ACARA II

TEKNIK ISOLASI BAKTERI DAN PENGECATAN DAN MORFOLOGI BAKTERI

Dimas Arya Saputra

Abstrak

Pada praktikum kali ini memiliki 3 proses yaitu : mengisolasi bakteri, pengecatan bakteri dan mempelajari morfologi dari
bakteri tersebut. Dalam teknik isolasi bakteri akan menggunakan cara taburan dan cara goresan. Sedangkan pada proses
pengecatan bakteri dilakukan untuk memberi warna pada sel agar terlihat jelas dan kita lebih mudah mempelajari morfologi
dari bakteri tersebut. Tujuan dari dilakukannya praktikum ini adalah mengetahui teknik isolasi bakteri, mengetahui cara
pengecatan bakteri dan mengetahui morfologi bakteri. Adapun bahan yang di gunakan pada praktikum kali ini berupa medium
NA, bakteri escherichia coli dan bacillus subtilis. Hasil isolasi di dapatkan 2 sampel dari bakteri escherichia coli dan 2 sampel
dari bakteri bacillus subtilis, sedangkan pada pengecatan dan morfologi bakteri akan di dapatkan macam-macam bentuk koloni
pada bakteri escherichia coli dan bacillus subtilis dan perbedaan pengecatan negatif dan gram positif antara bakteri escherichia
coli dan bacillus subtilis.

Kata kunci : Isolasi; Pengecatan; Morfologi; Mikroorganisme; Bakteri.

1. PENDAHULUAN

Di dalam bidang ilmu mikrobiologi, untuk dapat menelaah bakteri khususnya dalam skala laboratorium, maka
terlebih dahulu kita harus dapat menumbuhkan mereka dalam suatu biakan yang mana di dalamnya hanya terdapat
bakteri yang kita butuhkan tersebut tanpa adanya kontaminasi dari mikroba lain. Biakan yang semacam ini biasanya
dikenal dengan istilah biakan murni. Untuk melakukan hal ini, haruslah dimengerti jenis-jenis nutrient yang
disyaratkan bakteri dan juga macam lingkungan fisik yang ,menyediakan kondisi optimum bagi pertumbuhan
bakteri tersebut. Teknik isolasi mikroorganisme adalah suatu usaha untuk menumbuhkan mikroba diluar dari
lingkungan alamiahnya. Pemisahan mikroorganisme dari lingkungan ini bertujuan untuk memperoleh biakan
bakteri yang sudah tidak bercampur lagi dengan bakteri lainnya dan disebut biakan murni. Prinsip dari isolasi
mikroba adalah memisahkan satu jenis mikroba dengan mikroba lainnya yang berasal dari camouran bermacam-
macam mikroba. Hal ini dapat dilakukan dengan menumbuhkannya dalam media padat, sel-sel mikroba akan
membentuk koloni sel yang tetap pada tempatnya (Nur dan Asnani, 2007).

Pewarnaan gram merupakan salah satu prosedur yang paling banyak digunakan untuk mencirikan banyak
bakteri. Dari pewarnaan gram dapat diketahui morfologi sel antara lain sifat gram, bentuk sel, dan penataan sel.
Pewarnaan gram atau metode gram adalah suatu metode empiris untuk membedakan spesies bakteri menjadi dua
kelompok besar, Gram positif dan gram negatif, berdasarka sifat kimia dan fisika dinding sel mereka. Metode ini
diberi nama berdasarkan penemunya, Ilmuwan Denmark Hans Christian Gram pada tahun 1884. Pewarnaan gram
dibagi menjadi dua yaitu pewarnaan majemuk karena menggunakan lebih dari satu macam zat warna. Dan
pewarnaan diferensial karena pewarnaan ini mampu mengdeferensiasi atau membedakan bakteri, sehingga bakteri
dapat digolongkan menjadi dua yaitu Gram negatif dan Gram positif.

Teknik pewarnaan gram haruslah sesuai prosedur karena dapat mengakibatkan kesalahan identifikasi data
apakah gram positif atau gram negatif sehingga diperlukan adanya praktikum ini dilakukan agar mengetahui
jalannya mekanisme pewarnaan gram. Menurut bentuk dan struktur selnya makhluk hidup dibedakan menjadi dua
yaitu makhluk hidup bersel banyak dan makhluk hidup bersel satu, makhluk ini tidak dapat terlihat dengan mata
kita,  karena panca indra manusia memiliki kemampuan daya pisah atau daya lihat yang sangat terbatas. Oleh
karena itu banyak masalah mengenai benda atau organisme yang akan diamati dan pengamatan itu hanya bisa
dilakukan dengan menggunakan alat bantu yaitu mikroskop. Morfologi suatu mikroba dapat diperiksa dalam
keadaan hidup maupun mati. Pemeriksaan morfologi ini penting untuk mengenal nama bakteri, pengenalan sifat
fisiologisnya yang kebanyakan merupakan faktor penentu dalam mengenal nama spesies. Bagian-bagian sel dapat
dilihat dengan terlebih dahulu memberi warna dimana warna bisa bersifat asam, netral, maupun basa.

Bakteri dapat digolongkan menjadi dua kelompok yaitu Gram positif dan Gram negatif didasarkan pada
perbedaan struktur dinging sel. Pada umumnya bakteri gram negatif lebih tahan terhadap aktivitas antimikroba
dibandingkan dengan bakteri gram positif. Perbedaan daya tahan ini disebabkan karena perbedaan komponen
penyusun dinding sel. Sel-sel individu bakteri dapat berbentuk seperti elips, bola, batang, atau spiral.Masing-
masing ciri ini penting dalam mencirikan morfologi suatu spesies. Sel bakteri yang berbentuk seperti bola atau elips
dinamakan kokus. Kokus mucul dalam beberapa penataan yang khas tergantung pada spesiesnya. Sel berbentuk
silindris atau batang dinamakan basilus.Ada banyak perbedaan dalam ukuran panjang dan lebar di antara berbagai
spesies basilus. Ujung beberapa basilus tampak persegi, yang lain bundar, dan yang lain lagi meruncing atau lancip
seperti ujung cerutu. Kadang-kadang basilus tetap saling melekat satu sama lainnya, ujung dengan ujung, sehingga
memberikan penampilan rantai. Bakteri berbentuk spiral terutama di jumpai sebagai individu-individu sel yang
tidak saling melekat.Tercakup di dalam kelompok morfologis ini adalah spiroketa, beberapa di antaranya
menyebabkan penyakit yang berbahaya bagi manusia. Individu-individu sel dari spesies yang berbeda-beda
menunjukkan perbedaan yang mencolok dalam hal panjang, jumlah, dan amplitudo spiralnya serta kekuatan
dinding selnya. Sebagai contoh, beberapa spirilum berukuran pendek, spiralnya berpilin ketat; yang lain sangat
panjang dan menunjukkan sederetan pelintiran dan lengkungan. Spiral yang pendek dan tidak lengkap disebut
sebagai bakteri koma, atau vibrio (Holt dan Bergey, 2004).

2. MATERIAL DAN METODE

2.1 Material

Adapun bahan yang digunakan pada acara praktikum ini adalah medium NA, alcohol, biakan murni Bacillus
subtilis dalam medium nutrien cair umur 24 jam dan biakan murni Escherichia coli dalam medium nutrien cair
umur 24 jam, kertas payung, larutan cat nigrosin atau tinta cina, minyak imersi, larutan cat Hucker’s crystal violet
(Gram A), larutan Mordan Lugol’s iodine (Gram B), larutan pencuci atau alkohol (Gram C), larutan cat safranin
(Gram D), gelas benda.

2.2 Alat/Instrumen

Adapun alat yang digunakan pada acara praktikum ini adalah gelas beaker, tabung reaksi, pipet ukur, ball pipet,
hotplate, cawan petri, autoklaf, incubator, bunnsen dan ose.

2.3 Prosedur Kerja

2.3.1 Isolasi Bakteri

2.3.1.1 Cara goresan
1. Cairkan MNA tegak dalam penangas air.
2. Dinginkan sampai temperature kurang dari 500c
3. Tuangkan MNA tegak tersebut ke dalam petridish steril secara aseptik,biarkan sampai
dingin dan padat.
4. Ambil satu ose suspensi bahan yang mengandung bakteri secara aseptik, kemudian buat
goresan pada permukaan agar.
5. Bungkus dan beri etiket, dan inkubasikan selama 48 jam secara terbalik pada suhu kamar.
6. Sesudah inkubasi akan tampak koloni-koloni yang terpisah-terpisah.
7. Amati dan hitung berapa macam koloni yang tumbuh dan berdasarkan bentuk koloni.

2.3.1.2 Cara taburan

1. Suspensikan bahan yang mengandung bakteri seencer mungkin, maksudnya agar kelak
terjadi koloni-koloni yang terpisah-terpisah sehingga dengan mudah dapat diisolasi.
2. Cairkan MNA tegak dalam penangas air.
3. Dinginkan MNA tegak tersebut sampai temperatur kurang lebih 50 0C, selanjutnya
inokulasikan dengan satu ose suspensi bahan yang mengandung bakteri. Gojog hati-hati
agar tercampur merata.
4. Tuangkan dalam petridish secara aseptik dan ratakan. Beri etiket, bungkus dan inkubasikan
selama 48 jam secara terbalik pada suhu kamar.
5. Amati dan hitung berapa macam koloni yang tumbuh berdasar bentuk koloni.

2.3.2 Pengecatan Bakteri

2.3.2.1 Pengecatan Negatif
 1. Bersihkan gelas benda dengan alkohol hingga bebas lemak, kemudian panggang di
atas nyala lampu spiritus.
2. Setelah dingin, ambil suspensi biakan murni Bacillus subtilis dengan ose secara
aseptik dan letakkan di atas gelas benda.
3. Kemudian ambil sedikit larutan cat nigrosin atau tinta cina, campurkan dengan
suspensi bakteri, ratakan dengan batang gelas hingga merupakan lapisan yang tipis
sekali.
4. Selanjutnya preparat dikering anginkan.
5. Amati preparat dengan mikroskop perbesaran kuat dengan minyak imersi.
6. Gambar preparat bakteri tersebut.
8. Ulangi pekerjaan 1 sampai dengan 6 untuk biakan murni Escherichia coli.

2.3.2.2 Pengecatan Gram

1. Bersihkan gelas benda dengan alkohol hingga bebas lemak kemudian panggang di atas
nyala lampu spiiritus.
2. Ambil secara aseptik satu ose suspensi bakteri Bacillus subtilis dan letakkan pada gelas
benda. Ratakan suspensi bakteri
tersebut.
3. Kering anginkan, dan selanjutnya lakukan fiksasi di atas nyala lampu spiritus.
4. Setelah dingin bubuhkan cat utama (Gram A) sebanyak 2 – 3 tetes dan diamkan selama 1
menit.
5. Cuci dengan air mengalir, kemudian kering anginkan.
6. Tetesi dengan larutan mordan (Gram B) dan biarkan selama 1 menit, cuci dengan air
mengalir dan kering anginkan.
7. Kemudian cuci dengan larutan pencuci atau alkohol (Gram C) selama kurang lebih 30
detik, selanjutnya cuci dengan air
mengalir dan kering anginkan.
8. Beri larutan cat penutup (Gram D) selama 2 menit.
9. Cuci dengan air mengalir dan kering anginkan.
10. Amati preparat dengan mikroskop perbesaran kuat dengan minyak imersi. Bakteri gram
positif berwarna violet, gram negatif berwarna merah, dan gram variabel dapat berwarna
merah atau berwarna violet.
11. Gambar hasil-hasil pengecatan bakteri dengan diberi keterangan mengenai bentuk sel,
warna dan reaksi pengecatan.
12. Ulangi pekerjaan 1 sampai dengan 11 untuk biakan murni Escherichia coli.

3. HASIL DAN PEMBAHASAN

3.1 HASIL PENGAMATAN
Dari beberapa percobaan praktikum kali ini didapatkan hasil yang tertera dalam gambar sebagai berikut:
 Gambar 1. Teknik isolasi bakteri

Gambar 2. Pengecatan bakteri dan morfologi bakteri

 3.2 Pembahasan

Ada beberapa metode dalam mengisolasi mikroba bakteri yaitu dengan menggunakan metode gores, metode
tuang, metode sebar, metode pengenceran dan agar miring. Metode-metode ini berdasarkan pada prinsip yang sama
yaitu mengencerkan organisme sedemikian rupa sehingga tiap individu spesies dapat dipisahkan dengan lainnya.
Prkatikum ini bertujuan untuk mempelajari teknik-teknik di dalam pengisolasian mikroba beserta pemurniannya.
Koloni-koloni yang telah ditentukan pada masing-masing medium kemudian diidentifikasi morfologinya yaitu
bentuk luar, warna, struktur dalam koloni, tepi koloni, elevasi. Pada masing-masing media sendiri terdapat
keanekaragaman dalam morfologi tersebut. Koloni bakteri dapat dengan mudah dibedakan dari koloni lainnya
dengan adnya penampakan umum berupa lender dan agak mengkilap. Bakteri adalah salah satu contoh
mikroorganisme yang penting dan memiliki bentuk yang beragam.

Pewarnaan negatif yaitu pewarnaan yang ditujukan terhadap bakteri yang sulit diwarnai, dimana bakterinya
tidak diwarnai melainkan latar belakangnya, metode pewarnaan negatif merupakan suatu metode perwarnaan
umum, dimana digunakan larutan zat warna yang tidak meresap ke dalam sel-sel bakteri melainkan melatar 
belakangi sehingga kelihatan atau nampak sebagai bentuk-bentuk kosong tak berwarna.Sedangkan pewarnaan gram
merupakan pewarnaan yang digunakan untuk mengelompokan bakteri gram positif dan gram negatif. Bakteri gram
positif akan mempertahankan zat warna crystal violet dan akan tampak berwarna ungu tua di bawah mikroskop.
Adapun bakteri gram negatif akan kehilangan zat warna crystal violet setelah dicuci dengan alkohol, dan sewaktu
diberi zat pewarna air fucsin atau safranin akan tampak berwarna merah. Perbedaan zat warna ini disebabkan oleh
perbedaan dalam struktur kimiawi dinding selnya. Pewarna yang digunakan dalam pewarnaan gram antara lain :
crystal violet, alkohol, safranin, dan iodine. Prinsip pewarnaan negatif yaitu suatu metode pewarnaan tidak
langsung dimana digunakan larutan zat warna yang tidak meresap kedalam sel bakteru melainkan ke dalam latar
belakangnya. Prinsip pewarnaan gram didasarkan pada perbedaan struktur dinding sel bakteri ; sehingga
menyebabkan perbedaan reaksi dengan permeabilitas zat warna dan penambahan larutan pencuci.

Bakteri berdasarkan pewarnaan gram, dibedakan menjadi bakteri gram negatif dan gram positif. Dinding sel
bakteri gram positif banyak mengandung peptidoglikan, sedangkan dinding sel bakteri gram negatif banyak
mengandung lipopolisakrida. Berdasarkan kebutuhan Oksigen (O2) dikenal bakteri aerob dan anaerob. Bakteri
aerob memerlukan O2 untuk bernafas, sedangkan bakteri anaerob tidak memerlukan O2 untuk bernafas. Eschericia
coli atau biasa disingkat E. coli, adalah salah satu jenis spesies utama bakteri gram negatif. Bakteri gram negatif
adalah bakteri yang tidak mempertahankan zat warna kristal violet sewaktu proses pewarnaan gram sehingga akan
berwarna merah sedangkan bakteri gram positif akan berwana ungu bila diamati dengan mikroskop. Sedangkan
bacillus merupakan bakteri pembentuk spora yang tergolong dalam famili Bacillaceae,. Bakteri ini bersifat aerobik
sampai anaerobik fakultatif, katalase positif, dan kebanyakan bersifat gram positif, hanya beberapa bersifat gram
variabel. Bentuk spora yang diproduksi oleh Bacillus bermacam-macam, tergantung dari spesiesnya. B. subtilis dan
B. cereus memproduksi spora berbentuk silinder yang tidak membengkak, B. polymyxa dan B. sphaericus
memproduksi spora yang membengkak, sedangkan B. subtilis membentuk spora yang langsing, tidak melebihi
diameter 0.9 µm.

4. KESIMPULAN

Berdasarkan praktikum yang telah dilakukan dapat diketahui bahwa isolasi bakteri dapat dilakukan dengan
beberapa tahapan dan dengan berbagai cara yaitu metode taburan dan metode goresan. Setiap perlakuan isolasi
bakteri ini menggunakan medium Nutrient Agar (NA) karena NA merupakan media yang paling cocok untuk
pertumbuhan bakteri. Dalam penamaan bakteri, kita juga dapat mengetahui bentuk bakteri tersebut. Sifat – sifat
morfologi bakteri dapat dikenali dengan cara melihat bentuk koloni bakteripada media tumbuh, melihat sel bakteri
dengan pewarnaan sederhana dan pewarnaan gram yangkemudian diamati dengan mikroskop.

REFERENSI

[1] BPOM. 2008. Pengujian Mikrobiologi Pangan. Jurnal Info POM, 9.2:1-11.

[2] Habibah., dan Khadafi, M. 2011. Mikrobiologi Dasar Dalam Prektek. Teknik dan Prosedur Dasar
Laboratorium, 5:1-3.

[3] Doolye., dan Ellie, M. 2008. Microbial Food spoilage. Journal of Food Research. 2;18-21.
 [4] Irianto, Koes. 2006.  Mikrobiologi Jilid 1. Bandung : Yrama Widya.

[5] Pelgzar., dan Reid. 1958. Mycrobiology. Tokyo : Mc Graw-Hill Compan.

[6] Suriawiria, U. 2005. Mikrobiologi Dasar . Jakarta : Papas Sinar Sinanti.

LAMPIRAN
III. Screenshot kutipan jurnal yang dipakai