LAPORAN PRATIKUM GENETIKA DASAR

EKSTRAKSI DNA TANAMAN DENGAN METODE CTAB

Disusun oleh:

Nama : Lia Gustina

NIM : 1905101050030

Jadwal : Selasa, 08.00 – 10.00 WIB

LABORATORIUM GENETIKA DAN PEMULIAAN TANAMAN

JURUSAN AGROTEKNOLOGI

FAKULTAS PERTANIAN

UNIVERSITAS SYIAH KUALA

2020
 KATA PENGANTAR

Syukur alhamdullilah, sampai saat ini Allah masih memberi kesehatan dan
kesempatan untuk penyusun Laporan Pratikum Genetika Dasar dengan judul materi
Ekstraksi DNA Tanaman Dengan Metode CTAB. Laporan ini disusun untuk memenuhi
kewajiban seorang mahasiswa yang mengambil Program Studi Agroteknologi.

Rasa terima kasih juga diucapkan kepada semua pihak yang telah membantu dalam
penyusunan laporan ini sehingga dapat selesai dengan baik. Saya selaku penulis berharap
laporan ini dapat memberi pengetahuan yang berkah bagi pembacanya dan bagi penulis
sendirimengharapkan saran atau kritikan yang dapat memperbaiki kesalahan kesalahan
dalam laporan ini.

Banda aceh, 17 Mei 2020

Penulis

i
 DAFTAR ISI

Kata Pengantar……………………………………………………………………………..i

Daftar Isi…………………………………………………………………………………...ii

ABSTRACT……………………………………………………………………………….iii

ABSTRAK…………………………………………………………………………………iv

I. PENDAHULUAN……………………………………………………………………….1

1.1. Latar Belakang…………………………………………………………………………1

1.2. Tujuan khusus……………………………………………………………………..……3

II. TINJAUAN PUSTAKA………………………………………………………………..4

III. METODE PRAKTIKUM…………………………………………………………….7

3.1. Tempat dan Waktu……………………………………………………………………..7

3.2. Bahan dan Alat…………………………………………………………………………7

3.3. Metode Pelaksanaan Praktikum………………………………………………………..7

IV. HASIL DAN PEMBAHASAN………………………………………………………10

4.1. Hasil Pengamatan…………………………………………………………………..…10

4.2. Pembahasan………………………………………………………………………...…12

V. KESIMPULAN………………………………………………………………………..15

DAFTAR PUTAKA……………………………………………………………………...16

LAMPIRAN……………………………………………………………..,……………….18

ii
 ABSTRACT

Molecular markers have been used extensively to study genetic relationships in number of
crops. One of the techniques that can be used to obtain DNA finger print is RAPD
(random amplified polymorphic DNA) technique, a molecular technique based on PCR
technology. The quality of amplification products depend on several factors such as MgCl2
concentration, primers, PCR condition and DNA quality. In this study, an experiment was
conducted to find out appropriate DNA isolation technique for three accessions Jatropha
curcas (Karangtengah, Lamongan and NTB). Three DNA isolation technique has been
tested and two of them were able to produce good quality of genomic DNA. The results
therefore indicate that the technique can be used to genomic DNA isolation of Jatropha
curcas on molecular analysis.

Keywords: Molecular; PCR,RAPD.

iii
 ABSTRAK

Penanda molekuler telah digunakan secara luas untik untuk mempelajari hubungan genetic
dalam jumlah. Salah satu tekhnik yang dapat digunakan untuk memperoleh sidik jari DNA
adalah tekhnik RAPD crop (RAPD crops (random amplified polymorphie DNA), teknik
molekuler berbasis teknologi PCR. Kualitas produk amplifikasi tergantung pada beberapa
factor seperti konsentrasi MgC12,primer,kondisi PCr dan Kualitas DNA. Dalam
penelitiana ini percobaan untuk memgetahui teknik isolasi DNA yang tepat untuk tiga
aksesi jatrhopha curcas (karangtengah, lamogan dan NTB). Tiga teknik isolasi DNA telah
diuji dan dua diantara nya mapu menghasilkan kualitas DNA genom yang baik. Oleh
karena itu hasil menunjukkan bahwa teknik ini dapat digunakan untuk isolasi Dna genom
jathropa curcas pada analisis molekuler.

Kata Kunci : Molekuler, PCR, RAPD

iv
 I. PENDAHULUAN

1.1. Latar Belakang

Pemanfaatan minyak jarak pagar (Jatropha curcas L) sebagai bahan biodiesel
merupakan salah saru alternatif untuk mengantisipasi meningkatnya permintaan bahan
bakar. Minyak jarak pagar selain merupakan sumber minyak terbarukan (reneweble fuels)
juga termasuk non edible oil sehingga tidak bersaing dengan kebutuhan konsumsi manusia
seperti pada minyak kelapa sawit, minyak jagung dsb. Secara agronomis tanaman jarak
pagar cukup sesuai untuk dibudidayakan dengan kondisi agroklimat di Indonesia; bahkan
pada kondisi kering dan pada lahan marginal. Akan tetapi ada berbagai permasalahan yang
dihadapi antara lain belum adanya varietas unggul dan masih terbatasnya pendekatan
molekuler dalam pemuliaan tanaman pagar.
Tanaman jarakpagar termasuk dalam famili Euphorbiacae, di mana genus Jatropha
memiliki 175 spesies. Dari jumlah tersebut lima spesies ada di Indonesia, yaitu Jatropha
curcas L dan Jatropha gossypiifolia yang sudah digunakan sebagai tanaman obat.
sedangkan Jatropha integerrima Jacq, Jatropha multifida dan Jatropha podagrica Hook
digunakan sebagai tanaman hias. Dalam perkembangan dewasa ini, species Jatropha curcas
L. menarik minat karena sifat minyaknya yang dapat digunakan untuk substitusi minyak
diesel dan dapat dimanfaatkan sebagai bahan biodiesel.
Pemuliaan tanaman jarak pagar hingga saat ini masih terbatas pada seleksi dan uji
lapang dengan menggunakan karakter morfologi dalam upaya mendeskripsikan tanaman.
Dalam hal ini, kebanyakan karakter yang nampak merupakan interaksi genetik dan kondisi
lingkungan. Oleh karen itu, diperlukan adanya upaya analisis molekuler pada tanaman
jarak pagar. Teknik biologi molekuler telah memberikan peluang untuk mengembangkan
dan mengidentifikasi peta genetik dari suatu kultivar tanaman. Pendekatan genetika
molekuler dengan menggunakan penanda DNA telah berhasil membentuk penanda
molekuler yang mampu dalam mendeteksi gen dan sifat-sifat tertentu, evaluasi keragaman
dan evolusi pada tingkat genetik (Hoon-Lim et al. 1999). Beberapa teknik penanda DNA
tersebut adalah Restriction Fragment Length Polymorphism, Amplified Fragment Length
Polymorphism dan Random Amplified polymorphic DNA.

1
 Penggunaan penanda RAPD didasarkan pada pertimbangan antara lain : informasi
susunan nukleotida dalam DNA tidak perlu diketahui terlebih dahulu, relatif sederhana dan
mudah preparasinya, hanya perlu sejumlah kecil DNA dan memberikan hasil lebih cepat
dibandingkan beberapa penanda molekuler lain. Analisis sidik jari DNA tanaman jarak
didasarkan pada jumlah, frekuensi dan distribusi alel-alel DNA berdasarkan penanda
RAPD yang telah diperoleh. beberapa hal diatas mendasari pemikiran diperlukan adanya
upaya analisis molekuler pada tanaman jarak pagar dengan menggunakan penanda RAPD.
Program pemuliaan tanaman, diperlukan identifikasi baik karakter morfologi maupun
molekuler untuk menguji keragaman genotip klon-klon yang akan dipilih untuk tetua
persilangan (Schnell et al. 1995). Pemakaian teknik RAPD memiliki resolusi yang
sebanding dengan RFLP dalam hal analisis kekerabatan antar genotip (dos Santos et al.
1994) dan mampu menghasilkan jumlah karakter yang tidak terbatas sehingga sangat
membantu dalam analisis keragaman genetik tanaman yang tidak diketahui latar belakang
genomnya (Liu dan Furnier, 1993). Analisis RAPD hanya memerlukan sejumlah kecil
DNA sehingga sangat sesuai untuk species tanaman berkayu (Rowland dan Levi 1994).
RAPD memerlukan biaya lebih rendah dibandingkan biaya untuk uji kekerabatan
berdasarkan anaisis DNA yang lain. Metode RAPD menggunakan primer dengan ukuran
sepuluh basa sering digunakan untuk studi kekerabatan, identifikasi varietas (CIMMYT,
1998), pemetaan genetik, analisis struktur DNA organisme dan finggerprinting suatu
individu organisme. Teknik RAPD menggunakan primer acak maupun spesifik telah
terbukti dapat digunakan sebagai penanda molekuler untuk berbagai karakter agronomis
penting. Pemakaian marka molekuler RAPD banyak digunakan untuk menyusun
kekerabatan beberapa individu dalam spesies maupun kekerabatan antar spesies.
Penggunaan kekerabatan ini dapat dijadikan rujukan dalam pemuliaan persilangan untuk
mendapatkan keragaman yang tinggi dari hasil suatu persilangan (Maftuchah, 2001).
Proses isolasi DNA genom tanaman, keberadaan polisacharida dan senyawa metabolit
sekunder dalam sel tanaman sering menyulitkan dalam proses isolasi asam nukleat.
Struktur polisacharida yang mirip dengan asam nukleat akan menyebabkan polisacharida
tersebut akan mengendap bersama dengan asam nukleat. Penambahan senyawa pereduksi
sepertri marchaptoetanol dan dithiothreitol dapat mencegar proses oksidasi senyawa
fenolik sehingga menghambak aktivitas radikal bebas yang dihasilkan oleh oksidasi fenol
terhadap asam nukleat (Wilkins dan Smart, 1996).

2
 Metabolit sekunder dan polisacharida juga dapat menghambat kerja enzim
Adanya polosacharida dalam tanaman ditandai dengan kekentalan pada hasil isolasi DNA
yang menyebabkan kesulitan dalam reaksi PCR akibat penghambatan aktivitas Taq
polymerase (Fang et al., 1992 dalam Porebski et al, 1997) Oleh karena itu diperlukan suatu
teknik isolasi DNA genom tanaman yang tepat sehingga diperoleh kualitas DNA yang baik
bagi proses amplifikasi PCR.

2.1. Tujuan Penelitian

Tujuan penelitian ini adalah Hasil penelitian ini diharapkan akan diperoleh DNA
genomik tanaman jarak pagar dan metode isolasi DNA yang sesuai pada tanaman jarak
pagar (Jatropha curcas L.) sebagai materi dalam proses amplifikasi PCR.

3
 II. TINJAUAN PUSTAKA

A biological sample obtained from a crime scence in the form of bloond or semen stain
or a liquid blood smaple from a suspect or a paternity case cointains a number of sustances
besides DNA. DNA molekuler must be saparated from other cellular material before they
can be examined. Cellular protein that package and protect DNA in the environment of the
cell can inhibitit the ability to anlyze the DNA. Therefore, DNA extraction merhods heve
been develoved to separate proteins and other cellular materials from the DNA molecules.
In addition, the quality and quantity of DNA oftenneed to be mecaured prior to procceding
further with analytical procedures to ensure optimal result (Butler, 2006).
The detection of high moleculer organic compounds in ancient remains has turned out
to open a new research area with many implications, the most important being the
ekstraction of ancient DNA from fossils, subfpssil remain, artifact, tarces from biological
sources, and museum speciments. Since this technique provides acces to the basic
molecules of organismic evalution, it opens up the possibility unlimitid the scale. The
introduction of moleculer cloning techniques initiated a breakthrough in the search for a
DNA (Hermann, 1994).
Kualitas DNA yang baik yang diperoleh dari hasil ekstraksi merupakan syarat dasar
yang harus dipenuhi dalam studi molekuler, terutama dalam penandaan sidik jari DNA.
Cetyl Trimethyl Ammonium Bromide (CTAB) merupakan metodeyang umum digunakan
dalam ekstraksi DNA tanaman yang banyak mengandung polisakarida dan senyawa
polifenol (Lumaret et al., 1998; Jose danUsha, 2000). Ada tiga langkah utama dalam
ekstraksi DNA, yaitu perusakan dinding sel (lisis), pemisahan DNA dari bahan padat
seperti selulosa dan protein, serta pemurnian DNA (Nicholl, 1993;Surzycki, 2000).
Perkembangan ilmu pengetahuan sangat pesat dewasa ini, di antaranya ilmu biologi
molekuler yang memungkinkan diperolehnya suatu marka gen yang mengendalikan
karakter target perbaikan dalam program pemuliaan tanaman. Penemuan teknik dalam
memperoleh gen yang mengendalikan suatu karakter sebagai penanda atau marker
molekuler, sangat membantu efektivitas maupun efisiensi dari pelaksanaan proses seleksi
yang akan dilakukan. Marka molekuler berdasarkan polimorfisme yang terdeteksi pada
tingkat makro molekul di dalam sel (Gupta et al.,2002).

4
 Seiring dengan berkembangnya ilmu pengetahuan yang mampu mendukung akselerasi
kemajuan dari seleksi untuk mendapatkan karakter yang diinginkan, berbagai metode
seleksi juga berkembang, antara lain adalah seleksi dilakukan pada tingkat gametofit dan
sporofit (Ottaviano danSari-Gorla, 1993), seleksi secara in vitro (Wenzeldan Foroughi-
Webr, 1993), dan seleksi tingkat molekuler (Arus dan Morino-Gonzales, 1993)
(Syafaruddin, 2011).
Ekstraksi DNA merupakan salah satu tahap penting dalam kegiatan berbasis molekuler.
Permasalahan utama yang sering muncul dalam proses ekstraksi DNA tanaman adalah
kehadiran senyawa kontaminan pada sampel yang diisolasi seperti senyawa polisakarida,
polifenol, protein, RNA, dan senyawa metabolit sekunder (VARMA etal., 2007). Menurut
FATCHIYAH etal. (2011), beberapa permasalahan yang sering muncul saat ekstraksi
DNA yaitu DNA patah-patah selama proses ekstraksi, DNA mengalami degradasi akibat
kehadiran enzim nuklease, adanya kontaminasi senyawa polisakarida, dan ikut
terisolasinya senyawa metabolit sekunder. RANJAN etal. (2010) menyatakan bahwa
kehadiran senyawa kontaminan tersebut dapat menghambat berbagai proses mulai dari
pemotongan DNA, amplifikasi, hingga kloning. Jarak merupakan salah satu tanaman yang
daunnya memiliki kandungan getah yang cukup tinggi sehingga mempersulit proses
isolasi DNA. Menurut DEVAPPA etal. (2011) getah jarak mengandung senyawa terpene,
diterpene, dan metabolit sekunder lain (Nugroho, 2016).
Ekstraksi DNA merupakan teknik untuk mengeluarkan DNA dari sumber asal, inti sel
atau organel sel (DNA kloroplas, DNA mitokondria). DNA dapat diekstraksi dari sampel
jaringan yang masih segar, beku, dikeringkan atau disimpan dalam alkohol atau buffer.
Untuk mengurangi dampak studi populasi telah dikembangkan prosedur ekstraksi DNA
yang noninvasif, seperti dengan memanfaatkan rambut, tinja dan lainnya. Prosedur
ekstraksi mulai dengan penumbukan mekanik untuk memisahkan sel dan menghancurkan
membran sel dan atau dinding sel, sedangkan untuk inti penuh (budidaya dan jaringan sel
seperti darah tidak membutuhkan tumbukan mekanik). Jaringan lalu dimasukan di dalam
larutan yang mengandung detergen yang melilismembrane inti, juga proteinase yang
mendenaturasi protein lain, terutama nukelase, tetapi meninggalkan asam nukleat utuh.
Protein dipisahkan dari asam nukleat melalui ekstraksi dengan senyawa organic (biasanya
fenol dan kloroform), dan DNA dimurnikan dari reagen dalam buffer ekstraksi melalui
presipitasi alcohol atau dialysis.

5
 Pemisahan mtDNA dan cpDNA dari DNA genom sangat ekstensif prosedurnya,
melibatkan lapisan larutan jaringan pengurai pada gradient sesium klorida adalah subjek
pada sentrifugasi kecepatan tinggi. Pemisahan DNA organel dan inti tidak membutuhkan
untuk banyak prosedur yang mendeteksi marker apakah inti atau organel melalui aplikasi
pelacak tepat atau primer untuk genom total DNA. Protokol ekstraksi rinci telah
dikembangkan untuk banyak jaringan dan jenis DNA spesies berbeda. Pencarian cepat
melalui literature seharunya mengungkap protocol tepat untuk organisme khusus.
Kebanyakan prosedur ekstraksi dilengkapi dalam volume kecil tabung mikrofuge (1.5 mL),
mengfasilitasi penelitian biologi populasi yang membutuhkan sampel dari jumlah besar
individu (Partnership for Enhanced Engagement in Research (PEER), 2012).

6
 III. METODELOGI PRAKTIKUM

3.1.Waktu dan Tempat

Penelitian dilakukan di Laboratorium Molekuler Tanaman Pusat Pengembangan
Bioteknologi, Universitas Muhammadiyah Malang. Tanaman jarak pagar (Jatropha curcas
L.) yang dipergunakan berasal dari Kebun Koleksi Plasma Nutfah Jarak dari Balai
Penelitian Tanaman Tembakau dan Serat (BALITTAS) – Karangploso, Malang.

3.2.Bahan dan Alat

Aksesi jarak pagar yang dipergunakan dalam penelitian ini adalah Lamongan. Nusa
Tenggara Barat dan Karang Tengah. Isolasi DNA Genomik Tanaman Jarak (Jatropha
curcas L.)

3.3.Metode Pelaksanaan Praktikum

DNA genom tanaman jarak pagar (Jatropha curcas L.) diisolasi dari daun muda
tanaman jarak pagar. Prosedur ekstraksi DNA dari daun tanaman jarak pagar dilaksanakan
berdasarkan metode standar (Sambrook et al., 1989) dengan menggunakan bufer CTAB,
metode Doyle and Doyle (1990), serta metode Zheng et al (1995) dengan menggunakan
bufer pengekstrak SDS. Setelah DNA hasil isolasi dimurnikan, kemudian dilakukan
analisis melalui running agarose gell 0,8 %.
Metode CTAB (Sambrook et al., 1989).
Pada proses isolasi dengan metode CTAB (Sambrook et al., 1989) dilakukan
pembuatan bufer lisis (yang terdiri atas 0,2 M Tris-Cl pH 7,5 ; 0,05M EDTA pH 8,0 ;
2 M NaCl ; 2 % CTAB) dan buffer ekstraksi (terdiri dari 0,35 M sorbitol ; 0,1 M Tris-Cl
pH 7,5 ; 5 mM EDTA ; dH2O). Potongan daun dimasukkan tabung 1,5 ml yang telah
didinginkan dalam es, kemudian daun digerus dengan bantuan nitrogen cair. Setelah itu
ditambahkan bufer isolasi DNA (campuran bufer lisis, bufer ekstraksi dan sarcocyl).
Suspensi divortex sampai tercampur merata, kemudian diinkubasi selama 1 jam, pada suhu
65o C. Setelah 1 jam ditambah 750 µl kloroform - isoamil alkohol (24 : 1).

7
 Setelah homogen larutan disentrifugasi dengan kecepatan 12.000 rpm selama 5
menit, 40 C, lapisan atas diambil dan dimasukkan ke dalam tube 1,5 ml, kemudian
ditambahkan larutan isopropanol dan divortex perlahan. Sentrifugasi dilakukan selama 5
menit, 12.000 rpm, pada suhu 40C, kemudian supernatan dibuang. Pelet dicuci
menggunakan 500 µl EtOH 70 %, kemudian disentrifugasi 12.000 rpm, 3 menit dan
supernatan dibuang. Sentrifugasi dilakukan kembali dengan kecepatan 12.000 rpm, 1
menit, kemudian supernatan dibuang dengan mikropipet. Pelet dikeringkan dan dilarutkan
dengan 50 µl TE (10 mM Tris-HCl pH 8,0 ; 1 mM EDTA pH 8,0). DNA disimpan pada
suhu -200 C.
Metode CTAB (Doyle and Doyle, 1990).
DNA genomik jarak pagar diisolasi dengan menggunakan 200 mg daun, yang
dimasukkan ke dalam tabung eppendorf dan digerus dengan bantuan nitrogen cair. Ke
dalam tabung ditambahkan 750 µl bufer ekstraksi CTAB. Campuran tersebut divorteks lalu
diinkubasi dalam pemanas air selama 60 menit pada suhu 650 C. Setelah dibiarkan dingin
hingga suhu kamar, campuran tersebut ditambahkan dengan 750 µl kloroform - isoamil
alkohol ( 24 : 1 ). Campuran disentrifugasi selama 10 menit dengan kecepatan 12000 rpm
pada suhu 40C. Lapisan atas dimasukkan ke dalam tabung eppendorft lain yang
mengandung isopropanol dan dicampur merata. Setelah disentrifugasi selama 10 menit
11.000 rpm, endapan DNA dicuci dengan menambahkan etanol 76 % dan dikeringkan.
Endapan DNA yang telah kering dilarutkan dalam 25 µl bufer TE (10 mM Tris-HCl pH
8,0 ; 1 mM EDTA pH 8,0). DNA disimpan pada suhu -200 C.
Metode SDS (Zheng et al , 1995).
Pada pemakaian metode ekstraksi Zheng et al (1995), sebelum berlangsungnya
proses isolasi DNA dilakukan pembuatan bufer pengekstrak yang terdiri atas 25 mM
EDTA (pH 7,5), 50 mM TrisHCl (pH 8), 300 mM NaCl, SDS 1% dan H2O. Potongan
daun tanaman jarak pagar dimasukkan tabung 1,5 ml yang telah didinginkan dalam es,
kemudian digerus dengan menambahkan 400 ul buffer pengekstrak. Setelah cukup halus
ditambahkan 100 ul buffer pengekstrak. Setelah itu diambil 400 ul larutan dan ditambah
dengan 400 ul chloroform. Suspensi divortex sampai tercampur merata, kemudian dan
setelah homogen larutan disentrifus dengan kecepatan 13.000 rpm selama 1 menit pada
suhu 40C.

8
 Lapisan atas diambil dan dimasukkan ke dalam tube 1,5 ml, kemudian ditambahkan
800 µl Etabol absilut. Larutan disentrifugasi selama 3 menit, 13.000 rpm, pada suhu 40C,
kemudian supernatan dibuang. Pelet dicuci kembali dengan menggunakan 500 µl EtOH 70
%. Supernatan dibuang, kemudian endapan dicuci kembali dengan etanol 70%, dan
disentrifugasi 13.000 rpm, pada suhu 40C. Supernatan dibuang kembali, dan pelet
dikeringkan dengan menggunakan vakum. Setelah kering, pelet ditambah dengan 50 ul TE
dan DNA disimpan pada suhu -200C.
Hasil isolasi DNA dengan berbagai teknik tersebut kemudian dielektroforesis pada
0,8% gel agarosa pada kondisi 50V selama 30 menit. Deteksi dilakukan dengan
menggunakan UV transluminator dan dilakukan pemotretan gell.

9
 IV. HASIL DAN PEMBAHASAN

4.1. Hasil Pengamatan

Gambar 1. Hasil proses isolasi DNA tanaman jarak pagar dengan menggunakan bufer
CTAB (Sambrook et al., 1989) : Karang Tengah (baris 1, 2), Lamongan (baris 3, 4),
Lombok Barat (baris 5, 6)

Gambar 2. Hasil proses isolasi DNA tanaman Jarak Pagar dengan menggunakan bufer
CTAB (Doyle and Doyle, 1990) : Karang Tengah (baris 1, 2, 3), Lamongan (baris 4, 5,
6), Lombok Barat(baris7, 8, 9)

10
Gambar 3. Hasil proses isolasi DNA tanaman jarak pagar dengan menggunakan bufer SDS
(Zheng et.al., 1995) : Karang Tengah (baris 1), Lamongan (baris 2), Lombok Barat (baris
3).

11
4.2. Pembahasan

Salah satu keuntungan pemakaian analisis keragaman genetik tanaman dengan

menggunakan teknik molekuler yang memanfaatkan teknologi amplifikasi PCR adalah
kuantitas DNA yang diperlukan hanya sedikit. Disamping itu, dalam pelaksanaan teknik
RAPD tingkat kemurnian DNA yang dibutuhkan tidak perlu terlalu tinggi, atau dengan
kata lain teknik amplifikasi PCR relatif toleran terhadap tingkat kemurnian DNA.
Walaupun demikian, dalam suatu teknik isolasi DNA masih diperlukan suatu tahapan
untuk meminimalkan senyawa-senyawa kontaminan yang dapat mengganggu reaksi PCR
seperti polisacharida dan metabolit sekunder. Hal ini disebabkan keberadaan polisacharida
dan metabolit sekunder dalam sel tanaman sering menyulitkan dalam isolasi asam nukleat
(Wilkins and Smarts, 1996). Dalam penelitian ini, DNA genom tanaman jarak pagar
diisolasi dari daun muda tanaman jarak. Sampel daun dipilih dari individu tanaman jarak
pagar yang sehat dengan pemakaian sampel dari masing-masing aksesi yang diuji (Karang
tengah, Lamongan dan Lombok Barat).

Tahap awal dilakukan isolasi DNA genomik tanaman jarak pagar dengan
menggunakan prosedur ekstraksi DNA yang menggunakan bufer pengekstrak CTAB
berdasarkan metode Sambrook et al. (1989). Bufer yang dipergunakan terdiri dari 0,2 M
Tris-Cl pH 7,5 ; 0,05M EDTA pH 8,0 ; 2M NaCl ; 2% CTAB ; 0,35 M sorbitol ; 0,1 M
Tris-Cl pH 7,5 ; 5 mM EDTA dan dH2O. Namun dengan penggunaan prosedur ekstraksi
CTAB tersebut ternyata belum dapat menghasilkan DNA genom yang optimal (Gambar
1). Dari hasil elektroforesis terlihat bahwa kualitas DNA yang dihasilkan belum optimal,
oleh karena itu proses isolasi selanjutnya dicoba dengan menggunakan metode isolasi
DNA genomik yang lain.

Proses ekstraksi DNA jarak pagar, setelah penambahan bufer pengekstrak CTAB
pada daun yang telah dihaluskan , terbentuk larytan yang sangat kental, yang meunjukkan
tingginya kandungan polisacharida. Selain polisacharida, kandungan senyawa fenolik jarak
pagar juga cukup tinggi, hal ini dapat dilihat dari cepatnya pencoklatan pada ujung daun
yang dipotong. Adanya polisacharida dan senyawa metabolit sekunder dalam sel tanaman
sering menyulitkan dalam proses isolasi asam nukleat. Struktur polisacharida yang mirip
dengan asam nukleat akan menyebabkan polisacharida tersebut akan mengendap bersama
dengan asam nukleat.

12
 Proses isolasi DNA tanaman, penambahan senyawa pereduksi sepertri
marchaptoetanol dan dithiothreitol dapat mencegah proses oksidasi senyawa fenolik
sehingga menghambak aktivitas radikal bebas yang dihasilkan oleh oksidasi fenol terhadap
asam nukleat (Wilkins dan Smart, 1996). Metabolit sekunder dan polisacharida juga dapat
menghambat kerja enzim Adanya polosacharida dalam tanaman ditandai dengan
kekentalan pada hasil isolasi DNA yang menyebabkan kesulitan dalam reaksi PCR akibat
penghambatan aktivitas Taq polymerase (Fang et al., 1992 cit Porebski et al, 1997).

Tahap selanjutnya diujikan prosedur isolasi DNA tanaman jarak pagar dengan
menggunakan buffer pengekstrak CTAB berdasarkan metode Doyle and Doyle (1990).
DNA genomik tanaman jarak pagar diisolasi dengan menggunakan 200 mg daun, yang
ditambahkan bufer ekstraksi CTAB. Campuran tersebut divorteks lalu diinkubasi dalam
pemanas air dan setelah dingin hingga suhu kamar ditambah dengan kloroform - isoamil
alkohol. Hari hasil running elektroforesis gel agarose menunjukkan metode tersebut dapat
menghasilkan DNA genom jarak pagar Karangtengah, Lamongan dan NTB dengan
kuantitas dan kualitas yang cukup baik (Gambar 2).

Pemakaian prosedur isolasi DNA tanaman jarak pagar dengan menggunakan

buffer pengekstrak Sodium Dodecyl Sulfate (Zheng et.al., 1995) larutan buffer yang
dipergunakan terdiri atas 25 mM EDTA pH 7,5, 50 mM Tris HCl, pH 8 300 mM Na Cl,
1% Sodium Dodecyl Sulfate dan dH2O. Dengan menggunakan teknik tersebut telah
berhasil diperoleh DNA genom tanaman jarak pagar aksesi Karang Tengah, Lamongan dan
NTB dengan kualitas DNA yang cukup baik (Gambar 3.).

Pada umumnya ekstraksi DNA tanaman dilaksanakan dengan menggunakan bufer

pengekstrak SDS (sodium dodecyl sulphate) dan CTAB (cetyltrimetilammonium bromide).
Perlakuan lisis sel dengan menggunakan detergen non ionik CTAB menghasilkan kuantitas
DNA yang cukup tinggi terutama dari jaringan segar, dengan jumlah DNA yang dihasilkan
bervariasi tergantung pada species dan kondisi awal material yang digunakan (Ausubet et
al., 1994). Pada tanaman dengan kandungan polisacharida dan metabolit sekunder tinggi
perlu dilakukan modifikasi pada saat ekstraksi DNA.

13
 Untuk menghilangkan polisacharida ekstraksi lisat dengan menggunakan kloroform
disarankan dibandingkan dengan kloroform/isoamil alkohol karena lebihn efisien untuk
mengisolasi asam nukleat (Ausubet et al., 1994). Secara umum hasil penelitian ini
menunjukkan bahwa dengan pemakaian tiga metode isolasi DNA genom yang diujikan
maka dihasilkan dua metode yang mampu menghasilkan DNA genom jarak pagar dengan
kuantitas dan kualitas yang baik, yaitu metode Doyle and Doyle (1990) yang menggunakan
bufer CTAB (cetyltrimetilammonium bromide) dan metode Zheng et.al., (1995) yang
menggunakan bufer pengektrak SDS (sodium dodecyl sulphate)

14
 V. PENUTUP

5.1.Kesimpulan
Metode isolasi DNA berdasarkan metode Doyle and Doyle (1990) yang
menggunakan bufer CTAB (cetyltrimetilammonium bromide) dan metode Zheng et.al.,
(1995) yang menggunakan bufer pengektrak SDS (sodium dodecyl sulphate) sesuai untuk
dipergunakan dalam isolasi DNA genom tanaman jarak pagar.

15
 DAFTAR PUSTAKA

Ausubel, F.M., Brent, R., Kongston, R.E., Moore, D.D., Saidman, J.G., Smith J.A.,
and Stuhl, K. 1994. Current protocols in molecular biology. New York. John
Wiley and Sons. Inc.
CIMMYT, 1998. Molecular Marker Applications to Plant Breeding. In: Amboinet’s
First Training Workshop, 9 November-4 Desember, El Batan, Mexico.76 p.
Correa, R. X.,Ricardo V. A., Fabio G. F. Cosme D. C., Maurilio A. M., dan Everaldo
G. B., 1999. Genetic Distance in Soybean Based on RAPD Markers. (On line),
http:// www.scielo.br/scielo.php diakses 22 April 2004.
Doyle J.J and Doyle J.L. 1990. Isolation of plant DNA from fresh tissue. Focus.
Moscow. 12(1):13-15.
dos Santos JB, Nienhuis J, Skruch P, Tivang J and Slokum MK. 1994. Comparison
of RAPD and RFLP genetic markers in determining genetic similarity among
Brassica oleracea L. genotypes. Theor. Appl Genet. 87:909-915.
Hoon-Lim S, Peng Teng PC, Lee YH, and Goh CJ. 1999. RAPD analysis of some spec
ies in the genus vanda (orchidaceae). Annuals of Botany. 83:193-196.
Liu Z and Furnier GR. 1993. Comparison of allozyme, RFLP and RAPD markers
for revealing genetic variation within and between Trembling Aspen and Bigtooth
Aspen. Theor. Appl. Genet. 87:97-105.
Maftuchah. 2001. Strategi pemanfaatan penanda molekuler dalam perkembangan
bidang hortikultura. Makalah Sarasehan Pemanfaatan Penanda Molekuler di
Bidang Hortikultura. Perhorti Jatim – Deptan.
Porebski, S., Bailey, L.G., and Baum, B.R. 1997. Modification of CTAB DNA
extractions protocol for plants cotaining high polysacharide and polyphenol
components. Plant Molec Biol reporter 15: 8-15

16
Sambrook J., E.F. Fritsch and Maniatis, T. 1989. Molecular Cloning : A
laboratory Manual. 2nd Edition. Cold Spring Harbor Laboratory Press. USA.
Schnell RJ., CM. Ronning and RJ. Knight. 1995. Identification of cultivars and
validation of genetic relationships in Mangifera indica L. using RAPD markers.
Theor. Appl. Genet 90:269-274.
69Maftuchah, Pengembangan Metode Isolasi DNA Genom Pada Tanaman Jarak
Pagar (Jatropha Curcas)
Zheng K, Huang N, Bennet P. and Khush GS. 1995. PCR-based marker assisted
selection in rice breeding. IRRI news lett 2.Wilkins, T.A. and Smart, L.B.. 1996
Isolation of RNA from Plant Tissue. Di dalam: Krieg, P.A. (ed). A Laboratory
Guide to RNA. Isolation, Analysis a
nd Synthesis. New York: Wiley – Liss.

17
LAMPIRAN

18