MIKROBIOLOGI UMUM

PENGECATAN GRAM DAN ENDOSPORA

NAMA KHOFIFAH PUTRI WULANDARI

NIM 205100101111012
KELOMPOK D3
KELAS D-TEKNOLOGI PANGAN
ASISTEN DHAVA AYU FARHANI

JURUSAN TEKNOLOGI HASIL PERTANIAN

FAKULTAS TEKNOLOGI PERTANIAN
UNIVERSITAS BRAWIJAYA
MALANG
2021
 Nama Khofifah Putri Wulandari
NIM 205100101111012
Kelas D-Teknologi Pangan
Kelompok D3

Tanggal Praktikum Selasa, 27 April 2021

Praktikum PENGECATAN GRAM DAN ENDOSPORA

PRELAB

1. Sebutkan dan jelaskan jenis-jenis metode identifikasi mikroorganisme!

Metode identifikasi mikroorganisme dapat dilakukan melalui beberapa pengujian,
diantaranya menggunakan metode morfologinya yaitu dengan menggunakan parameter
berupa bentuk koloni, bentuk pertumbuhannya, ukuran, dan komponen tambahan di suatu
mikroorganisme. Dengan menggunakan metode ini dapat mengidentifikasi
mikroorganisme prokariotik dan eukariotik. Kemudian, ada juga metode pewarnaan yang
bertujuan untuk membedakan sel bakteri berdasarkan komponen dinding selnya. Metode
pewarnaan gram menggunakan kristal violet, reagen Gram, decolorizer, dan counter stain
dimana bakteri Gram positif akan berwarna ungu dan bakteri gram negative akan berwarna
pink. Pewarnaan endospore bertujuan mengetahui adanya endospore mikroorganisme pada
sampel yang diuji. Pada pewarnaan endospore reagen yang digunakan adalah malachite
green, decolorizer dan counter stain dimana endospore akan berwarna hijau dan sel lain
akan berwarna pink.

2. Jelaskan prinsip pengecatan gram?

Pengecatan gram adalah pengujian untuk menentukan gram positif dan gram negatif
bakteri yang diuji dengan cara memberi warna kristal violet. Prinsip dari pengecatan gram
yaitu, mengidentifikasi suatu bakteri berdasarkan komponen dinding selnya yaitu bakteri
gram positif dan gram negatif dengan menggunakan reagen Kristal violet dan safranin
yang merupakan zat utama dan sekunder. Di mana bakteri yang memiliki peptidoglikan
yang tebal akan berwarna ungu dan bakteri yang memiliki peptidoglikan tipis akan
berwarna pink. Bakteri yang berwarna ungu termasuk bakteri Gram postif dan bakteri yang
berwarna pink termasuk bakteri Gram negative.

3. Apa yang dimaksud dengan Bakteri Gram (-) dan Gram (+) ? Jelaskan dan beri contoh
(masing-masing 2 bakteri)!
Berdasarkan pewarnaan gram, bakteri dibedakan menjadi dua yaitu bakteri gram
positif dan bakteri gram negative. Bakeri gram positif adalah jenis bakteri di mana
memiliki dinding sel yang terbentuk atas 2 lapisan yaitu peptidoglikan yang tebal (20-80
nm) dan membrane dalam. Jadi apabila bakteri gram positif dilakukan pengecatan maka
akan menghasilkan warna ungu saat diamati di bawah mikroskop. Karena lapisan
peptidoglikan itulah yang akan mengikat zat warna kristal violet. Meskipun setelah
ditambah dengan safranin sebagai zat pencuci warnanya tetap ungu kebiruan. Bakteri gram
positif memiliki bentuk bulat, batang atau filamen serta berkembang biak dengan
pembelahan biner. Mayoritas alat geraknya nonmotil, bila memiliki motil maka jenis
flagelanya peritrikus. Contoh bakteri gram positif antara lain Steptococcus, Clostridia,
Staphylococcus, dan Bacillus.
 Nama Khofifah Putri Wulandari
NIM 205100101111012
Kelas D-Teknologi Pangan
Kelompok D3

Sedangkan, bakteri gram negative adalah bakteri yang memiliki dinding sel lebih tipis
(2-7 nm) daripada bakteri gram positif. Tetapi, kandungan lipid bakeri gram negative lebih
banyak disbanding bakteri gram positif. Apabila dilakukan pengecatan maka bakteri akan
menghasilkan warna merah muda saat diamati di bawah mikroskop. Hal ini dikarenakan
adanya pencucian dengan alcohol dan safranin yang mengakibatkan bakteri gram negative
terdekolorisasi. Bakteri gram negative memiliki bentuk bulat, oval, batang lurus, melingkar
seperti koma heliks atau filamen. Bakteri gram negative berkembangbiak dengan
pembelahan biner atau pertunasan. Memiliki alat gerak motil dan non motil serta memiliki
flagella ynag bervariasi, polar, ioprotikus dan peritrikus. Contoh bakteri gram negative
antara lain Salmonella, Neisseria, Hemophilus, Escherichia dan Shigella.

4. Jelaskan prinsip pengecatan endospora!

Prisip dari pengecatan endospora yaitu mengidentifikasi adanya spora dari sel vegetatif
dengan menggunakan reagen yaitu zat warna malachite green di mana akan tetap diikat
oleh spora bakteri dan sebagai counterstrain digunakan safranin. Endospore yang masih
terdapat di dalam sel vegetatif akan ditandai dengan adanya warna merah sampai dengan
merah muda. Sedangkan spora akan berwarna hijau. Reagen yang digunakan dalam
pengecatan endospore yaitu, malachite green karena merupakan pewarna khusus untuk
mewarnai struktur endospore yang susunannya terdiri dari protein keratin kompleks. Di
mana akan sulit diwarnai jika menggunakan pewarna biasa. Bakteri yang memiliki spora
akan tahan terhadap pewarnaaan.

5. Apa yang dimaksud dengan endospora dan sel vegetatif?

Endospora merupakan spora yang terbentuk di dalam sel, atau fase yang dilakukan oleh
bakteri untuk memproduksi bentuk pertahanan hidup Ketika dalam konndisi ekstrim atau
tidak menguntungkan seperti kekurangan nutrient atau kekeringan. Nama lain dari
endospore adalah fase tidur bakteri. Endospore dapat memudahkan penyebaran bakteri.
Ketika sudah dalam keadaan menguntungkan maka endospore akankembali membentuk
bakteri asal.
Sedangkan, sel vegetative adalah sel selain endospore yang ada pada bakteri. Misalnya
seperti mitokondria, lisosom atau ribosom. Sel vegetative hanya memilliki selapis dinding
sel Pada pewarnaan endospore, uji positifnya endospore akan ditandai dengan adanya
warna hijau. Sedangkan sel vegetative ditandai dengan adanya warna pink.
 DIAGRAM ALIR ANALISA PROSEDUR

A. Pengecatan Gram 1. Siapkan alat dan bahan, diantaranya gelas obyek untuk menempatkan obyek yang akan
1 diamati dan gelas penutup untuk melekatkan kultur, , mikroskop untuk melakukan pengamatan
Gelas obyek
pada obyek, pipet tetes untuk memindahkan cairan dalam julah sedikit, spidol untuk
2 menggambar area, Bunsen untuk melakukan pemanasan, ose untuk memindahkan kultur, botol
Digambar area penampakan biakan di balik preparate
aquades untuk membersihkan gelas, biakan murni Bacillus subtilis dan E.coli dalam NB
3 Ditetesi 1 tetes aquades pada preparate 1 ose sebagai kultur yang akan diwarnai. Selanjunya, lakukan aseptis diri dan lingkungan untuk
biakkan B. mencegah terjadi kontaminasi. Siapkan gelas obyek dan gelas penutup yang akan menjadi
4 subtitulis preparate. Bersihkan gelas benda dan gelas penutup dengan aquades dan alcohol 70% sampai
5 Dikering anginkan dan E.coli
bebas lemak dan debu. Beri label pada ujung gelas benda dengan nama atau inisial bakteri
7 yang akan dicat.
6 Difiksasi dengan Bunsen
2. Selanjutnya, gambar bulatan berdiameter 1 cm dengan spidol di bawah gelas obyek. Gunakan
2-3 tetes kristal violet daerah ini sebagai daerah untuk pengecatan mikrobia untuk mempermudah pengamatan.
8 Didiamkan selama 1 menit 3. Lalu, beri 1 tetes aquades pada permukaan gelas benda di dalam daerah yang sudah Digambar.
Tujuan ditetesi dengan aquades yaitu, untuk menghindari terjadinya penumpukan isolat.
9
Dicuci dengan air mengalir dan dikering anginkan 4. Ambil sedikit biakan bakteri dengan ose bermata secara aseptis dan campur dengan aquades
10 yang ada pada gelas benda. Ratakan suspensi ini pada seluruh bulatan area. Ratakan selnya
1 tetes iodin
11 pada seluruh permukaan bulatan.
Didiamkan selama 1 menit
5. Kering anginkan (dengan kipas angin) hingga membentuk noda.
12 6. Lakukan fiksasi dengan cara ,melewatkan gelas benda pada nyala api beberapa kali. Jangan
Dicuci dengan air mengalir dan dikering anginkan 13
biarkan gelas benda langsung kena nyala api sehingga menjadi terlalu panas. Untuk mengetes
3 tetes Ethanol 95% suhu fiksasi, tempelkan gelas benda pada pergelangan tangan selama 1-2 detik. Fiksasi yang
14
Didiamkan selama 30 detik baik adalah apabila terasa hangat, bukan terasa panas. Tujuan fiksasi adalah untuk melekatkan
15 bakteri agar saat pencucian bakteri tidak ikut hilang tercuci.
Dicuci dengan air mengalir dan dikering anginkan 16
7. Bubuhkan cat utama violet kristal 2-3 tetes, diamkan selama 1 menit. Tujuannya untuk
2 tetes Safranin memberi warna pada biakan di mana akan memberi warna pada gram positif.
8. Didiamkan selama 1 menit agar meresap.
17 Didiamkan selama 2 menit 9. Cuci dengan air mengalir, kemudian kering anginkan (dengan kipas angin). Tujuannya untuk
 18 menghilangkan sisa kristal violet pada sampel. Dan dikering anginkan untuk menghilangkan
Dicuci dengan air mengalir dan dikering anginkan bekas air pencucian.
10. Tetesi dengan beberapa tetes larutan iodin, biarkan selama 1 menit. Tujuannya agar kristal
19 Ditutup dengan gelas penutup
violet lebih menempel pada peptidoglikan.
1 tetes minyak imersi 11. Lalu, didiamkan selama 1 menit agar menyerap.
21 12. Kemudian, Cuci untuk menghilangkan sisa iodin dengan air mengalir dan kering anginkan.
Diamati dengan mikroskop perbesaran 1000x 20
13.Miringkan gelas benda, cuci dengan larutan etanol dengan cara meneteskan etanol pada
permukaan noda bakteri sampai etanol bekas cucian tidak berwarna. Etanol ini berperan
Hasil sebagai decolorizer.
14. Lalu, ditunggu selama 30 detik agar warna ungu pada peptidoglikan berkurang.
15.Cuci dengan air mengalir secara singkat, kemudian kering anginkan. Tujuan dicuci untuk
menghilangkan sisa iodin yang menempel dan dikeringkan agar airnya meresap.
16.Bubuhkan beberapa tetes safranin. Tujuannya untuk memberi warna pink pada sampel
17. Lalu, diamkan selama 2 menit supaya safranin meresap.
18.Cuci secara cepat dengan air mengalir dan kering anginkan. Tujuan dicuci untuk
menghilangkan sisa safranin yang masih menempel.
19.Kemudian, tutup gelas obyek dengan gelas penutup dengan posisi 45° tujuannya untuk
mencegah terbentuknya gelembung udara yang dapat mempengaruhi hasil pengamatan.
20. Lalu, beri 1 tetes minyak imersi pada mikroskop. Karena perbesaran yang digunkaan dalam
pengamatan ini 1000x oleh sebab itu menggunakan minyak imersi. Minyak ini akan
memperjelas bayangan obyek yang akan diamati.
21.Amati preparat dengan mikroskop perbesaran kuat 1000x. Sel akan berwarna merah
DIAGRAM ALIR muda/pink
ANALISA (Gram negatif) atau biru ungu (Gram positif). Gambar beberapa sel yang mewakili
PROSEDUR
dan tuliskan perbesaran yang baik
B. Pengecatan Endospora 1. Siapkan alat dan bahan, diantaranya gelas obyek untuk menempatkan obyek yang akan
1 diamati dan gelas penutup untuk melekatkan kultur, , mikroskop untuk melakukan
Gelas obyek
pengamatan pada obyek, pipet tetes untuk memindahkan cairan dalam julah sedikit, spidol
2 untuk menggambar area, Bunsen untuk melakukan pemanasan, ose untuk memindahkan
Digambar area penampakan biakan di balik preparate
 kultur, botol aquades untuk membersihkan gelas, biakan murni Bacillus subtilis dan E.coli
3 Ditetesi 1 tetes aquades pada preparat 1 ose
dalam TSB sebagai kultur yang akan diwarnai. Selanjunya, lakukan aseptis diri dan
biakkan B.
4 subtitulis lingkungan untuk mencegah terjadi kontaminasi. Siapkan gelas obyek dan gelas penutup yang
5 Dikering anginkan dan E.coli akan menjadi preparate. Bersihkan gelas benda dan gelas penutup dengan aquades dan alcohol
70% sampai bebas lemak dan debu. Beri label pada ujung gelas benda dengan nama atau
Difiksasi dengan bunsen 7 inisial bakteri yang akan dicat.
6 2. Selanjutnya, gambar bulatan berdiameter 1 cm dengan spidol di bawah gelas obyek. Gunakan
2-3 tetes Malachite green
daerah ini sebagai daerah untuk pengecatan mikrobia untuk mempermudah pengamatan.
8 Dipanaskan di atas air mendidih selama 5 menit 3. Lalu, beri 1 tetes aquades pada permukaan gelas benda di dalam daerah yang sudah Digambar.
Tujuan ditetesi dengan aquades yaitu, untuk menghindari terjadinya penumpukan isolat.
Didinginkan, dicuci dengan air mengalir dan dikering anginkan
4. Ambil sedikit biakan bakteri dengan ose bermata secara aseptis dan campur dengan aquades
9 2 tetes yang ada pada gelas benda. Ratakan suspensi ini pada seluruh bulatan area. Ratakan selnya
10
11 pada seluruh permukaan bulatan.
Didiamkan selama 30 detik
5. Kering anginkan (dengan kipas angin) hingga membentuk noda.
12
Dicuci dengan air mengalir dan dikering anginkan 6. Lakukan fiksasi dengan cara ,melewatkan gelas benda pada nyala api beberapa kali. Jangan
biarkan gelas benda langsung kena nyala api sehingga menjadi terlalu panas. Untuk mengetes
13 Ditutup dengan gelas penutup 14
suhu fiksasi, tempelkan gelas benda pada pergelangan tangan selama 1-2 detik. Fiksasi yang
1 tetes minyak imersi baik adalah apabila terasa hangat, bukan terasa panas. Tujuan fiksasi adalah untuk melekatkan
15 Diamati dengan mikroskop perbesaran 1000x bakteri agar saat pencucian bakteri tidak ikut hilang tercuci.
7. Bubuhkan cat utama Malachite green 2-3 tetes tujuannya untuk memberi warna hijau pada
sampel
Hasil
8. Lalu, panaskan di atas air mendidih selama 5 menit, tambahkan larutan cat apabila diperlukan
agar noda tidak kering. Tujuan dipanaskan agar Malachite green masuk dan mewarnai bagian
endospore.
9. Kemudian didinginkan agar suhu menurun. Lalu, cuci dengan air mengalir untuk
mengilangkan sisa Malachite green, kemudian kering anginkan (dengan kipas angin) agar
airnya berkurang.
10. Selanjutnya, beri tetes safranin. Tujuannya untuk memberi warna pink pada sampel
11. Lalu, diamkan selama 30 detik supaya safranin meresap.
12. Kemudian, cuci secara cepat dengan air mengalir dan kering anginkan. Tujuan dicuci untuk
menghilangkan sisa safranin yang masih menempel.
13. Kemudian, tutup gelas obyek dengan gelas penutup dengan posisi 45° tujuannya untuk
mencegah terbentuknya gelembung udara yang dapat mempengaruhi hasil pengamatan.
14. Lalu, beri 1 tetes minyak imersi pada mikroskop. Karena perbesaran yang digunkaan dalam
pengamatan ini 1000x oleh sebab itu menggunakan minyak imersi. Minyak ini akan
memperjelas bayangan obyek yang akan diamati.
15. Amati preparat dengan mikroskop perbesaran kuat 1000x. Sporanya akan berwarna hijau dan
sel vegetatifnya akan berwarna pink. Gambar beberapa sel yang mewakili dan tuliskan
perbesaran yang baik.
 DAFTAR PUSTAKA

Holderman, M.V., Edwin D.Q., dan Sendy B.R. 2017. Identifikasi Bakteri pada Pegangan
Eskalator di Slah Satu Pusat Perbelanjaan di Kota Manado. Jurnal Ilmiah Sains, 17(1):
14-18.
Mukti, N.H., Laras R., dan Romadhon. 2019. Aktivitas Antibakteri Isolat Bakteri Asam
Laktat dari Peda dengan Jenis Ikan Berbeda Terhadap E. coli dan S. aureus. Jurnal Ilmu
dan Teknologi Perikanan, 1(2): 11-21.
Oktari, A., Supriatin, Y., Kamal, M. and Syafrullah, H. 2017. The Bacterial Endospore Stain
on Schaeffer Fulton Using Variation of Methylene Blue Solution. Journal of Physics:
Conference Series. 812(1): 1-5.
Thairu, Y., Nasir, I.A. and Usman, Y., 2014. Laboratory Perspective of Gram Staining and its
Significance in Investigations of Infectious Diseases. Sub-Saharan African Journal of
Medicine, 1(4): 168-173.
Wunderlin, T., Junier, T., Paul, C., Jeanneret, N. and Junier, P., 2016. Physical isolation of
endospores from environmental samples by targeted lysis of vegetative cells. JoVE
(Journal of Visualized Experiments), (107)53411: 1-7.