kena sinar. Ini memerlukan arus listrik oleh karena sinar akan merubah konduktornya 3. Foto Tube Prinsip kerja sama denga foto konduktif , 4. Foto Multiplier Merupakan detektor yang paling peka dapat mendeteksi sinar yang sengat lemah’dari monokromator yang mengeluarkan band pass yang sempit. a ‘ a Ukur dan Skala Energi liswik dari detektor gislirkan ke alat-wkurtistrik yang mengabah menjadi gerakan’ jarum untuk sistem pembacaan. Biasanya digunakan amplifier untuk meningkatkan output dari detektor. Pada fotometer skala alat ukur sudah dikalibrasi terhadap absorban dan transmitan. Untuk bahan yang menyerap sinar. T= 100% dan A = 0 sedangkan bahan yang tidak menembus sinar T= 0% dan A = tidak terhingga_ Saati ini skala digital lebih banyak dipakai karena lebih peka dan dapat mengatasi masalah.! vi |. JENIS FOTOMETER Fotometer pada umumnya dibedakan menurut sumbersinar dan pembiasan sinaraya, Beberapa macam fotometer :° Tabel 3, Jenis Fotometer Fotometer Sumber sigar Pembiasan sinae ‘Sinar pengukuran Spektrofotometer Untuk daerah nyata? Prisma atau kisi-kisi -Monokhromatis apabila Lampu wolfram tebal pita cukup kecil Untuk daerah uy = Prisma quartz atau kisi- Lampu Hi atau Dy kisi ‘Spekiolinifotometer Lampu Hg Filer kaca atau filer Monokhvomatis Lampu Cd interferens Fikterfotometer Lampu tungsten (wolffam) Filter kaca. Kurang monokkbromatis Filer interferens Monokhromatis Spektrofotometer Panjang gelombang dari sinar yang digunakan untuk pengukuran dalam spektrofotometer dapat diubah secara kontinu, Untuk daerah nyata : lampu wolfram, sedangkan untuk daerah uy digunakan lampu hidrogen atau lampu deuterium (daerah 2 200-400 nm) Sinae kontinu akan dibiaskan oleh suatu prisma atay ksi-kisi, Dengan suatu celah difagma ang dlinginkan dapat diisolasi > =| Det = Lampu ©: Prisma Detekror panjang gck Kuve Gambar 11. Spektofotometer. *Keuntungan daersh wv Kelemahan ; Karena intensitas sinar sangat lemah, maka dibs sekali untuk anes-photo dan ini harg haut penguat yang, baik sya mabe Bentuk fotometer pads gambar 11 disebut Single Beam Fotometer. Bentuk dasar double bean fotometer dapat ditthat pada gambar {, Light Geen) ||. a ‘ Micon Entrance Exit sic Sli Gambar 12. Double beam in-space spektrofotometer. * Pada fotometer jenis ini pada dasarnya terdapat dua berkas sinar monokromatik yang sama intensitesnys, dua kuvet yang same dan dua detectoz sinar yang ukurannya sama. Aris listrik yang terjadi pada kedua deteMtor dikubungkan secara seri dan kemudian dialirkan kealat ukue. Kelebihan double beam fotometer dibandingkan yang single beam adalah, * 1. Perubahan pengukuran (pembacaan ) yang disebebkan variasi dari intensitas siner (sumbec listeik), variasi alat ukur dapat diatasi. Hal olch kerena di sini tidak ada perbedaan waktu pengukuran atau pembacaan untuk laruten tes dan lerutan pembandinig (blanko, atau titik nol) untuk setiap panjang gelombang 2. untuk mendapatkan spektrum serapan dari suatu larutan, dapat dilakukan dengan mudah, sebab tidak perlu lagi mengadakan ulangan pembacaan blanko atau titik uncuk setiap panjang gelombang sample elt eat Ls CF Gamibar 13, Double beam: intime Spektaforemeter, © Minors —¥ Minors + dapat mengskur sinar dengan semua panjang gelombang, terulama pada (OoI Untuk mendapatkan dua sinar monokromatik yang sama intensitasnya, tidak perlu harus menempatkan dua buah monokromator. Sinar monokromator dapat dibagi dengan cara bu atau chopper, fogam yang, berputar dengan putaran Konstan. Demikian pula dengan detektor, secara elektronik dapat diatur untuk mampu menerima dua berkas sinar yang terpisah yang nantinya menghasilkan dua sinyal yang terpisah pula, Hal ini dapat menghilangkan perbedaan yang mungkin terjadi antara dua detektor.? st Spektrotini-Fotometer Sebagai sumber sinar digunakan lampu Hg atau lampu Cd. Apabila elemen-clemen tersebut dipanaskan dengan persyaratan tertentu, maka dapat menguap dan mengeluarkan {iniclini tertentu (spectrum diskontiny), Dengan menggunekan filter yang cocok maka spectrum | tersebut dapatidiisolasi.? ~~~ it "| 10% : 10% 10! 10° 7 a 250 300 350 400 + Gambar 14 : Spektrum emisi dari beberapa sumber sinar.* Keuntungan ; Intensitas sinar sangat tinggi, terutama dalam daerah uv dan daerah gelombang pendek dari daerah nyata. Monokhromasi yang sangat baik. Kesalahan pada spektrofotometer yang disebabkan, jpada,_ptnyetelan monokrometer tidak terdapat pada spektrolinifotometer. Kelemahan : Tidak dapat mengukur pada setiap panjang gelombang, dengan demikian tidak selalu dapat mengukur pada absorpsi maksimum. Harga lampu He yang mahal sekali Filterfotometer ‘Adalah fotometer yang sederhana sekali dengan lampu pijar dan filter kaca bikse seboeai penyaring sinar. Oleh harena tbal pita dari filter tersebut sanyat besar sehingga daer panjang gelombang dari sinar ukur umumonya lebih luas dari kurva absorpsi dari zat ya diukur, sehingga ketepatan dani hasil pengukuran sangat bucuk. fotometer tersebut sekarang sudah tidak dianjurkan lagi untuk dipakai di Laboratorium kimia Klinik. Suatu jenis Khusus dari filterfotometer adalah fotometer yang menggunakan filter interferens sebagai penyaring dari sinar ukur, Biasanya forometer jenis ini digotongkan sebagai spektrofotometer.‘baik (2-3 wn) dan intensitas sinarnya pun cukap an berkualitas tinggi (misainya, dengan lampu Fotometer: Fotometer. 1995. Prinsip-Prinsip Dasar Peralatan Laboratorium , Principles of analytic techniques, Volume I, Tata Limited, New Delhi, 1988; 920-937. dementals of Clinical Chemistry, Fourth Edition, slphia, 1996; 54-69. Boeringer , Roche, 1989. -R, Principles of instrumentation, Clinical Diagnosis thods, Nineteenth Edition, W.B. Saunders Company,