04/03/2011

Métodos de Isolamento de Biomoléculas

Existe uma grande variedade de métodos visando a separação de

biomoléculas.
Métodos experimentais utilizados Como na maioria das vezes o que se pretende purificar é uma proteína,(o grupo
de moléculas com maior diversidade) as metodologias de separação de proteínas
em estudos com proteínas tiveram um grande desenvolvimento, com muitas opções disponíveis.

Os métodos de separação de biomoléculas são agrupados em duas categorias:

Métodos baseados em características físico-químicas das biomoléculas:

1. Tamanho – Massa – Densidade (ex: centrifugação, diálise, gel-filtração)

2. Carga elétrica (ex: cromatografia de troca iônica, eletroforese)
3. Solubilidade ou hidrofobicidade (ex: cromatografia em papel, fase reversa)
Profa. Nídia
Métodos baseados em afinidade biológica, que exploram a interação entre duas
moléculas:

4. Cromatografia de afinidade (pressupõe que uma das moléculas do par que

interage é um “reagente” de fácil obtenção, disponível comercialmente)

MATERIAL BIOLÓGICO DE PARTIDA: (100g) •O fluxograma ao lado representa a MATERIAL BIOLÓGICO DE PARTIDA: (100g) Além dos métodos de purificação, análises
Extrato “marcha” de purificação de uma proteína, complementares devem ser feitas ao longo da
bruto Lisossomos
Lisossomos mostrando as etapas sucessivas, cada Lisossomos
Lisossomos purificação, para verificar se o processo de
Mitocôndria
Mitocôndria uma consistindo de método, que levam ao Mitocôndria
Mitocôndria separação está sendo eficiente.
SOBRENADANTE ORGANELAS Golgi SOBRENADANTE ORGANELAS Golgi
isolamento de uma proteína presente
Núcleo
Núcleo numa mistura complexa. Núcleo
Núcleo A medida da atividade biológica da proteína
Precipitação com Sal/Solvente Precipitação com Sal/Solvente
de interesse e do conteúdo de proteínas de
•Observe a quantidade de proteínas cada fração resultante do processo de
(100g) presente no material inicial e separação devem ser feitas a cada passo.
F1 F2 F3 F4 F1 F2 F3 F4
quanto da proteína purificada se obtém no
Precipitação com Sal/Solvente final (0,001g). Esses números são típicos Precipitação com Sal/Solvente Assim, apenas a fração que contém a
para a purificação da maioria das proteína de interesse, marcada com um
F 2 .1 F 2 .2 F 2 .3 proteínas, em especial enzimas. F 2 .1 F 2 .2 F 2 .3 círculo vermelho no fluxograma, é submetida
Cromatografia Troca Iônica Cromatografia Troca Iônica
à próxima etapa de purificação.
•Em cada etapa, a proteína de interesse é
separada das demais com base em uma • Medida da atividade biológica
F 2 .3.1 F 2 .3.2 . . . . . . F 2. 3.N
F 2 .3.1 F 2 .3.2 . . . . . . F 2. 3.N
propriedade diferente. - particular para cada proteína
Cromatografia Troca Iônica Cromatografia Troca Iônica
(pH ou resina diferente) (pH ou resina diferente) - deve ser quantitativa, para estimar quanto
•Conseqüentemente, as proteínas ainda da proteína de interesse há em cada fração.
F 2 .3.N.X misturadas com aquela que está sendo F 2 .3.N.X
isolada são cada vez mais semelhantes • Medidas do conteúdo protéico (diversos)
Gel Filtração Gel Filtração
em suas características físico-químicas, - absorbância de luz UV de 280 nm
exigindo métodos cada mais sensíveis, - métodos colorimétricos
1 Proteína apenas capazes de explorar pequenas diferenças, 1 Proteína apenas
(ex: Lowry, Bradford, BCA, etc)
(0.001g) - 0.1 a 0.5% total para se chegar à proteína pura. (0.001g) - 0.1 a 0.5% total

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Para iniciar a purificação, inicialmente é necessário extrair a proteína de interesse

A centrífuga  A centrifugação freqüentemente é uma das primeiras
para um meio líquido, exceto se ela já estiver naturalmente presente em um meio
etapas de purificação aplicado a um extrato bruto.
líquido (sangue, suor, água do mar, meio de cultura, seiva de planta, etc). Amostra
Câmara blindada sedimentando
Através do movimento de rotação do rotor da centrífuga,
Vários métodos são uma força centrífuga é aplicada à amostra, separando seus
por ultra-som com possíveis para transformar componentes através de suas massas e/ou densidade,
Material na detergente células, órgãos, tecidos em conforme a técnica.
fonte um homogenado, ou extrato rotor

bruto.
ângulo  Através de sucessivas etapas de centrifugação com
fixo
velocidades (rotações por minuto, rpm) crescentes, pode-se
células
obter diferentes frações de um homogenado de células ou
Homogeneização tecidos.
(para romper tecidos e células)
refrigeração vácuo

tecidos centrifugação diferencial

homogenado

Homogenado
Material
ou
Extrato bruto de
por pressão liquefação partida
células intactas mitocôndrias
(prensa francesa) (Potter) pedaços de membrana lisossomos
fração
citoplasmática
sangue centrifugado: separação de plasma e células núcleos ribossomos

As mais potentes ultracentrífugas atuais ainda não são capazes de sedimentar proteínas. Sais se dissociam em solução aquosa e competem com as proteínas pela água
de solvatação.
Processos que diminuem a solubilidade e provocam a precipitação fracionada de proteínas
são utilizados como etapas preliminares de purificação. Uma das vantagens desses métodos
é o baixo custo e capacidade de processar grandes volumes/massas. Hemoglobina Considere uma solução com fibrinogênio,
Diferenças na albumina, hemoglobina, pseudoglobulina e
A precipitação de proteínas pode ser induzida por: solubilidade Albumina Mioglobina mioglobina e observe o gráfico.
- adição de sais (Precipitação salina) proteíca.
- adição de solventes Usando o sal sulfato de amônio (NH4)2SO4,
Solubilidade, log

- variação de pH (Precipitação isoelétrica) pode-se purificar completamente o fibrinogênio

O gráfico ilustra o efeito de
diferentes sais sobre a solubilidade a partir de uma mistura das 5 proteínas, pois
da hemoglobina. Pseudoglobulina este precipita totalmente em uma saturação de
Fibrinogênio
2,8 M do sal.
Em baixa concentração salina, a
Salting-in X Salting-out solubilidade das proteínas aumenta, Neste ponto, centrifuga-se a solução e o
NaCl Concentração do Sal (NH 4)2SO4,, Molar
fibrinogênio é coletado como um precipitado.
Solubilidade da hemoglobina (S/S’)

pois os íons do sal ajudam a reforçar

KCl
a camada de solvatação.
Numa próxima etapa, adicionando-se mais
Proteínas apresentam diferente sensibilidade
Em alta concentração salina, a sal à solução até uma saturação de 7 M, pode-
MgSO4 para a precipitação salina.
solubilidade das proteínas diminui se obter um novo precipitado contendo
- precipitam primeiro: albumina, hemoglobina e pseudoglobulina.
pois os íons do sal competem pelas proteínas maiores
(NH4)2SO4 moléculas de água disponíveis para proteínas mais hidrofóbicas
formar a sua própria camada de E teremos também purificada a mioglobina,
K2SO4
solvatação. possuem camadas de solvatação maiores ainda solúvel na presença de 7M do sal, e que
ou menos organizadas, mais fáceis de pertubar. ficou sozinha no sobrenadante.
Concentração do Sal,, Molar

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Proteínas também podem ser precipitadas com adição de solventes ao meio ou Para obter as proteínas precipitadas em solução novamente, é necessário
quando colocadas em meio com pH próximo ao seu ponto isoelétrico. reverter as condições que levaram à precipitação.

Proteína P.I.
Proteínas colocadas em meio com pH igual ao seu PI Membrana
Pepsina <1,0 tendem a precipitar, pois tendo carga neutra, apresentam de celofane
Ovalbumina galinha 4,6 a camada de solvatação menos organizada. Aos precipitados obtidos com sal ou
Albumina sérica humana 4,9
solvente
solvente, adiciona-se água.
Tropomiosina 5,1
Insulina bovina 5,4 Constante Momento Ao precipitado obtido com variação
Solvente solução a
Fibrinogênio humano 5,8 Dielétrica Dipolar ser dialisada de pH, retornar ao pH original.
Gama-globulina 6,6 Água 78.5 1.85
Dimetilformamida 48.9 3.96
Colágeno 6,6 início final
Mioglobina equina 7,0
Metanol 32.6 1.66 Dt
Etanol 24.3 1.68
Hemoglobina humana 7,1 Acetona 20.7 2.72 Para remover o excesso de sal ou do solvente no precipitado, utiliza-se
Ribonuclease A bovina 7,8 Clorofórmio 4.8 1.15 a diálise.
Citocromo C equino 10,6 Benzeno 2.3 0.00
Histona bovina 10,8
Lisozima, galinha 11,0
• a amostra é colocada dentro de um saco feito com uma membrana de celofane com poros
Solventes miscíveis com a água diminuem a constante tratados, que permite a passagem de moléculas até 10,000 d.
Salmina, salmão 12,1 dielétrica do meio e desorganizam a camada de
solvatação das proteínas. • o saco contendo a amostra é imerso em um recipiente contendo o solvente que se deseja.
Ponto Isoelétrico de algumas Proteínas
Os mais utilizados são etanol e acetona. • excesso de sal ou de solvente se difunde para o solvente
• após várias trocas de solvente, todo o excesso de sal/solvente terá sido retirado.

MATERIAL BIOLÓGICO DE PARTIDA: (100g) Até o momento, exploramos as Métodos para medida do conteúdo de proteína:
etapas iniciais de purificação de
Lisossomos proteínas, como a centrifugação
Mitocôndria diferencial e precipitação
SOBRENADANTE ORGANELAS Golgi fracionada.
O gráfico mostra o
Absortividade molar, e

Núcleo
Precipitação com Sal/Solvente Esses métodos, apesar de terem espectro de absorção de
baixo poder de resolução (exploram luz UV dos aminoácidos
diferenças grosseiras entre as aromáticos Trp, Tyr ou
F1 F2 F3 F4 proteínas), permitem processar Phe.
Precipitação com Sal/Solvente grandes volumes ou massas, típicos
das etapas iniciais de isolamento.
F 2 .1 F 2 .2 F 2 .3
Quando já houve redução significa-
Cromatografia Troca Iônica
tiva dos montantes de proteínas a
serem processados, iniciam-se as Comprimento de onda
F 2 .3.1 F 2 .3.2 . . . . . . F 2. 3.N cromatografias, que irão explorar as
Cromatografia Troca Iônica
(pH ou resina diferente)
diferenças mais sutis entre as A absorbância de uma solução de proteínas a 280nm é diretamente proporcional
moléculas. ao seu conteúdo protéico, desde que essas contenham esses aminoácidos na sua
F 2 .3.N.X composição, especialmente triptofano.
Não esquecer que todas as frações
Gel Filtração obtidas devem ter o conteúdo de A vantagem desse método é que ele não é destrutivo para a proteína.
proteínas e de atividade biológica
1 Proteína apenas medidos, para se decidir qual/quais Em geral, considera-se que uma leitura de 1,0 A280 equivale a uma concentração
deverão passar para o passo
(0.001g) - 0.1 a 0.5% total de 1 mg/mL.
seguinte da purificação.

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Cromatografia Que características devem ter as resina cromatográficas para possibilitar

separações de moléculas baseadas em diferentes propriedades ?
Esta técnica consiste na passagem da proteína através de uma coluna (fase
estacionária) que é desenhada para reter ou diminuir a velocidade da passagem da fase
móvel onde estão as macromoléculas (proteínas); Cromatografia de permeação em gel ou gel-filtração:
separação de moléculas pela massa molecular
A técnica baseia-se numa propriedade particular: géis são porosos, funcionando como peneiras ou filtros

• como o tamanho, carga ou afinidade química. Cromatografia de troca iônica:

A solução a analisar deve conter a proteína concentrada e o método deve ser rápido
para evitar a degradação da mesma, devendo no entanto, utilizar-se inibidores de
proteases.
separação de moléculas pela carga elétrica
géis apresentam grupos carregados positiva- ou negativamente
Cromatografia de partição (fase reversa ou hidrofóbica):
separação de moléculas pela solubilidade relativa em meio aquoso
géis possuem caráter hidrofóbico

Cromatografia de afinidade:
separação de moléculas pela capacidade de interagir com um ligante
géis possuem ligante específico ligado covalente à resina

Funcionamento Básico de uma Coluna Cromatográfica

Cromatografia em Coluna
Uma coluna é um tubo cilíndrico aberto nas duas extremidades e preenchido com a
resina ou matriz ou gel cromatográfico.
A coluna é constantemente alimentada com líquido (tampão), banhando a resina e
forçando o contato desta com as moléculas que estão sendo analisadas.

Abaixo está representado o esquema geral de uma cromatografia:

Tempo zero Tempo 1 Tempo 2 Tempo n

Amostra com
diferentes Líquido
componentes Mais tampão é Componentes da que sai da
colocado na amostra se coluna é
Resina coluna, separam e saem recolhido
embebida forçando os da coluna com em tubos
em componentes diferentes de um
tampão da amostra a volumes de coletor de
interagirem tampão frações
com a resina

Os componentes da mistura são

separados por interação diferenciada
com a resina, com base em
propriedades moleculares como: Coletor de
frações
Concentração

• massa molecular
• carga elétrica Um cromatograma, como o
gráfico ao lado, é a maneira
• solubilidade usual de se representar o
• afinidade resultado de uma cromatografia.
Tempo ou volume

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Cromatografia de Troca Iônica Cromatografia de troca iônica

A resina para cromatografia de troca iônica apresenta carga elétrica, positiva ou
negativa, em uma ampla faixa de pH.

A cromatografia de troca iônica

explora as diferenças no sinal e na DEAE CM
magnitude das cargas líquidas das
proteínas em um dado pH.
Trocadora de ânions Trocadora de cátions

Existem dois tipos básicos:

resinas trocadoras de ânions (possuem carga positiva), como o dietilaminoetil
(DEAE)-celulose e;
resinas trocadoras de cátions (possuem carga negativa), como o carboxi-metil
(CM)-celulose.

Cromatografia de troca iônica Como funciona a Cromatografia de Troca Iônica

O gráfico mostra que essas resinas mantém suas cargas em uma ampla faixa Adsorção
No exemplo ao lado, como funciona uma resina catiônica ou
de pH. trocadora de ânions, como o DEAE-celulose:
+
+
+ +
+
 A cromatografia de troca iônica compreende duas +
etapas: + + +
++
1) adsorção das proteínas com carga contrária à
resina, e saída da coluna das proteínas com a
Moléculas com a mesma carga,
mesma carga; ou sem carga, não interagem com a resina,
sendo as primeiras a sair da coluna
2) eluição das proteínas adsorvidas.
Eluição
Para a eluição, as condições de adsorção da coluna
+
(pH ou força iônica) são alteradas para neutralizar a +
interação entre as proteínas e a resina. +
+
+
Mais frequentemente utiliza-se um aumento da Na+Cl- + +
++
Assim, o DEAE-celulose pode ser utilizado em pH abaixo de 10, enquanto concentração do sal no tampão, pois alterações
de pH podem desnaturar proteínas, levando-as a
o CM-celulose é utilizado em pH acima de 4, condições em que pelo menos precipitar dentro da coluna.
50% dos grupos dessas resinas estão carregados. Adição de sal ao tampão resulta em
competição entre os íons em solução
e as moléculas adsorvidas na resina.

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Duas Modalidades de Cromatografia de Troca Iônica Cromatografia de Gel-Filtração (ou Cromatografia de

exclusão ou peneira molecular )
 Gradientes de sal podem fracionar as proteínas adsorvidas na resina de acordo com
a intensidade de suas cargas, que é dada pela diferença entre seus PIs e o pH do
tampão de eluição.
 As proteínas não retidas (com a mesma carga da resina) não são separadas, sendo
simplesmente “arrastadas” pelo tampão.
A cromatografia de exclusão por
Eluição NaCl tamanho, também chamada de gel-
Eluição NaCl
_ filtração, separa as proteínas de
+ 0. 10 M (+)
0. 10 M acordo com seu tamanho.
(-)
++ 0. 15 M = 0. 15 M
(+)
CM (-)

(-)
+
+ +
0. 20 M DEAE _
(+) =
0. 20 M

_ (+)
(-) =
+
_ = Não retidas +
Não retidas
+

Carboximetil~celulose Dietilaminoetil~celulose
(trocadora de cátions) (trocadora de ânions)

Cromatografia de gel filtração ou peneira molecular A cromatografia de gel-filtração possibilita estimar a massa molecular de
Moléculas com massas diferentes
uma proteína em seu estado nativo
proteína grande

proteína pequena Além de purificar, por ser realizada em condições de pH, força iônica
Curva de calibração e temperatura que preservam a atividade biológica da proteína, a
Tampão Fluxo do tampão
“empurra”
gel-filtração fornece a Mr do seu estado nativo.
moléculas
Observar Para isso, é necessário “calibrar” a coluna com proteínas de massa
através da
resina a escala
log molecular conhecida, construindo-se uma curva de calibração.
O volume de saída (eluição) de uma proteína numa coluna de gel-
Massa molecular (kD)

filtração é proporcional ao logaritmo de sua massa molecular.

traçado da medida de atividade
biológica nas frações
Moléculas Moléculas
Medida da ativ. biológica

maiores menores
Absorbância a 280 nm

grão da resina poroso

tubos grãos (beads) da
resina com poros

 Na gel-filtração, as proteínas que penetram nos poros da resina precisam de diferentes

Ler a massa
volumes de tampão para saírem da coluna, conforme suas massas moleculares, percorrendo os correspondente
canais internos dos grãos. Quanto maior o número de grãos em que cada molécula entrar durante
o percurso através da coluna, maior o volume necessário para sua saída.
 Proteínas maiores que o diâmetro dos poros não são separadas e saem da coluna com pouco
tampão, correspondente apenas ao volume da coluna externo aos grãos, também chamado de
volume morto (Vo). 20 40 60 80 100 120 mL
 Proteínas menores que o diâmetro dos poros não são separadas e saem da coluna com um Medir o volume de eluição da
volume de tampão correspondente ao volume interno (Vi, volume total menos o volume do próprio 25 50 75 100 125 mL volume
fração mais ativa. Transportar
gel). volumeKav
de eluição para a curva de calibração.

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Existem diferentes tipos de resinas para gel-filtração, conforme o tipo Cromatografia de Afinidade
de moléculas ou partículas a serem separadas

indica quais os tamanhos das

Resinas para Gel-Filtração
NOME
partículas que podem entrar
nos poros da resina e serem
fracionados. Acima ou abaixo
TIPO FAIXA DE RESOLUÇÃO
(kD) da faixa, não há separação.

Sephadex G-10 Dextrana 0.05 - 0.70 A cromatografia de afinidade

Moléculas pequenas
Sephadex G-25 Dextrana 1-5 separa proteínas por suas
Sephadex G-50 Dextrana 1 - 30 especificidades de ligação.
Sephadex G-100 Dextrana 4 - 150 Proteínas
Sephadex G-200 Dextrana 5 - 600

Bio-Gel P- 2 Policrilamida 0.1 - 1.8 Moléculas pequenas

Bio-Gel P- 6 Policrilamida 1-6
Bio-Gel P- 10 Policrilamida 1.5 - 20
Bio-Gel P- 30 Policrilamida 2.4 - 40
Bio-Gel P-100 Policrilamida 5 - 100 Proteínas
Bio-Gel P-300 Policrilamida 60 - 400

Sepharose 6B Agarose 10 - 4.000

Sepharose 4B Agarose 60 - 20.000 Células, partículas sub-celulares
Sepharose 2B Agarose 70 - 40.000

*Sephadex e Sepharose: Amersham Pharmacia Biotech; Bio -Gel: Bio -Rad Laboratories

Cromatografia de afinidade: Tipo de ligantes em cromatografia de afinidade

Um dos métodos mais eficientes para a purificação de proteínas, possibilitando um alto
1. Mono-específicos: ligação específica da molécula-alvo
rendimento com número reduzido de etapas.
- análogos de substratos ou inibidores de enzimas
- agonistas ou antagonistas de receptores
Adsorção
- determinantes antigênicos de anticorpos
Mistura de proteínas
Ex: cromatografia de Eluição - ligantes com “tag” ou “marcação”
imunoafinidade Partículas de Lavagem pH 2,0 ou sal - glutationa-S-transferase 8-AEA-cAMP
gel recobertas - poli-Histidina
8-(2-aminoethyl)aminoadenosine-3',5'-cyclic
de anticorpos
A separação de moléculas monophosphate
anti-A 2. Grupo-específico: ligantes para separação de grupos: (ligante para proteínas com afinidade por cAMP
tem como base a interação ou cGMP)
específica do analito Ligante Especificidade
(molécula-alvo) com um grupo-específico
ligante imobilizado na matriz. Proteína A Região Fc de IgG
Anti-A Complexo
Ag-AC é Proteína G Região Fc de IgG
Coluna interage
 Forças envolvidas nessa empacotada apenas desfeito Concanavalina A Grupos glicosil- ou manosil-
interação podem ser não com esse gel com a Cibacron Blue Várias enzimas, albumina
covalentes (eletrostáticas, proteína A
lisina Plasminogênio, RNA ribossomal
hidrofóbica, pontes de H) ou
Desprezar arginina proteinases tipo tripsina
covalentes (p.e., ponte proteínas não Antígeno A
puro - benzamidina proteinases tipo tripsina
dissulfeto). retidas
calmodulina Proteínas reguladas por calmodulina Sítios de ligação das proteínas
Eluição: condições que interferem na ligação da proteína ao heparina Fatores de coagulação, lipases, A, G e L à imunoglobulina, que
ligante, como mudanças no pH e/ou força iônica, ou hormônios, receptores estoróides, etc permitem a purificação de
anticorpos por cromatografia
por competição com o ligante livre. Metais de transição Proteínas e peptídeos com resíduos
de His expostos de afinidade

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Cromatografia de Partição Cromatografia de Partição

Princípio: Explora diferenças de solubilidade dos compostos em solventes com grau de hidrofobicidade tempo 0 t1 t2 tn
diferentes, um polar e outro apolar.
Papel direção do
Aplicável especialmente á moléculas pequenas, como compostos orgânicos, aminoácidos, peptídeos, ou placa fluxo do
açúcares, lipídeos, etc. de sílica distância de migração da substância
solvente
Rf =
distância de migração do solvente
Apresenta limitações para uso com proteínas acima de 20-30kda, que são desnaturadas em presença Amostra Compostos
de solvente orgânico. na origem separados

Consiste de 2 sistemas: Fase estacionária Fase móvel

X
(suporte sólido) (líquido ou gás)
Cuba com solvente (fluxo por capilaridade)
Duas Possibilidades
- Amostra se deslocará (é mais solúvel) acompanhando a Fase Móvel
Para um dado sistema de solvente e tipo de suporte, cada substância apresenta um
- Amostra não se deslocará (é mais solúvel) na Fase Estacionária valor de Rf característico (razão de retardação).
AMOSTRAS

Dois tipos de montagem: Assim, além de um método de purificação, as cromatografias de partição permitem
CROMATOGRAFIA DE PARTIÇÃO CROMATOGRAFIA DE FASE REVERSA identificar e quantificar (pela intensidade das manchas obtidas após a separação)
diferentes compostos.
Suporte: PAPEL Suporte: GEL DE SÍLICA (camada delgada ou TLC)
Fase Estacionária: Aquosa (H20 na celulose) Fase Estacionária: sílica (mineral apolar) Pode-se ainda recortar a mancha de interesse do papel ou da sílica e recuperar o
Fase Móvel: Solvente orgânico (hidrofóbico) Fase Móvel: Solvente aquoso ou água composto isolado.

Como se avalia se o processo de purificação de uma proteína foi eficiente ? Como se avalia se o processo de purificação de uma proteína foi eficiente ?

A eletroforese em gel de poliacrilamida (PAGE) permite visualizar a composição de

Três parâmetros permitem avaliar a eficiência do processo de purificação de uma proteína: proteínas de uma amostra. É um método complementar para a purificação de proteínas.
Fornece informações sobre a massa molecular e composição
de subunidades da proteína em meio desnaturante e redutor.
- Atividade específica (AE): é a razão entre a quantidade da proteína de interesse, medida
através de sua atividade biológica, e a quantidade total de proteínas presentes
A poliacrilamida funciona como uma
em cada etapa de purificação. Esse índice aumenta ao longo da purificação.
peneira, deixando passar através de seus +
- Índice de purificação: indica quantas vezes em relação ao material de partida a proteína poros as moléculas pequenas e retendo
as grandes;
de interesse foi “concentrada”. Calcula-se como a razão entre as atividades acrilamida N,N´-metilenobisacrilamidaacrilamida
específicas inicial (material de partida) e final (proteína pura).
A poliacrilamida é um polímero que Catalisador
(persulfato de amônio)
forma um gel de malha porosa.
- Rendimento: indica quanto (em %) da proteína de interesse ativa presente no material de
partida foi recuperado ao final da purificação. Um certo grau de perda é
• É formado a partir da reação de acrilamida e
inerente do processo de purificação (em cada etapa só devem ser proces-
bisacrilamida.
sadas as frações mais ricas em atividade biológica, desprezando-se aquelas
que apresentam pouca atividade). • concentração de acrilamida variando de 7-
Também podem ocorrer perdas por desnaturação das proteínas devido às 20% determina o diâmetro dos poros
diferentes condições (pH, sais, etc) a que são submetidas nas diferentes
• uso de gradiente de acrilamida aumenta o
etapas de purificação. Espera-se recuperar o máximo possível da proteína de
poder de resolução
interesse.
• o gel é polimerizado com tampão pH 8.9, na
poliacrilamida
presença do detergente Na + dodecil sulfato (SDS)

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Eletroforese em Gel de Poliacrilamida (PAGE)

Desnaturação de proteínas por SDS
Tipo mais comum de cuba Na cuba, o gel é polimerizado entre duas
H3C-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2- para PAGE. placas de vidro ou plástico, afastadas 1 mm
Sódio dodecil sulfato
uma da outra.
amostra
catodo
Poços para Antes da polimerização, um pente é
as amostras 1 mm
A porção hidrocarboneto do colocado na parte superior do gel para formar
detergente interage com as regiões os poços onde serão colocados de 5 a 20
tampão
hidrofóbicas da proteína, dispondo microlitros de cada amostra, misturadas com
o grupo sulfato carregado na azul de bromofenol, um indicador da corrida.
Placas
superfície, em contato com o meio de vidro
aquoso. As partes superior e inferior do gel fazem
 A repulsão entre os grupos contato com recipientes de tampão, onde
gel
fosfato desestabiliza os laços não estão os eletrodos que estabelecerão o
covalentes que mantém a estrutura campo elétrico (~100V) durante a corrida
Efeito do SDS anodo
3D da proteína, desnaturando-a. (1 a 2h).
tampão
Terminada a corrida, as placas são retiradas
• desnaturação uniformiza a forma das proteínas, que poderia influenciar na migração
da cuba, e o gel entre elas é cuidadosamente
através dos poros da poliacrilamida;
retirado e corado para revelar as bandas de
• mascara a carga natural das proteínas no pH da corrida, fazendo com que todas cuba vertical para mini-gel (10 X 8 cm) proteína. Como corantes utiliza-se Coomassie
moléculas migrem para o anôdo; Blue ou nitrato de prata.
• facilita o efeito de redutores, rompendo pontes dissulfeto intra- e inter-cadeias

SDS-PAGE das proteínas da bactéria Eletroforese em Meio Redutor

Salmonella tiphymurium
Adição do redutor 2-mercaptoetanol rompe
pontes dissulfeto nas proteínas, possibilitando a
determinação do número de cadeias e tipo de
Direção ligação entre cadeias de proteínas oligoméricas
da
migração

Padrões

A
ss
B
AB
2 - Mercaptoetanol
A A
SH SH
B B

Sem Com

Cada linha (banda) corada no gel 2 - Mercaptoetanol

representa uma proteína

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SDS-PAGE permite determinar a massa molecular de proteínas Focalização Isoelétrica

Utiliza-se proteínas padrões com Mr (mobilidade relativa ) Técnica que separa proteínas de acordo com seus pontos isoelétricos.
conhecida para se fazer uma curva de calibração do gel em cada
corrida. Interpolando-se a mobilidade relativa de uma proteína
desconhecida na curva pode-se estimar a sua massa molecular. Um gradiente de pH estável é
Mr estabelecido em um gel pela
97.4 adição de anfólitos apropriados.
(-)
Massa molecular (kD)

87.0 Uma mistura de proteínas é

inserida em um poço gel.

45.0 Com a aplicação de um campo

elétrico, as proteínas entram no gel
29.0 e migram até que cada uma
alcance um pH equivalente a seu
21.0 pI.
12.5
(+) 6.5 Lembre-se que, pH=pI, a carga
Mobilidade relativa líquida da proteína é zero.
Proteínas padrões em um SDS-PAGE
Curva de calibração de SDS-PAGE

Eletroforese em duas dimensões

As proteínas são inicialmente separadas

por focalização isoelétrica em um gel
cilíndrico.

O gel é então colocado horizontalmente

sobre um segundo gel de forma achatada,
e as prote[inas são separadas por
eletroforese em gel de poliacrilamida-SDS.

A separação horizintoal reflete as

diferenças em pI;

A separação vertical reflete as diferenças

em massa molecular.

Mais de 1000 proteínas podem ser

analisadas por esta técnica.

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