Vol.14.No.1.Th.

2007 Evaluasi Pertahanan Non Spesifik Ikan Nila Gift (Oreochromis sp)

Evaluation of non-specific defence of Tilapia (Oreochromis sp) injected with LPS

(Lipopolysaccharides) of Aeromonas hydrophilla.

Sri Dwi Hastuti *

Jurusan Perikanan, Fakultas Peternakan – Perikanan, Universitas Muhammadiyah Malang
Jl. Raya Tlogomas No.246 Malang, Telp. (0341) 464318

ABSTRACT

Background : Intensif farming of Tilapia often resulted in the diseases causing by microorganisms wheter bacteria or
viruses. Using antibiotic as a terapeutic agents found ineffective, therefore the new alternatif for combating diseases
problem in aquaculture is needed. It has been known that fish has nonspecific defence which can be stimulated with
immunostimulant such as LPS extracted from gram negative bacteria. Hence, this research is important to evaluate the
effect of LPS injection with different dosage to hematocrite, leucocrite, and NBT (Nitroblue Tetrazolium) of Tilapia
blood.
Method : Method using in this research was experiment with completed randomized design, whereas data analized with
ANAVA.
Conclusion : From the research it can be found that hematocrite level and NBT (Nitroblue Tetrazolium) activity
increase with the increase of LPS dosage, while leucocrite level was fluctuated. It is suggested that parameter measured
were influenced by physiological condition of fish at the time sampling and fish size.

Key words : Nonspecific defence mechanism, Hematocrite, Leucocrite, NBT (Nitroblue Tetrazolium) activity

Evaluasi Pertahanan Non Spesifik Ikan Nila Gift (Oreochromis sp) yang Diinjeksi dengan LPS
(Lipopolysaccahrida) Bakteri Aeromonas hydrophila.

ABSTRAK

Latar Belakang : Pada budidaya ikan nila secara intensif seringkali ditemukan serangan penyakit yang diakibatkan
oleh bakteri atau virus. Penanggulangan dengan antibiotik seringkali tidak efektif, sehingga perlu alternatif baru dalam
pemecahan masalah penyakit ini. Diketahui bahwa ikan mempunyai respon kekebalan non spesifik yang bisa
dirangsang dengan pemberian immunostimulant seperti LPS dari bakteri. Diharapkan LPS yang diberikan dapat
meningkatkan respon kekebalan non spesifik pada ikan sehingga meningkatkan resistensinya terhadap serangan
patogen. Oleh karena itu penelitian ini perlu dilakukan untuk mengevaluasi sistem kekebalan non spesifik pada ikan nila
pada penyuntikan dosis LPS yang berbeda dengan melihat indikator-indikator seperti hematokrit dan leukokrit, NBT,
dan total protein plasma pada darah ikan yang disampling.
Metode : Metode yang digunakan dalam penelitian ini adalah eksperimen dengan rancangan acak lengkap (RAL).
Sementara data yang diperoleh akan dianalisa dengan ANAVA (Analisa Variansi).
Kesimpulan : Untuk level hematokrit didapatkan hasil bahwa semakin tinggi dosis LPS yang disuntikkan maka level
hematokritnya semakin tinggi pula, dan pola ini ditemui juga pada kekebalan non spesifik ikan dalam aktivitas
NBTnya. Level leukokrit didapatkan hasil yang fluktuatif dan setelah diuji ANAVA ternyata tidak berbeda. Hal ini
karena hasil sangat dipengaruhi oleh kondisi fisiologis ikan ketika disampling dan ukuran ikan.

Kata Kunci : Sistem pertahanan non spesifik, Hematokrit, Leukrokit, aktivitas NBT (Nitroblue Tetrazolium)

* Jurusan Perikanan, Fakultas Peternakan – Perikanan, Universitas Muhammadiyah Malang

79
Hastuti
PENDAHULUAN
Salah satu jenis ikan air tawar yang banyak
dibudidayakan di Indonesia adalah ikan nila gift
(Oreochromis sp). Jenis ikan ini banyak disukai
oleh konsumen dan permintaannya terus tinggi
walaupun banyak jenis ikan budidaya lain sebagai
pilihan. Sudah sejak lama ikan nila dibudidayakan
secara intensif, dan biasanya pada budidaya
intensif kemunculan serangan penyakit seringkali
ditemukan. Tingginya padat tebar dan pakan
yang digunakan menjadi pendorong bagi
timbulnya penyakit akibat menurunnya kualitas
air karena timbunan bahan organik dari sisa pakan
maupun ekskresi ikan. Sementara itu ikan menjadi
stress sehingga rentan terhadap serangan penyakit,
khususnya penyakit infeksius seperti yang
disebabkan oleh bakteri (Angka, 1990) maupun
virus.
Upaya penanggulangan penyakit yang
disebabkan bakteri Aeromonas hydrophila telah
banyak dilakukan baik dengan cara pengobatan
dengan antibiotik maupun memakai cara
pencegahan dengan vaksin untuk meningkatkan
kekebalan ikan terhadap serangan bakteri patogen.
Pada umumnya studi yang dilakukan dalam
bidang imunologi ikan kebanyakan didasarkan
pada produksi antibodi, namun pada
kenyataannya beberapa penelitian tidak dapat
mendeteksi keberadaan antibodi pada ikan yang
diimunisasi dengan bakteri A. hydrophila (Baba,
et.al., 1988). Beberapa penelitian menunjukkan
bahwa antigen dari A. hydrophila dapat
merangsang mekanisme pertahanan tubuh non-
spesifik pada ikan melawan berbagai macam
bakteri dari genus Aeromonas (Stevenson, 1988;
Karunasagar, et.al., 1991).
MATERI DAN METODE PENELITIAN
Ikan nila gift, dalam penelitian ini
digunakan ikan nila gift dengan ukuran panjang
lebih kurang 10 – 12 cm berasal dari satu induk
dan berada dalam kondisi sehat. Alkohol
digunakan untuk mensterilkan alat-alat. Aquadest
sebagai pelarut bahan atau media. Nutrient Broth
(NB) sebagai media kultur bakteri. Phosfat Buffer
Saline (PBS). Minyak cengkeh. EDTA atau
heparin. Tabung kapiler hematokrit. Nitroblue
Tetrazolium (NBT). Bovine Serum Albumine
80
Jurnal Protein
(BSA) 100 mg/ml. Protein test kit (Biorad).
Pakan ikan yang digunakan adalah pakan buatan
berbentuk pellet yang besarnya disesuaikan
dengan lebar bukaan mulut benih ikan. Alat-alat
penelitian yang digunakan Pinset untuk
mengambil bahan yang berukuran kecil.
Timbangan analitik untuk mengukur berat media.
Inkubator untuk menumbuhkan bakteri pada suhu
yang sesuai dengan persyaratan pertumbuhannya.
Kulkas untuk menyimpan menyimpan biakan
bakteri dan LPS. Spuit 1ml dan jarum suntik
untuk injeksi ikan dan sampling darah ikan. Pipet
mikro dan tipnya untuk pengambilan bahan.
Erlenmeyer untuk wadah saat memasak media
agar untuk bakteri. Pembakar Bunsen untuk
sterilisasi jarum ose pada saat kultur bakteri.
Akuarium sebagai wadah pemeliharaan ikan
selama penelitian, Coverslip, Tabung appendorf,
Spektrofotometer untuk pengukuran aktivitas
NBT dan total protein plasma, Penggaris untuk
mengukur level hematokrit, Autoclaf untuk
sterilisasi alat dan media, Aerator digunakan
untuk menyediakan oksigen pada air media
pemeliharaan, Filter : untuk menjaga kondisi
kualitas air dalam aquarium tetap bersih. Metode
penelitian yang digunakan adalah metode
eksperimen. Pada metode ini, percobaan ditujukan
untuk melihat suatu hasil yang menggambarkan
hubungan kausal variabel-variabel yang diselidiki
(Surakhmad, 1989), dengan melakukan
serangkaian percobaan untuk melihat suatu hasil.
Hasil tersebut akan menjelaskan bagaimana
kedudukan hubungan antara variabel yang
diselidiki. Tujuan dari penelitian eksperimen
adalah untuk menyelidiki kemungkinan saling
hubungan sebab akibat dengan cara mengenakan
kepada satu atau lebih kelompok eksperimen, satu
atau lebih kondisi perlakuan dan membandingkan
hasilnya (Suryabrata, 1995). Teknik pengambilan
data dilakukan dengan cara observasi langsung,
yaitu pencatatan pengamatan secara sistematik
fenomena-fenomena yang diselidiki baik
pengamatan itu dilakukan dalam situasi yang
sebenarnya maupun situasi buatan yang khusus
diadakan (Surakhmad, 1989).
HASIL DAN PEMBAHASAN
1. Level Hematokrit dan Leukokrit
Vol.14.No.1.Th.2007 Evaluasi Pertahanan Non Spesifik Ikan Nila Gift (Oreochromis sp)

Kondisi kesehatan ikan dapat diketahui dengan menggunakan mistar. Level

dari pemeriksaan darah, yaitu dengan melihat hematokrit ditentukan dengan cara hasil
perbandingan jumlah eritrosit dan pengukuran panjang pada bagian sel darah
leukositnya. Untuk mengetahui level merah dibagi dengan total panjang darah pada
hematokrit dan leukokrit digunakan tabung tabung kapiler kemudian dikalikan 100%,
kapiler darah. Sampel darah dimasukkan sehingga didapatkan level hematokrit dalam
dalam tabung kapiler kemudian dilakukan bentuk persen. Cara ini juga berlaku untuk
sentrifugasi sehingga terjadi pemisahan antara penentuan level leukokrit. Hasil pengukuran
sel darah merah, sel darah putih dan terhadap level hematokrit ikan uji disajikan
plasmanya. Pengukuran dilakukan dengan pada gambar di bawah ini :
mengukur panjang masing-masing lapisan
L e v e l H e m a to k r i t (% )

Level Hematokrit

25,00 23,33
19,81
20,00
15,37
15,00 13,07

10,00

5,00

0,00
1
Dosis LPS (0,25%,50%,100%)

Gambar 1. Level Hematokrit Ikan Uji selama Penelitian

Volume sel darah merah dalam darah maka imunostimulant semakin efektif dalam
ikan dapat menggambarkan kesehatan ikan. merangsang sistem kekebalan ikan nila. Level
Pada ikan Rainbow Trout yang sehat level hematokrit untuk masing-masing individu
hematokritnya sekitar 30-40% (Anderson dan bisa dipengaruhi oleh kondisi ikan awal dan
Siwicki, 1994). Pada studi ini level hematokrit penanganan saat penyamplingan darah ikan
yang dimiliki oleh ikan uji pada beberapa yang dapat menyebabkan stress sehingga akan
perlakuan menunjukkan bahwa semakin menurunkan level hematokrit. Selanjutnya
tinggi dosis nampaknya level hematokritnya dikatakan bahwa ikan yang mengalami
semakin meningkat. Namun demikian level anemia mempunyai persentase hematokrit
hematokrit yang dihasilkan masih tergolong serendah-rendahnya adalah 10%. Rendahnya
rendah jika dibandingkan dengan hematokrit hematokrit juga dapat menunjukkan
pada ikan Rainbow Trout sehat. Sayangnya terjadinya kontaminasi, ikan kekurangan
belum ada penelitian yang bisa dijadikan makan, kandungan protein pakan rendah,
acuan untuk level hematokrit pada ikan nila kekurangan vitamin atau terjadi infeksi.
gift. Hematokrit yang tinggi dapat menunjukkan
Anderson dan Siwicki (1994) juga adanya kontaminan, adanya masalah
menyatakan bahwa pemberian osmolarity dan stress. Fujaya (2004)
Immunostimulant mempunyai pengaruh menyatakan bahwa ada korelasi yang kuat
terhadap persentase hematokrit walaupun antara hematokrit dan jumlah hemoglobin
tidak begitu besar. Semakin tinggi level darah, semakin rendah jumlah sel-sel darah
hematokrit yang dihasilkan menunjukkan merah, maka semakin rendah pula kandungan
bahwa semakin tinggi dosis penyuntikan hemoglobin dalam darah.

Tabel 1. Level Leukokrit Ikan Uji Selama Penelitian

ULANGAN
DOSIS LPS TOTAL Rata-rata
1 2 3
0% 11,11 7,69 7,27 26,07 8,69
25 % 10,34 8,88 2,32 21,54 7,18

81
Hastuti Jurnal Protein

50 % 1,66 3,22 6,25 11,13 3,71

100 % 5,00 4,16 18,75 27,91 9,30
TOTAL 86,65

Hasil pengukuran leukokrit pada ikan Level leukokrit dalam darah ikan dapat
nila uji menunjukkan adanya memberikan petunjuk tentang kesehatan ikan
ketidakkonsistenan dari leukokrit ikan akibat dan menentukan adanya ketidaknormalan
pengaruh penyuntikan LPS. Dapat dilihat karena pengaruh pemberian imunostimulant.
pada tabel diatas Leukokrit tertinggi diperoleh Hasil penelitian menunjukkan bahwa
pada perlakuan dosis LPS 100%, namun pada leukokrit pada berbagai perlakuan
dosis LPS 50% leukokrit ditemukan yang menunjukkan hasil yang tidak berbeda nyata
terendah, sementara pada konsentrasi 0% diantara perlakuan setelah diuji ANAVA.
(tanpa LPS) leukokritnya hampir mendekati Oleh karena itu tidak dilanjutkan dengan Uji
nilai pada dosis 100%. Leukokrit yang rendah BNT.
bisa disebabkan oleh infeksi kronis, kualitas
nutrisi rendah, kekurangan vitamin dan 2. Aktivitas NBT
adanya kontaminan. Sementara itu NBT akan direduksi oleh formazan
meningkatnya leukokrit bisa menunjukkan pada reaksi dengan radikal oksigen yang
adanya infeksi pada tahap awal atau ikan diproduksi dari neutrofil dan monosit. Analisa
dalam kondisi stress. Kondisi leukokkrit ikan produksi radikal oksigen dengan
juga sangat tergantung pada kondisi ikan pada menggunakan NBT (nitroblue tetrazolium)
saat disampling, lama waktu antara sampling dilakukan dengan menggunakan
dan pengukuran darah serta prosedur spektrofotometer dengan panjang gelombag
pengukuran yang digunakan (Anderson dan 540 nm. Hasil pengamatan Aktivitas NBT
Siwicki, 1994). Dari data diatas kemudian dapat dilihat berikut ini :
dianalisis dengan ANAVA.
A k ti v i ta s N B T p a d a O D

Aktivitas NBT

0,700 0,615
0,600 0,514
0,485
0,500 0,421 Series1
Series2
540

0,400
0,300 Series3
0,200 Series4
0,100
-
1
Dosis LPS (0, 25, 50 100 persen)

Gambar 2. Aktivitas NBT

Berdasarkan hasil pengukuran bahwa ikan mempunyai mekanisme

diperoleh data bahwa semakin meningkat membunuh oleh sel-sel fagosit melalui
dosis penggunaan LPS maka aktivitas NBT oksigen bebas dalam vakuola lisosom yang
semakin meningkat. Hasil tertinggi didapat mampu meningkatkan permeabilitas sel
pada perlakuan penyuntikan dengan dosis bakteri sehingga bisa menyebabkan masuknya
100% LPS diikuti dengan dosis 50 %, 25 % substansi dan cairan dalam sel bakteri yang
dan ikan uji tanpa LPS menunjukkan aktivitas kemungkinan bisa menyebabkan plasmolisis.
NBT yang paling rendah. Radikal oksigen toksik ini dengan cepat
Semakin tingginya nilai aktivitas NBT dikonversi menjadi hidrogen peroksida
menunjukkan bahwa produksi radikal oksigen (H2O2) yang memiliki sifat bakterisidal yang
bebas semakin besar. Produksi radikal bebas kuat. Selain itu radikal oksigen yang bersifat
ini digunakan untuk melawan patogen. toksik terhadap patogen ini kemungkinan pula
Sebagaimana dikatakan oleh Irianto (2005) dikonversi menjadi radikal hidroksi (OH-)

82
Vol.14.No.1.Th.2007 Evaluasi Pertahanan Non Spesifik Ikan Nila Gift (Oreochromis sp)
yang memiliki kemampuan mendegradasi
membran lipid. Penurunan aktivitas NBT
mengindikasikan adanya kontaminan dan
infeksi yang kronis atau ikan sedang dalam
kondisi stress. Peningkatan NBT dapat
mengindikasikan bahwa perlakuan
penyuntikan LPS telah efektif merangsang
sistem kekebalan tubuh ikan (Anderson dan
Siwicki, 1994). Neutrofil dan sel fagositik
yang teraktivasi dapat menghasilkan
absorbance 20-30% lebih tinggi, yang
menunjukkan produksi oksigen radikal yang
lebih tinggi untuk pertahanan terhadap
penyakit.
3. Total Protein Plasma
Tabel 2. Hasil Pengukuran Total Protein Plasma pada OD 595 nm (mg/ml)
ULANGAN
DOSIS
1 2 3
0% 1.064,30 1.016,40 1.044,80
25 % 861,83 1.064,30 1.094,00
50 % 616,02 1.178,10 1.114,20
100 % 1.083,80 716,37 952,80
TOTAL
Dari hasil pengukuran tentang total
protein plasma didapatkan bahwa semakin
tinggi dosis LPS yang diinjeksikan ternyata
total protein plasmanya semakin menurun.
Hal ini tidak sesuai dengan teori dan beberapa
studi yang telah dilakukan berkenaan dengan
hubungan antara level hematokrit, leukokrit,
aktivitas NBT dan total protein plasma yang
menyatakan bahwa pada umumnya semua
indikator kesehatan ikan tersebut mempunyai
korelasi yang positif, dimana peningkatan
hematokrit, leukokrit, dan NBT biasanya akan
diikuti oleh peningkatan aktivitas kekebalan
non-spesifik yang lainnya (Anderson, 2005).
Setiap jenis ikan mempunyai respon yang
berbeda terhadap penyuntikan LPS
dibandingkan pada hewan mamalia (Berczi,
1998).
Konsentrasi total protein plasma sangat
tergantung pada umur dan kondisi individu
ikan yang disampling. Penurunan total protein
plasma mengindikasikan infeksi kronis, dan
rendahnya protein dalam pakan ikan.
Sementara peningkatan total protein plasma
merupakanb respon terjadinya infeksi atau
Pengukuran total protein plasma
dilakukan berdasarkan metode kolorimetri
yang mendeteksi sejumlah nitrogen dalam
bentuk asam amino. Pengukuran total protein
plasma dilakukan dengan metode
spektrofotometrik pada panjang gelombang
595 dan kemudian dibandingkan antara
sampel dengan standar BSA (Bovine Serum
Albumine). Pada pengukuran total protein
plasma ini didapatkan hasil larutan yang
berwarna biru setelah ditambahkan dengan
serum dan protein test kit (Biorad) sementara
untuk kurva standard yang dipakai adalah
larutan standar BSA. Tabel hasil pengukuran
total protein plasma ikan yang telah diinjeksi
LPS dapat dilihat pada tabel 7 berikut ini :
TOTAL Rata-rata
3.125,50 1.041,83
3.020,13 1.006,71
2.908,32 969,44
2.752,97 917,66
11.806,92
respon pemberian stimulant dan vaksin. Total
protein pada ikan yang sehat biasanya
berkisar antara 30-50 mg/ml plasma
(Anderson dan Siwicki).
KESIMPULAN DAN SARAN
Kesimpulan
Dari hasil penelitian tentang evaluasi
pertahanan non spesifik pada ikan nila gift yang
diinjeksi LPS bakteri menunjukkan bahwa dari
pengukuran terhadap darah ikan didapatkan hasil
yang tidak konsisten. Untuk level hematokrit
didapatkan hasil bahwa semakin tinggi dosis LPS
yang disuntikkan maka level hematokritnya
semakin tinggi pula, dan pola ini ditemui juga
pada kekebalan non spesifik ikan dalam aktivitas
NBTnya. Level leukokrit didapatkan hasil yang
fluktuatif dan setelah diuji ANAVA ternyata tidak
berbeda, demikian pula pada total protein plasma.
Hal ini karena hasil sangat dipengaruhi oleh
kondisi fisiologis ikan ketika disampling, umur
ikan dan waktu antara sampling dengan
pemeriksaan darah.
83
Hastuti Jurnal Protein

Saran
Perlu adanya pengamatan darah ikan
lengkap tidak hanya pada satu waktu tetapi darah
disampling beberapa kali sehingga dapat diketahui
perubahan-perubahan yang terjadi dan dapat
diketahui sampai berapa lama LPS efektif
memberikan respon kekebalan pada ikan nila gift.
DAFTAR PUSTAKA
1. Anderson, D. P. and A.K. Siwicki. !994.
Simplified Assays For Measuring Non
Spesific Defense Mechanisms in Fish.
2. Baba, T., Imamura, J., Izawa, K. 1988. Immune
protection in Carp (Cyprinus carpio L.)
After Immunization with Aeromonas
hydrophila Crude Lipopolysaccharide.
Journal of Fish Diseases, 11 : 237-244
3. Dalmo, R.A., B. Martinsen T.E. Horsberg, A.
Ramstad, C. Syvertsen, R. Seljelid, and K.
Ingebrigtsen. 1998. Prophylactic Effect of
B-1,3-D- glucan (laminaran) Against
Experimental Aeromonas salmonicida and
Vibrio salmonicida Infection. Journal of
Fish Disease 21:459-462
4. Irianto, A. 2005. Patologi Ikan Teleostei.
Gadjah Mada University Press.
Yogyakarta.
9. Kim, H.K, Y.J. Hwang, and S.C. Bai. 1999.
Resistance to Vibrio algynoliticus in
Juvenile Rockfish (Sebastes schlegeli) Fed
Diets Containing Different Doses of Aloe.
Aquaculture. 180:13-21
10. Kresno, B.S.2001. Imunology: Diagnosis dan
Prosedur Laboratorium .Ed 4. Fakultas
Kedokteran Universitas Indonesia.
11. Matsuyama, H., REP Mangindaan, and T.
Yano. 1992. Protective Effect of
Schizophyllan and Scleroglucan Against
Sterptococcus sp infection in Yellowtali
(Seriola quinqueradiata). Aquaculture.
101:197-203
12. Nitimulyo, K.H; A.Isnansetyo; Triyanto; M.
Murdjani; L. Sholichah. 2005. Effetiveness
of Polyvalen Vaccine to Control Vibriosis
in Humback Grouper Cromileptes
altivelis). Journal Of Fisheries Sciences.
Vol VII No 2, Juli 2005.
13. Sakai, M., K Taniguchi1, K Mamoto2, H
Ogawa2 and M Tabata2. Immunostimulant
effects of nucleotide isolated from yeast
RNA on carp, Cyprinus carpio L. Journal
of Fish Diseases 2001, 24, 433-438

5. Isnansetyo, A. 2006. Evaluasi Pertahanan Non

Spesifik Ikan. LAboratorium Hama Dan
Penyakit Ikan Jurusan Perikanan , Fakultas
Pertanian Universitas Gajah Mada.

6. Isnansetyo, A dan Triyanto. 2006. Sistem

Pertahanan Non Spesifik pada Ikan.
Fakultas Pertanian. UGM

7. Jorgensen, JB, H.Lunde and B. Robertsen,

1993. Peritoneal and head Kidney Cell
Response to Intraperitoneally Injected
Yeast Glucan in Atlkantic Salmon (Salmo
salar L. Journal of Fish Disease. 16: 313-
325

8. Karunasagar, I., Rosalind, G., Karunasagar, I.

1991. Immunological Response of The
Indian Major Carps to Aeromonas
hydrophila Vaccine. Journal of Fish
Diseases, 14: 413-417

84
Vol.14.No.1.Th.2007 Evaluasi Pertahanan Non Spesifik Ikan Nila Gift (Oreochromis sp)

85