Pengukuran

Konsentrasi ..................... (Hasrida Mustafa, et. al)

Pengukuran Konsentrasi dan Kemurnian DNA Genom Nyamuk

Anopheles barbirostris
Genomic DNA Concentration and Purity Measurement of
Anopheles barbirostris
a, b a
Hasrida Mustafa *, Indra Rachmawati , Yusran Udin
a
Balai Litbang P2B2 Donggala, Badan Litbang Kesehatan, Kementerian Kesehatan RI, Jl. Masitudju No.58
Labuan Panimba, Labuan, Donggala, Sulawesi Tengah, Indonesia
b
Badan Pengkajian dan Penerapan Teknologi (BPPT), Jalan MH.Thamrin 8, Jakarta 10340

INFO ARTIKEL A B S T R A C T / A B S T R A K

Article History:
Received: 2 Dec. 2015 measure the degree of contamination. Anopheles barbirostris mosquitoes samples from
Revised: 24 May 2016
Accepted: 8 June 2016
Keywords:
Measurement
DNA Concentration
DNA purity
Anopheles barbirostris
The purity and concentration of DNA information from some sample are important to
Kalukutinggu Village was extracted to obtain the genome DNA using PureLink Genomic
DNA mini Kits. The purity and concentration of DNA Anopheles barbirostris was
measured by using nano spectrophotometer. The results showed that DNA
concentrationwas 17,33 – 34,79 ug/ml, and their purity were 1,90 average. The purity
and concentration of the DNA from the samples showed were not contaminated and
eligible for the next step, that is DNA amplification.

Kata kunci: Informasi mengenai konsentrasi dan kemurnian DNA sangat diperlukan untuk
Pengukuran mengetahui derajat kontaminasi suatu sampel. Telah dilakukan ekstraksi genom DNA
Konsentrasi DNA Anopheles barbirostris dengan metode PureLinkTM Genomic DNA mini Kits untuk
Kemurnian DNA mendapatkan DNA genom yang kemudian diukur konsentrasi dan kemurniannya.
Anopheles barbirostris Sampel nyamuk Anopheles barbirostris yang digunakan berasal dari desa Kalukutinggu
dan Palolo. Pengukuran konsentrasi DNA dilakukan dengan menggunakan nano
spectrofotometer dan diperoleh konsentrasi DNA sekitar 17.33 - 34.79 µg/ml dengan
tingkat kemurnian rata-rata 1,90. Hasil Konsentrasi dan kemurnian DNA An.
barbirostris menunjukkan rata-rata sampel tidak terkontaminasi dan memenuhi syarat
untuk dilakukan proses selanjutnya yaitu amplifikasi DNA.

© 2016 Jurnal Vektor Penyakit. All rights reserved

*Alamat Korespondensi : email : hasrida_m@yahoo.co.id

PENDAHULUAN sebagai vektor. Mengingat ukuran nyamuk

Anopheles barbirostris Van der Wulp yang kecil, sehingga tidak mudah untuk
4
merupakan nyamuk yang berperan sebagai memperoleh DNA total yang berkualitas baik.
vektor penyakit, diantaranya penyakit Ekstraksi dan pemurnian DNA pada
1
malaria, filariasis dan arbovirusis. An. dasarnya merupakan serangkaian proses
barbirostris tersebar di wilayah Sumatera, pemisahan DNA dari komponen-komponen
Jawa, Kalimantan dan Sulawesi. An.
2 sel lainnya. Ekstraksi untuk memperoleh DNA
barbirostris jarang dijumpai menghisap darah yang berkualitas tinggi merupakan kaidah
orang di Sumatera dan Jawa tetapi di Sulawesi dasar yang harus dipenuhi dalam analisis
dan Nusa Tenggara Timur (NTT) banyak yang molekuler dan merupakan salah satu faktor
tertarik menghisap darah orang sehingga keberhasilan dalam amplifikasi DNA yang
berperan besar sebagai vektor.3 akan digunakan dalam analisis karakter
5-7
Pemeriksaan nyamuk secara molekuler genetika.
dapat digunakan sebagai alternatif untuk Ekstraksi yang baik didukung oleh hasil
mengidentifikasi nyamuk yang berperan kuantitas DNA ekstrak yang diperoleh.

7
Jurnal Vektor Penyakit, Vol. 10 No. 1, 2016 : 7-10

Pengukuran kuantitas DNA dilakukan dengan sebanyak 200 µl kemudian vortex selama lima
metode spektrofotometri menggunakan detik. Sebanyak 200 µl ethanol 96-100%
spektrofotometer pada panjang gelombang ditambahkan ke dalam setiap tube kemudian
(λ) 260 dan 280 nm.8 Kemurnian DNA vo r t e x s e l a m a l i m a d e t i k , L a r u t a n
ditentukan dengan menghitung rasio dipindahkan ke dalam tube ke PureLink TM spin
absorbansi pada A260 dengan A280 (Ratio column. Kolom disentrifus pada kecepatan
A260:A280). Molekul DNA dikatakan murni 1000 g, selama 1-3 menit. Tube koleksi
jika rasio absorbansinya berkisar antara 1,8 – dibuang dan pindahkan spin column ke tube
9
2,0. koleksi yang baru. Lima ratus mikroliter Wash
Informasi mengenai konsentrasi dan Buffer ditambahkan ke spin column dan
kemurnian DNA sangat diperlukan untuk disentrifus pada kecepatan 12.000 rpm, suhu
mengetahui derajat kontaminasi suatu ruang selama lima menit. Tube koleksi
sampel dan apakah sampel tersebut baik selanjutnya dibuang dan spin column
untuk digunakan pada tahap selanjutnya. Oleh ditempatkan ke eppendorf tube dan
karena itu, dilakukan pengukuran terhadap ditambahkan Elution Buffer sebanyak 25µl.
ku a n t i t a s b a i k ko n s e n t ra s i m a u p u n
Inkubasi di suhu ruang selama satu menit.
kemurnian DNA genom.10 Sentrifus kolom pada kecepatan maksimal
(12.000 rpm) pada suhu ruang selama 1-3
BAHAN DAN METODE menit. Eppendorf tube yang mengandung
DNA, dipindahkan ke kolom eppendorf tube
Proses ektraksi DNA dilakukan
TM yang baru dan penambahan Elution Buffer
menggunakan prosedur kerja PureLink
diulangi. Tube disentrifus pada kecepatan
Genomic DNA mini Kits dari invitrogen.1
maksimal (12.000 rpm) pada suhu ruang
PureLinkTM Genomic DNA mini Kits adalah
selama 1-2 menit. Tabung spin column
paket ekstraksi DNA yang terdiri atas Lysis
dibuang dan larutan berisi DNA pada
Buffer, Digestion Buffer, Wash Buffer 1, Wash
Eppendorf tube dicek konsentrasi DNA
Buffer 2, Elution Buffer, Rnase, Proteinase K.
menggunakan nano spectrofotometer (ND-
Kit PureLink® Genomic DNA menggunakan
1000 v 3.5.2) pada panjang gelombang A260
kolom yang prinsip kerjanya didasarkan pada
dan A280.
ikatan selektif DNA pada membran berbahan
silika dan garam chaotropic sehingga dapat
mengikat dan melepaskan DNA lebih efisien. HASIL
Lysis buffer pada kit ini telah dioptimasi untuk Hasil konsentrasi DNA genom nyamuk An.
meningkatkan aktivitas proteinase K sebagai barbirostris dari Desa Kalukutinggu rata-rata
enzim yang membantu dalam denaturasi sebesar 17.33 - 26.78 µg/ml, paling rendah
protein. pada sampel satu dan paling tinggi pada
Sampel nyamuk dimasukkan ke dalam sampel tiga. Hasil konsentrasi DNA genom
eppendorf tube (satu ekor nyamuk per nyamuk An. barbirostris di desa Palolo rata-
eppendorf tube) ditambahkan PBS 20 µl dan rata sebesar 19.91 - 34.79 µg/ml. Paling
digerus dengan pellet pestle sampai hancur. rendah pada sampel A dan paling tinggi pada
Tambahkan 180 µl Genomic Digestion Buffer sampel B.
dan 20 µl proteinase-K, divortex dan Nilai tersebut diperoleh dari hasil
diinkubasi pada dry bath (Thermolyne) selama absorbansi panjang gelombang A260 yang
0
dua malam dengan suhu 55 C. Setelah jaringan ditunjukkan pada alat spektrofotometer,
lisis, campuran disentrifus pada kecepatan sehingga diketahui konsentrasi DNA sampel 1
maksimal (12.000 rpm) pada suhu ruang adalah = 17.33 µg/ml yaitu dengan
selama sekitar lima menit. Supernatan menggunakan rumus :
diambil dan dipindah ke eppendorf tube yang
Konsentrasi sampel = A260 x faktor pengenceran x 50
baru, ditambahkan RNAse A sebanyak 20 µl ke
dalam setiap tube, kemudian divortex selama
Untuk perhitungan sampel lainnya
lima detik, inkubasi di suhu ruang selama dua
menggunakan rumus yang sama. Sedangkan
menit. Selanjutnya dilakukan penambahan ke
untuk Kemurnian DNA dilihat dari nilai rasio
tiap tube Genomic Lysis/Binding Buffer

8
 Pengukuran Konsentrasi ..................... (Hasrida Mustafa, et. al)

Tabel 1. Hasil Pengukuran Konsentrasi DNA genom An. barbirotris

Panjang gelombang Konsentrasi Rasio
Sampel (µg/ml) Absorbansi
A 260 A 2 80
(R)
5 4.78¹ 4.596 5¹ .77 6.6³
6 4.7³ ¹ 4.667 5³ .² 8 5.¹ ²
7 4.97⁰ 4.6⁰ ⁰ 6⁰ .¹ ² 6.45
8 4.86¹ 4.68¹ 65.7¹ 5.¹ 7
9 4.8⁰ ² 4.67⁰ 67.86 5.³ ²
⁰ 4.86⁰ 4.678 65.76 5.² 6
A 4.7³ ² 4.655 5³ .³ 5 5.² ³
B 4.⁰ ³ ⁰ 4.7¹ ¹ 78.¹ ³ 5.² 8
C 4.959 4.6¹ ¹ 69.¹ ⁰ 5.² ⁰
D 4.95² 4.6² 6 69.² ² 5.² 7
E 4.8¹ ² 4.68⁰ 67.² ³ 5.³ 8
F 4.968 4.6¹ 6 6⁰ .65 5.³ 6

ÇĮ Ô : 1-6: Sampel nyamuk An. barbirostris dari Desa Kalukutinggu;

A-F: sampel nyamuk An.barbirostris dari Desa Palolo.
absorbansi (R) A260 / A280.

Perbedaan tempat pengambilan sampel
Dari hasil pengukuran kemurnian DNA tidak terlalu berpengaruh pada kemurnian
genom nyamuk An. barbirostris diperoleh DNA yang dihasilkan. Konsentrasi DNA antara
berkisar 1,78 – 2,29 dengan kemurnian rata- nya m u k A n . b a r b i r o s t r i s d a r i D e s a
rata 1,9. Kalukutinggu dan Desa Palolo tidak
menunjukkan perbedaan yang signifikan. Hal
PEMBAHASAN ini dapat dilihat dari hasil rata-rata yang
Banyaknya radiasi ultraviolet yang diperoleh. Beberapa hal yang sangat berperan
diserap oleh larutan DNA berbanding lurus dalam mempengaruhi konsentrasi dan
dengan banyaknya DNA dalam sampel kemurnian DNA yang dihasilkan adalah
nyamuk yang diektraksi. Penyerapan sinar metode ektraksi yang digunakan, rusaknya
ultraviolet oleh nukleotida secara maksimal DNA dan adanya zat pengotor/kontaminan
dapat dicapai pada panjang gelombang A260 seperti fenol atau protein lainnya.7
nm, sedangkan penyerapan sinar ultraviolet
maksimal oleh protein dicapai pada panjang KESIMPULAN
gelombang A280 nm.6 Konsentrasi dan kemurnian DNA An.
Hasil pengukuran kemurnian DNA genom barbirostris rata-rata 1,9 menunjukkan
nyamuk An. barbirostris hanya ada dua sampel sampel tidak terkontaminasi dan memenuhi
yang kemurniannya diatas dua. Rasio syarat untuk dilakukan proses selanjutnya
kemurnian DNA d atas dua menunjukkan yaitu amplifikasi DNA.
masih adanya sisa buffer yang terbawa selama
i
10,12
proses isolasi. Hasil yang sama juga SARAN
diperoleh pada penelitian Hasmiwati pada Waktu yang diperlukan dalam tahap
nya m u k An . b a l a b a ce n s i s d i p e ro l e h pencucian pada proses ektraksi DNA tidak
konsentrasi DNA 8,25-71,25 µg/ml dan boleh lebih dari lima menit, karena pencucian
13
Kemurnian DNA yang berkisar 1,59-2,1. yang terlalu lama dapat mempengaruhi hasil
ekstrak yang dihasilkan.

9
Jurnal Vektor Penyakit, Vol. 10 No. 1, 2016 : 7–10

UCAPAN TERIMA KASIH 6. Tenriulo A, Suryati E, Parenrengi A. Ekstraksi

Terima kasih penulis ucapkan kepada tim DNA Rumput Laut Kappaphycus alvarezii
Dengan Metode Fenol Kloroform. Mar. Chim.
Pembina Risbinkes drg. Farida Soetirta, Prof.
Acta. 2001;2(2):6–10.
Amrul Munif, Prof. Emiliana Tjitra,
7. Sari septi kurniama, Mazieda muthia naila,
DR.Susilowati Herman yang telah
Listyorini D, sulasmi eko sri. Optimization Of
memberikan bimbingan serta masukan dalam Dna Isolation And Purification Technique
penelitian ini. Terima kasih pula kepada From Chili Pepper ( Capsicum frutescens )
teman-teman di Balai Litbang P2B2 Donggala Using Genomic DNA Mini Kit (Plant) Geneaid.
atas saran dan masukan dalam penelitian ini. Semin. Nas. XI Pendidik. Biol. FKIP UNS.
Terima kasih kepada Sekretariat Risbinkes 2014:65–70.
Badan Litbangkes atas izin dan dukungan 8. Darmono TW. Analisis keragaman genetik
pembiayaan oleh DIPA Sekretariat badan Ganoderma spp . yang berasosiasi dengan
Litbangkes. tanaman kakao dan tanaman pelindungnya
menggunakan Random Amplified
Polymorphic DNA ( RAPD ). 2011;79(1):6–14.
DAFTAR PUSTAKA
9. Novita L. Analisis genetik karakter morfo-
1. Boesri H. Peranan Anopheles barbirostris Van agronomi jarak pagar hasil pemuliaan
Der Wulp Sebagai Penular Penyakit. BALABA. berbasis pendekatan kuantitatif dan
2011;vOL 7 NO 1:7–15. molekuler. Tesis. 2013:1–50.
2. Elyazar IRF, Sinka ME, Gething PW, et al. The 10. Amanda U darmania, Cartealy imam civi.
distribution and bionomics of anopheles malaria Isolasi RNA total dari mesokarp buah kelapa
vector mosquitoes in Indonesia. 1st ed. Elsevier sawit (Elaeis guineenssis Jacq. var. Tenera).
L t d . ; 2 0 1 3 : 1 7 3 – 2 6 6 . Av a i l a b l e a t : Proceeding Semin. Nas. Masy. Biodivers.
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/2387 Indones. 2015;1 Nomor 2(April):171–176.
6873. Accessed May 17, 2016. A v a i l a b l e
3. Noshirma M, Willa RW, Wayan N, et al. Nyamuk at:http://biodiversitas.mipa.uns.ac.id/M/M
Anopheles barbirostris. Media Litbang Kesehat. 0101/M010101.pdf. Accessed October 25,
2012;22 Nomor 4:161–166. 2015.
4. Santoso,yahya, Nungki hapsari suryaningtyas 11. Invitrogen. User Manual : PureLink Genomic
katarina sri rahayu. Deteksi mikrofilaria Brugia DNA Mini Kits for purification of Genomic
malayi pada nyamuk Mansonia spp dengan DNA, invitrogen. In: ; 2007:8–9.
pembedahan dan metode PCR di Kabupaten 12. Kate-ngam S, Lakote P. A comparative study of
Tanjung Jabung Timur. Aspirator. 2015;7 No different RAPD-PCR protocols for genetic
1(April):29–35. diversity analysis of Doritis germplasm.
5 . M u h a m m a d R , M u k r i m i n , G u s m i a t y. 2008;39(3):203–206.
Optimalisasi Teknik Ekstraksi dan Isolasi DNA 13. Hasmiwati, Sujadi, F.A S. Analisis Genetik
Tanaman Suren (Toona Sureni Merr.) untuk Anopheles balabacensis Baisas (Diptera :
Analisis Keragaman Genetik berdasarkan Culicidae) dari Daerah Bangko (Jambi) dan
Random Amplified Polymorphic DNA (RAPD). Purworejo (Jawa Tengah) Dengan Random
J. Natur Indones. 14(2), Februari 2012 138-142 Amplified Polymorphic DNA (RAPD) PCR.
ISSN 1410-9379. 2012;2:138–142. Maj. Kedokt. Andalas. 2006;30 No 2:70–80.

10