TEKNIK ISOLASI BAKTERI,PENGECATAN DAN MORFOLOGI BAKTERI

Dimas Arya Saputra, 21982, STPK

Abstrak

Mikroorganisme dapat diperoleh dari lingkungan air, tanah, udara, substrat yang berupa bahan pangan, tanaman, dan hewan.
Teknik isolasi mikroorganisme adalah suatu usaha untuk menumbuhkan mikroba diluar dari lingkungan alamiahnya.
Pemisahan mikroorganisme dari lingkungan ini bertujuan untuk memperoleh biakan bakteri yang sudah tidak bercampur lagi
dengan bakteri lainnya dan disebut biakan murni. Pewarnaan Gram adalah prosedur pewarnaan diferensial yang dapat
membedakan jenis bakteri berdasarkan reaksi yang timbul pada struktur dinding sel selama prosedur pewarnaan. Prosedur
pewarnaan gram dapat membantu mengidentifikasi organisme. Teknik pewarnaan gram tersebut dapat menghasilkan warna
merah dan ungu. Bakteri gram negatif ditandai dengan pewarnaan ungu sedangkan yang positif berwarna merah. Hal ini
bertujuan untuk memberikan warna pada bakteri pada akhirnya dapat diidentifikasi dengan mudah. Selain itu, ada endospore
yang bisa diwarnai. Endospora adalah organisme yang dibentuk dalam kondisi yang stres karena kurang nutrisi, yang memiliki
kemungkinan untuk tetap berlanjut di lingkungan sampai kondisi menjadi baik. Teknik pewarnaan gram haruslah sesuai
prosedur karena dapat mengakibatkan kesalahan identifikasi data apakah gram positif atau gram.

Kata kunci : Isolasi bakteri; Pengecatan gram; Morfologi; Mikroorganisme.

1. PENDAHULUAN

Di dalam bidang ilmu mikrobiologi, untuk dapat menelaah bakteri khususnya dalam skala laboratorium, maka
terlebih dahulu kita harus dapat menumbuhkan mereka dalam suatu biakan yang mana di dalamnya hanya terdapat
bakteri yang kita butuhkan tersebut tanpa adanya kontaminasi dari mikroba lain. Biakan yang semacam ini biasanya
dikenal dengan istilah biakan murni. Untuk melakukan hal ini, haruslah dimengerti jenis-jenis nutrient yang
disyaratkan bakteri dan juga macam lingkungan fisik yang ,menyediakan kondisi optimum bagi pertumbuhan
bakteri tersebut (Pelczar, 1986).

Teknik isolasi mikroorganisme adalah suatu usaha untuk menumbuhkan mikroba diluar dari lingkungan
alamiahnya. Pemisahan mikroorganisme dari lingkungan ini bertujuan untuk memperoleh biakan bakteri yang
sudah tidak bercampur lagi dengan bakteri lainnya dan disebut biakan murni. Prinsip dari isolasi mikroba adalah
memisahkan satu jenis mikroba dengan mikroba lainnya yang berasal dari camouran bermacam-macam mikroba.
Hal ini dapat dilakukan dengan menumbuhkannya dalam media padat, sel-sel mikroba akan membentuk koloni sel
yang tetap pada tempatnya (Nur dan Asnani, 2007).

Dikenal beberapa cara atau metode untuk memperoleh biakan murni dari suatu biakan campuran. Dua
diantaranya yang paling sering digunakan adalah metode cawan gores dan metode cawan tuang. Yang didasarkan
padda prinsip pengenceran dengan maksud untuk memperoleh spesies individu. Dengan anggapan bahwa setiap
koloni dapat terpisah dari satu jenis sel yang dapat diamati (Afrianto, 2004).

Pewarnaan gram merupakan salah satu prosedur yang paling banyak digunakan untuk mencirikan banyak
bakteri. Dari pewarnaan gram dapat diketahui morfologi sel antara lain sifat gram, bentuk sel, dan penataan sel.
Pewarnaan gram atau metode gram adalah suatu metode empiris untuk membedakan spesies bakteri menjadi dua
kelompok besar, Gram positif dan gram negatif, berdasarka sifat kimia dan fisika dinding sel mereka, metode ini
diberi nama berdasarkan penemunya, ilmuwan denmark hans Christian gram 1884. Pewarnaan Gram dibagi
menjadi dua yaitu pewarnaan majemuk karena menggunakan lebih dari satu macam zat warna. Dan pewarnaan
diferensial karena pewarnaan ini mampu mengdeferensiasi atau membedakan bakteri, sehingga bakteri dapat
digolongkan menjadi dua yaitu Gram negatif dan Gram positif.

Teknik pewarnaan gram haruslah sesuai prosedur karena dapat mengakibatkan kesalahan identifikasi data
apakah gram positif atau gram negatif sehingga diperlukan adanya praktikum ini dilakukan agar mengetahui
jalannya mekanisme pewarnaan gram.

Menurut bentuk dan struktur selnya makhluk hidup dibedakan menjadi dua yaitu makhluk hidup bersel banyak
dan makhluk hidup bersel satu, makhluk ini tidak dapat terlihat dengan mata kita,  karena panca indra manusia
memiliki kemampuan daya pisah atau daya lihat yang sangat terbatas. Oleh karena itu banyak masalah mengenai
benda atau organisme yang akan diamati dan pengamatan itu hanya bisa dilakukan dengan menggunakan alat
bantu. Morfologi suatu mikroba dapat diperiksa dalam keadaan hidup maupun mati. Pemeriksaan morfologi ini
penting untuk mengenal nama bakteri, pengenalan sifat fisiologisnya yang kebanyakan merupakan faktor penentu
dalam mengenal nama spesies. Bagian-bagian sel dapat dilihat dengan terlebih dahulu memberi warna dimana
warna bisa bersifat asam, netral, maupun basa.

Bakteri dapat digolongkan menjadi dua kelompok yaitu Gram positif dan Gram negatif didasarkan pada
perbedaan struktur dinging sel. Pada umumnya bakteri gram negatif lebih tahan terhadap aktivitas antimikroba
dibandingkan dengan bakteri gram positif. Perbedaan daya tahan ini disebabkan karena perbedaan komponen
penyusun dinding sel .

Sel-sel individu bakteri dapat berbentuk seperti elips, bola, batang, atau spiral.Masing-masing ciri ini penting
dalam mencirikan morfologi suatu spesies. Sel bakteri yang berbentuk seperti bola atau elips dinamakan kokus.
Kokus mucul dalam beberapa penataan yang khas tergantung pada spesiesnya. Sel berbentuk silindris atau batang
dinamakan basilus.Ada banyak perbedaan dalam ukuran panjang dan lebar di antara berbagai spesies basilus. Ujung
beberapa basilus tampak persegi, yang lain bundar, dan yang lain lagi meruncing atau lancip seperti ujung cerutu.
Kadang-kadang basilus tetap saling melekat satu sama lainnya, ujung dengan ujung, sehingga memberikan
penampilan rantai (Funke et al, 2004).

Bakteri berbentuk spiral terutama dijumpai sebagai individu-individu sel yang tidak saling melekat.Tercakup di
dalam kelompok morfologis ini adalah spiroketa, beberapa diantaranya menyebabkan penyakit yang berbahaya bagi
manusia.Individu-individu sel dari spesies yang berbeda-beda menunjukkan perbedaan-perbedaan yang mencolok
dalam hal panjang, jumlah, dan amplitudo spiralnya serta kekakuan dinding selnya. Sebagai contoh, beberapa
spirilum berukuran pendek, spiralnya berpilin ketat; yang lain sangat panjang dan menunjukkan sederetan pelintiran
dan lengkungan. Spiral yang pendek dan tidak lengkap disebut sebagai bakteri koma, atau vibrio (Holt dan Bergey,
1994).

2. MATERIAL DAN METODE

2.1 Material

Bahan-bahan yang digunakan pada praktikum kali ini adalah Medium NA, alcohol, bakteri escherichia coli dan
bacillus subtilis, kertas payung.

2.2 Alat/Instrumen

Alat-alat yang digunakan dalam melakukan praktikum kali ini adalah gelas beaker, tabung reaksi, pipet ukur,
ball pipet, hotplate, cawan petri, autoklaf, incubator, bunnsen dan ose.

2.3 Prosedur Kerja

2.3.1 Isolasi Bakteri

2.3.1.1 Cara goresan
1. Mengambil larutan NA dan di masukan kedalam tabung reaksi
2. Sterilkan dengan menggunakan autoklaf selama 20 menit dengan suhu 121•c.
3. Cairkan MNA tegak dalam pemanas air
4. Dinginkan sampai temperature kurang dari 50•c
5. Tuangkan MNA tegak tersebut ke dalam petridish steril secara aseptik,biarkan sampai
dingin dan padat
6. Ambil satu ose suspense bahan yang mengandung bakteri secara aseptic,kemudian buat
gorasan pada permukaan agar
7. Bungkus dan beri etiket dan inkubasikan selama 48 jam secara terbalik pada suhu kamar
8. Sesudah inkubasi akan tampak koloni-koloni yang terpisah-pisah
9. Amati dan hitung berapa macam koloni yang tumbuh dan berdasarkan bentuk koloni.

2.3.1.2 Cara taburan

1. Suspensikan bahan yang mengandung bakteri seencer mungkin, maksudnya agar kelak
 terjadi koloni-koloni yang terpisah-terpisah sehingga dengan mudah dapat diisolasi.
2. Cairkan MNA tegak dalam penangas air.
3. Dinginkan MNA tegak tersebut sampai temperatur kurang lebih 50•C, selanjutnya
inokulasikan dengan satu ose suspensi bahan yang mengandung bakteri. Gojog hati-hati
agar tercampur merata.
4. Tuangkan dalam petridish secara aseptik dan ratakan. Beri etiket, bungkus dan inkubasikan
selama 48 jam secara terbalik pada suhu kamar.

5. Amati dan hitung berapa macam koloni yang tumbuh berdasar bentuk koloni.

2.3.2 Pembuatan media

1. Pastikan Ruangan Praktikum Steril
2. Masukan 100 ml aquades ke gelas ukur
3. Tuangkan aquades tadi ke dalam erlenmeyer
4. Masukan MRS Broth sebanyak 5 gr ke erlemmeyer
5. Panaskan menggunakan Hotplate dengan suhu 50•c selama 5 menit sampai media larut
6. Pindahkan larutan MRS Broth kedalam tabung reaksi sebanyak 5 ml sebanyak 10 tabung
7. Berilah bakteri lactobacilus casei sebanyak 1 mikro demgan menggunakan alat mikro pipet dan
lakukan ke semua tabung
8. Tutup semua bahan dengan kapas,kertas payung dan alumunium foil dan akan dilakukan sterilisasi
9. Sterilkan bahan tadi menggunakan autoklaf selama 15 menit agar benar benar steril.

3. HASIL DAN PEMBAHASAN

Dari beberapa percobaan praktikum kali ini didapatkan hasil yang tertera dalam tabel sebagai berikut:

Tabel 1. Tabel Pengamatan sterilisasi dan pembuatan media

No Medium Awal Akhir

warna Jenis Warna Jenis

1 MNC Kuning Bening Cair Kuning Bening Cair

Kuning Bening Cair Kuning Bening Cair
Kuning Bening Cair Kuning Bening Cair
Kuning Bening Cair Kuning Bening Cair
2 MNA Tegak Kuning Bening Cair Kuning Keruh Padat
Kuning Bening Cair Kuning Keruh Padat

3 MNA Miring Kuning Bening Cair Kuning Keruh Padat

Kuning Bening Cair Kuning Keruh Padat

Medium merupakan bahan yang digunakan untuk menumbuhkan mikroorganisme di atas atau di dalamnya,
medium tersebut harus memenuhi syarat-syarat, antara lain adalah harus mengandung semua zat hara yang mudah
digunakan oleh mikroba, harus mempunyai tekanan osmosis, tegangan  permukaan dan pH yang sesuai dengan
kebutuhan mikroba yang akan ditumbuhkan, tidak mengandung zat-zat yang dapat menghambat  pertumbuhan
mikroba, harus berada dalam keadaan steril sebelum digunakan, agar mikroba yang di tumbuhkan dapat tumbuh
dengan baik (Hadioetomo, 1993).

Percobaan kali ini yaitu pembuatan medium NA.  NA (nutrient agar) digunakan sebagai media pertumbuhan
bakteri. Pembuatan medium percobaan ini dengan menggunakan NA (nutrient agar ), dimana dalam pembuatannya
terlebih dahulu dengan cara menimbang bahan yang akan digunakan kedalam neraca analitik sesuai dengan jumlah
yang diperlukan kemudian memasukkan bahan kedalam erlenmeyer 500 ml, dimana bahan tersebut adalah aquades
250 ml, NA 5s dan agar 5 gram setelah itu dipanaskan diatas hot plate 440ᵒC di ikuti oleh pengadukan dengan
menggunakan magnetic stirrer, tujuan dari pemanasan dan pengadukan ini adalah untuk menghomogenkan NA
dengan aquades, dimana dengan  pemanasan dapat mempercepat pelarutan dari NA dan aquades. Setelah
dipanaskan beberapa menit larutan berubah warna dari keruh menjadi kuning kecoklatan hal ini menandakan
larutan telah homogen. Kemudian dimasukkan kedalam autoklaf dengan mulut erlenmeyer disumbat dengan kapas
dan dilapisi kertas aluminium diluarnya. Tujuan dari penutupan ini agar meminimalkan kontaminasi. Pembuatan
NA berdasarkan konsistennya termasuk medium padat dan menurut kegunaannya termasuk medium umum.
Autoklaf adalah alat yang digunakan untuk sterilisasi. Autoklaf termasuk dalam teknik sterilisasi secara fisika
dengan prinsip arus uap dan tekanan. Alat ini sering digunakan dalam teknik pensterilan karena tingkat koefisien
dan sifat alat yang tidak merusak kandungan dalam media  pertumbuhan yang dipakai yaitu NA (Suriawiria, 2005).

Sterilisasi yang dilakukan bertujuan untuk menghindari kontaminasi, yaitu masuknya mikroorganisme yang
tidak diinginkan. Sterilisasi merupakan suatu proses (kimia dan fisika) yang membunuh semua bentuk hidup
terutama mikroorganisme (Suriawiria, 2005). Sterilisasi yang digunakan dalam  percobaan ini adalah secara fisika
yaitu menggunakan panas, dimana panas yang digunakan adalah bersama uap air yang biasanya disebut sterilisasi
basah.

4. KESIMPULAN

Sterilisasi merupakan proses untuk mematikan semua mikroorganisme yang hidup. Cara kerja sterilisasi ialah
cara kerja agar terhindar dari kontaminasi, cara steril ini digunakan pada pembuatan media, dan pembuatan
preparat. Sterilisasi dapat dilakukan dengan cara fisik, kimia, radiasi dan filter. Medium adalah substansi yang
terdiri atas campuran zat-zat makanan (nutrien) yang dipergunakan untuk pemeliharaan dan pertumbuhan
mikroorganisme.

REFERENSI

[1] Anonim. 2009. Petunjuk Praktikum Mikrobiologi. Universitas Indonesia: Jakarta.

[2] Dwidjoseputro, D. 1994. Dasar-Dasar Mikrobiologi. Djambatan: Jakarta.
[3] Hadioetomo, R. 1993. Teknik dan Prosedur Dasar Laboratorium Mikrobiologi. Gramedia: Jakarta.
[4] Irianto, Koes. 2006.  Mikrobiologi Jilid 1. Yrama Widya: Bandung.
[5] Pelgzar & Reid. 1958. Mycrobiology. Mc Graw-Hill Compan: Tokyo.
[6] Suriawiria, U. 2005. Mikrobiologi Dasar . Papas Sinar Sinanti: Jakarta.

LAMPIRAN
III. Screenshot kutipan jurnal yang dipakai