PAPER PENGANTAR

TOKSIKOLOGI KLINIK

OLEH:

Ni Made Dwi Priska Dana

P07134017030

SEMESTER IV / A

KEMENTERIAN KESEHATAN REPUBLIK INDONESIA

POLITEKNIK KESEHATAN DENPASAR

JURUSAN ANALIS KESEHATAN

2019
 BAB I

PENDAHULUAN

1.1 Latar Belakang

Toksikologi adalah ilmu yang penting. Ia merupakan dasar kuat dalam merancang upaya
perlindungan kesehatan para pekerja terhadap toksikan dalam pabrik, lahan pertanian, tambang
dan lingkungan kerja lainnya. Toksikologi akan terus berperan penting bagi kesehatan dan
kesejahteraan dunia. WHO telah melakukan kursus pelatihan toksikologi di cina pada
tahun1982, sebagai bagian dari program kerja sama cina-WHO dalam ilmu-ilmu kedokteran.

1.2 Rumusan Masalah

1. Apa yang dimaksud dengan toksikologi ?

2. Apa sajakah ruang lingkup toksikologi ?
3. Apa saja dasar-dasar toksikologi klinik ?
4. Apa saja klasifikasi dari bahan toksikologi ?
5. Bagaimanakah efek dari suatu zat toksik ?
6. Bagaimanakah efek obat dari suatu zat adiktif ?

1.3 Tujuan
1. Untuk mengetahui definisi dari toksikologi
2. Untuk mengetahui tentang ruang lingkup toksikologi
3. Untuk mengetahui dasar-dasar dari toksikologi klinik
4. Untuk mengetahui klasifikasi dari bahan toksikologi
5. Untuk mengetahui efek toksik dari suatu zat
6. Untuk mengetahui efek obat dari suatu zat adiktif
 BAB II

ISI

2.1 Pengertian Toksikologi Klinik

Toksikologi didefinisikan sebagai kajian tentang hakikat dan mekanisme efek toksik berbagai
bahan terhadap mahluk hidup dan sistem biologik lainnya. Ia juga membahas penilaian
kuantitatif tentang berat dan kekerapan efek ini sehubungan dengan terpajannya mahluk hidup
tadi (C. Lu, Frank. 2010). Toksikologi merupakan cabang dari farmakologi yang berkembang
pesat karena didorong oleh penggunaan senyawa kimia yang semakin luas dan banyak. Saat ini
dapat dikatakan bahwa manusia tidak dapat hidup tapa xenobiotika (zat yang berasal dari luar
tubuh). Pemanfaatan xenobiotik (zat kimia saja) oleh manusia sebenarnya untuk tujuan yang
baik, misalnya untuk meningkatkan derajad kesehatan, mencukupi kebutuhan panagan,
mencukupi kebutuhan sarana dan prasarana dan transportasi. Kerana tidak dapat
meghindaripenggunaan zat kimia dalam kehidupan, maka manusia harus mempelajari sifat-sifat
toksik dari berbagai zat kimia yang digunakan, bagaimana mekanisme timbulnya efek toksik,
sehingga kita dpaat meminimalisir dampak negatif dari penggunaan zat kimia tersebut (Priyanto.
2010).

2.2 Ruang Lingkup Toksikologi Klinik

Toksikologi cakupannya sangat luas. Menangani Toksikologi bahan-bahan kimia yang

digunakan (1) di bidang kedokteran untuk tujuan diagnostik, pencegahan, dan terapeutik, (2)
dalam industri makanan sebagai zat tambahan langsung maupun tak langsung, (3) dalam
pertanian sebagai pestisida, zat pengatur pertumbuhan, penyerbuk buatan, dan zat tambahan
makanan hewan, dan (4) dalam industri kimia sebagai pelarut, komponen, dan bahan antara bagi
plastik serta bnyak jenis bahan kimia lainnya. Disini juga memplajari pengaruh logam (misalnya
dalam pertambangan dan tempat peleburan), produk minyak bumi, kertas dan pulpa, tumbuhan
beracun, dan racun hewan terhadap kesehatan.

Karena bidangnya yang luas, dan agar berbagai sasaran terpenuhi, toksikologi terbagi atas
sejumlah subdisiplin. Misalnya, seeorang mungkin terpajan, secara sengaja atau tidak sengaja,
pada sejumlah besar toksikan, dan mengalami keracunan hebat. Kalau identitas toksikan ini
tidak diketahui, toksikologi analitik diperlukan untuk mengenali lewat analisi cairan tubuh, isi
lambung, tempat makanan yang dicurigai, dll. Para praktisi toksikologi klinik akan memberikan
antidotumnya, bila ada, untuk mengatasi toksisitas khusus, dan mengupayakan tindakan untuk
menghilangkan gejala dan mengeluarkan racun secepatnya dari tubuh. Masalah hukum dalam
kasus ini merupakan tugas toksikologi forensik.

Keracunan mungkin terjadi akibat pajanan zat beracun di tempat kerja. Ini mungkin
mengakibatkan efek buruk yang akut maupun kronik. Keduanya merupakan maslah dibidang
toksikologi kerja. Masyarakat umum terpajan berbagai jenis toksikan lewat udara dan air di
samping lewat makanan yaitu berupa zat tambahan makanan, pestisida, dan pencemaran.
Pajanan ini sering sedemikian ringan sehingga secara akut tidak membahayakan tetapi dapat
memberikan efek buruk pada jangka panjang. Sumber bahan-bahan ini, transpornya, degradasi,
 dan biokonsentrasinya di lingkungan, serta pengaruhnya terhadap manusia di bahas dalam
toksikologi lingkungan. Toksikologi hukum mencoba melindungi masyarakat dengan membuat
undang-undang, peraturan, dan standar yang membatasi atau melarang penggunaan zat kimia
yang sangat beracun, juga dengan menentukan syarat penggunaan zat kimia lainnya. Apendiks
1-1 berisi daftar undang-undang yang relevan di AS. Perundang-undangan dan peraturan lainnya
telah disusun oleh Merril (1989).

2.3 Dasar-Dasar Toksikologi Klinik

Dalam lingkup toksikologi sering digunakan beberapa istilah yang mirip yaitu, racun, toksin,
toksikan yang memiliki arti yang mirip tetapi berbeda. Berikut beberapa definisi yang perlu
dipahami.
1. Racun Menurut Taylor, “Racun adalah setiap bahan atau zat yang dalam jumlah tertentu bila
masuk ke dalam tubuh akan menimbulkan reaksi kimiawi yang akan menyebabkan penyakit dan
kematian”. Menurut Dorland Dictionary: Racun adalah setiap zat yang bila dalam jumlah
sedikit ditelan atau dihirup atau diserap atau dioleskan atau disuntikkan ke dalam tubuh atau
dihasilkan dalam tubuh, memiliki aksi kimiawi dan menyebabkan kerusakan pada struktur atau
gangguan fungsi yang menimbulkan gejala, penyakit atau kematian.
2. Toksin (poison) adalah zat yang memiliki efek berbahaya pada organisme hidup. Sedangkan
toksin adalah racun yang diproduksi oleh organisme hidup. “Bisa”(venom) adalah racun yang
disuntikkan dari organisme hidup ke makhluk lain. “Bisa” (venom) adalah toksin dan toksin
adalah racun, tidak semua racun adalah toksin, tidak semua toksin adalah venom.
3. Venom atau “bisa” adalah toksin, karena toksin didiskripsikan secara sederhana sebagai
bahan kimia yang diproduksi secara biologis yang mengubah fungsi normal organisme lain.
4. Toksikan adalah produk alami seperti yang ditemukan pada jamur beracun, atau racun ular.
Toksikan adalah produk buatan manusia, produk buatan yang dipaparkan ke lingkungan karena
aktivitas manusia; Contohnya adalah produk limbah industri dan pestisida.
5. Toksoid adalah toksin yang tidak aktif atau dilemahkan. Toksin adalah racun yang dibuat oleh
organisme lain yang bisa membuat kita sakit atau membunuh kita. Dengan kata lain, toksin
beracun. Toksoid tidak lagi beracun tetapi masih sebagai imunogenik sebagai toksin dari mana
ia berasal.
6. Xenobiotik berasal dari bahasa Yunani: Xenos yang artinya asing. Xenobiotik adalah zat
asing yang secara alami tidak terdapat dalam tubuh manusia. Contoh: obat obatan, insektisida,
zat kimia.
2.4 Klasifikasi dari Bahan Toksikologi Klinik

Adapun klasifikasi Bahan Toksik, terdiri dari :

1. Berdasarkan sumbernya, bahan toksik dapat diklasifikasikan sebagai berikut:
a. Toksin tanaman
b. Toksin hewan
c. Toksin lingkungan (air, tanah, udara)
2. Berdasarkan senyawanya:
a. Logam berat
 b. Senyawa organik
c. Racun gas
3. Berdasarkan penggunaannya:
a. Obat-obatan
b. Pestisida
c. Pelarut organik
d. Logam berat

2.5 Efek Toksik suatu zat

Toksisitas merupakan istilah relatif yang biasa dipergunakan dalam memperbandingkan satu zat
kimia dengan lainnya adalah biasa untuk mengatakan bahwa satu zat kimia lebih toksik daripada
zat kimia lain. Perbandingan sangat kurang informatif, kecuali jika pernyataan tersebut
melibatkan informasi tentang mekanisme biologi yang sedang dipermasalahkan dan juga dalam
kondisi bagaimana zat kimia tersebut berbahaya. Oleh sebab itu, pendekatan toksikologi
seharusnya dari sudut telaah tentang berbagai efek zat kimia atas berbagai sistem biologi,
dengan penekanan pada mekanisme efek berbahaya zat kimia itu dan berbagai kondisi di mana
efek berbahaya itu terjadi.
Pada umumnya efek berbahaya atau efek farmakologik timbul apabila terjadi interaksi antara zat
kimia (tokson atau zat aktif biologis) dengan reseptor. Terdapat dua aspek yang harus
diperhatikan dalam mempelajari interakasi antara zat kimia dengan organisme hidup, yaitu kerja
farmakon pada suatu organisme (aspek farmakodinamik atau toksodinamik) dan pengaruh
organisme terhadap zat aktif (aspek farmakokinetik atau toksokinetik) aspek ini akan lebih detail
dibahas pada sub bahasan kerja toksik.

Efek toksik yang ditimbulkan oleh suatu zat akibatnya sangat bervariasi, tergantung dari zat,
target organ, mekanisme aksi, dan besarnya dosis. Pengetahuan yang baik tentang hal-hal di atas
akan meningkatkan kemampuan menilai keberbahayaan suatu zat. Selain itu juga bermanfaat
dalam melakukan tindakan pencegahan dan pengobatan jika terjadi efek toksik atau keracunan.

Semua efek toksik yang terjadi dimulai adanya interaksi biokimiawi antara zat toksik atau
metabolit aktifnya dengan bagian tertentu dari makhluk hidup atau reseptornya. Bagian tertentu
itu seperti enzim, protein, lemak, asam nukleat, organel sel, membrane sel atau bahkan berupa
jaringan.

Efek toksik dapat diklasifikasikan menurut beberapa cara antara lain berdasarkan target organ,
mekanisme kerja, spectrum, dan lain-lain.

1. Berdasarkan target organ, efek toksik dapat diklasifikasikan menjadi hepatotoksik,

neprotoksik, hemotoksik, genotoksik, ototoksik, neurotoksik, immunotoksik,

2. Berdasarkan waktu dan tempat efek toksik timbul. Efek toksik dapat diklasifikasikan menjadi
sebagaimana yang tercantum dalam tabel dibawah ini :

Paparan Tempat Efek penyebab

 Akut Local Iritasi kulit Metilamin

Cedera paru-paru Hydrogen klorida

Sistemik Cedera ginjal Fenasetin

Hemolisis Arsen

Campuran mathemoglobinemia Nitrogen oksida

Berulang Local Sensitisasi kulit Etilen diamin

jangka pendek
Sensitisasi paru Toluene

Ulcerasi hidung Kromat

Sistemik Neurotoksik akrilamid

Campuran Iritasi saluran pernapasan

dan neurobehavioural

Kronik Local Bronchitis Sulfur dioksida

Carcinoma laring Nitrogen mustard

Sistemik Leukemia Benzene

Angiosarkoma (liver) Vinil klorida

Empisema dan cedera ginjal

Campuran Pneumositis dan Cadmium, mangan

neurotoksik

2.6 Efek obat dari suatu zat adiktif

Mengingat psikotropika jumlahnya sangat banyak maka tidak semua diutarakan disini, tetapi hanya
beberapa yaitu amfetamin, ekstasi, LSD, dan Psilosibin. Ampetamin dan ekstasi menurut UU No. 35
Tahun 2009 termasuk narkotika golongan I.

1. Amfetami
Amfetamin merupakan stimulan yang kuat, jauh lebih kuat dibandingan kafein dan
nikotin. Efek stimulasinya relatif sama dengan kokain tetapi durasinya lebih panjang, lebih
mudah diperoleh, dan harganya lebih murah. Oleh karena itu, penyalahgunaan banyak beralih
dari kokain ke amfetamin, speed adalah nama jalanan untuk zat ilegal yang terdapat
amfetamin. Produk ilegal, selain mengandung amfetamin juga dicampur dengan klorokuin,
efedrin, papaverin, atau kafein. Di Indonesia produk campuran diatas sering disebut sebagai
amfetamin “abal-abal”. Amfetamin hasil penangkapan di Australia rata-rata mengandung
amfetamin sekitar 5%.
 a. Mekanisme Efek Amfetamin
Efek amfetamin atau ATS pada umumnya karena kemampuannya dalam mendorong
pelepasan NE dan dopamin dari tempat penyimpanannya diujun saraf presinaptik. Efek
yang timbul pada sistem saraf perifer kemungkinan hasil dari peningkatan kadar NE.
Perubahan perilaku dan peningkatan aktifitas psikomotor yang muncul karena
peningkatan perangsangan reseptor dopamin di sistem mesolimbik (termasuk nukleous
accumbent).
b. Efek Amfetamin Dosis Normal
1) Menstimulasi sistem saraf simpatik menimbulkan efek peningkatan denyut jantung,
pernapasan cepat, mulut kering, berkering, midriasis, dan sakit kepala.
2) Merasa lebih berernergi dan waspada, banyak bicara, dan rahang menegangkan
(gerakan mengunyah).
3) Mengurangi nafsu makan.
4) Respon yang berlebihan terhadap suatu rangsangan.
c. Amfetamin Dosis Tinggi
Dosis tinggi amfetamin menyebabkan kulit pucat, sakit kepala, dizziness, pandangan
kabur, tremor, denyut nadi tidak teratur, kram perut, berkeringat, resah, napas tidak
teratur, dan hilangnya koordinasi (ataksia). Selain itu, amfetamin dosis tinggi dapat
menyebabkan psikosis.
d. Efek Jangka Panjang
Untuk mengurangi efek diatas pengguna mengatasinya dengan minum alkohol,
benzodiasepin, dan kanabis. Efek tambahan pada penggunaan jangka panjang meliputi:
 Malnutrisi, karena amfetamin mengurangi napsu makan
 Mudah terkena infeksi karena penggunaan jangka panjang menyebabkan kurang
tidur dan kurang gizi
 Berperilaku keras dan kasar
 Kerusakan otak
 Toleransi dan ketergantungan
2. Ekstasi
Ekstasi adalah nama jabatan (street name) dari 3,4 metilen dioksi metamfetamin
(MDMA). Selain mempunyai efek stimulasi seperti amfetamin, ekstasi juga mempunyai efek
halusinogen seperti lisergid acid diethylamine (LSD). Ekstasi di Indonesia kadang – kadang
berisi campuran dari amfetamin, MDMA, metafetamin (MA), dan metilen dioksi
ethamfetamin (MDEA) yang semua itu sering disebut amfetamin type stimulant (ATS). Dari
zat diatas amfetamin dan metamfetamin mempunyai efek stimulansia. MDMA dan MDEA
selain dapat sebagai stimulansia juga menimbulkan halusinasi, dan zat demikian disebut
entagtogen.
a. Efek Ekstasi
Segera setelah meminum ekstasi akan timbul efek seperti:
 Mual dan muntah
 Tubuh terasa panas (suhu tubuh meningkat)
 Jantung berdebar (perangsangan simpatik)
 Ketegangan otot terutama rahang (gerakan mengunyah)
  Pupil melebar sehingga susah melihat dengan fokus
 Bingung dan panik
Efek diatas umumnya akan hilang setelah 1 jam bersamaan tercapainya
keseimbangan antara absorpsi dan eliminasi (plateu). Setelah efek diatas dilalui
akan timbul seperti:
 Euforia
 Sensasi terhadap sinar, suara dan sentuhan meningkat sehingga sesuatu yang
normal kelihatan lebih baik
 Meningkatkan rasa ingin berdekatan (romantis), terbuka, dan cinta maka disebut
“love drug”
 Energi meningkat, percaya diri dan bnayak bicara
 Berkeringat, dehidrasi dan sangat haus
 Iritasi, iritable, gelisah dan paranoid
b. Efek Jangka Panjang
Ekstasi bekerja secara tidak langsung mendorong pelepasan serotonin (neurotransmiter),
efek sebagaimana disebutkan diatas karena kadar serotonin dalam darah meningkat.
c. Efek Ekstasi yang lain
Peningkatan suhu tubuh dapat tidak terkendali lebih-lebih jika dipakai dilingkungan night
club yang lembab, panas, dan untuk aktivitas dansa bejam-jam. Suhu tubuh yang tinggi
akan menyebabkan banyak keringat keluar sehingga timbul dehidrasi.
3. LSD
LSD termasuk halusinogen yaitu zat yang dapat menimbulkan halusinasi. Halusinasi
adalah timbulnya perubahan presepsi pada seseorang yang menyebabkan adanya sesuatau
yang terlihat atau terdengar tetapi sebenarnya tidak ada. Selain LSD zat yang dapat
menimbulkan efek seperti ini adalah kanabis, MDMA, MDEA, psilosibin, dan tanaman
datura (kecubung).
Efek halusinasi dapat menimbulkan sensasi yang menyenangkan atau sebaliknya.
a. Efek setelah makan LSD
 Obat terasa melilit atau sakit
 Lemah, mati rasa dan gemetar
 Mual, muntah, dan terasa tergoncang-goncang
 Denyut jantung dan tekanan darah tinggi
 Pernafasan cepat dan dalam
 Gangguan koordinasi
b. Halusinasi karena LSD
 Warna kelhatan lebih cerah,suara lebih keras dan tajam
 Distorsi ruang dan waktu
 Tubuh terasa terbang dan bagian dari benda lain
 Emosional swing (tiba-tiba berubah dari gembira ke sedih tanpa alasan atau
sebaliknya)
 Halusinasi flas back (merasa mengalami peristiwa lampau) walaupun sudah lama
tidak menggunakan LSD.
c. Efek halusinasi yang menakutkan
  Cemas dan takut yang luar biasa
 Ada laba-laba yang menjalar diseluruh tubuh
 Panik yang dapat merangsang perbuatan yang beresiko
 Paranoid
 Bunuh diri
4. Psilosibin (Magic Mushroom)
Psilosibin adalah halusinogen yang terdapat pada jamur yang tumbuh pada kotoran
sapi, kuda, dan kerbau. Secara kimiawi psilosibin mirip dengan LSD sehingga mempunyai
efek yang serupa. Zat ini sering digunakan oleh suku-suku tertentu pada saat upacara adat.
 BAB III

PENUTUP

3.1 KESIMPULAN

Toksikologi merupakan cabang dari farmakologi yang berkembang pesat karena didorong oleh
penggunaan senyawa kimia yang semakin luas dan banyak. Toksikologi cakupannya sangat
luas. Menangani Toksikologi bahan-bahan kimia yang digunakan (1) di bidang kedokteran
untuk tujuan diagnostik, pencegahan, dan terapeutik, (2) dalam industri makanan sebagai zat
tambahan langsung maupun tak langsung, (3) dalam pertanian sebagai pestisida, zat pengatur
pertumbuhan, penyerbuk buatan, dan zat tambahan makanan hewan, dan (4) dalam industri
kimia sebagai pelarut, komponen, dan bahan antara bagi plastik serta bnyak jenis bahan kimia
lainnya. Dalam lingkup toksikologi sering digunakan beberapa istilah yang mirip yaitu, racun,
toksin, toksikan. Adapun klasifikasi Bahan Toksik,yang berdasarkan sumbernya, senyawanya,
penggunaannya. Efek toksik yang ditimbulkan oleh suatu zat akibatnya sangat bervariasi,
tergantung dari zat, target organ, mekanisme aksi, dan besarnya dosis. Pengetahuan yang baik
tentang hal-hal di atas akan meningkatkan kemampuan menilai keberbahayaan suatu zat.
 DAFTAR PUSTAKA

C. Lu, Frank. 2010. Toksikologi Dasar. Terjemahan oleh Edi Nugroho. Jakarta: Universitas
Indonesia

Priyanto. 2010. Toksikologi, Mekanisme, Terapi Antidotum, dan Penilaian Resiko. Jawa Barat:
Lembaga Studi dan Konsultasi Farmakologi
 RESUME PEMERIKSAAN DALAM BIDANG

TOKSIKOLOGI KLINIK

OLEH:

Ni Made Dwi Priska Dana

P07134017030

SEMESTER IV / A

KEMENTERIAN KESEHATAN REPUBLIK INDONESIA

POLITEKNIK KESEHATAN DENPASAR

JURUSAN ANALIS KESEHATAN

2018
Pendahuluan/latar belakang riset 1

Upaya pencarian bahan obat yang berasal dari alam merupakan langkah strategis dalam
rangka mengoptimalkan keunggulan komparatif yang ada, salah satunya untuk mengatasi keluhan
kondisi hiperuresemia. Hiperuresemia merupakan salah satu kelainan metabolisme yang ditandai
dengan kadar asam urat tinggi. Penelitian sebelumnya membuktikan bahwa kombinasi ekstrak
gambir (Uncaria gambir) dan secang (Caesalpinia sappan), yang selanjutnya akan disebut dengan
formula herbal (FH), mampu menurunkan kadar asam urat darah tikus hiperuresemia yang diinduksi
menggunakan kalium oksonat. Penelitian toksisitas terhadap ekstrak secang dan gambir secara
tunggal telah dilakukan sebelumnya. Secang dalam bentuk sediaan infus yang diberikan baik dosis
tunggal dan jangka panjang 30 hari tidak menyebabkan mortalitas dan gangguan efek toksik hewan
coba. Pengujian keamanan dari kombinasi kedua ekstrak tersebut belum pernah dilakukan. Oleh
karena itu, penelitian ini dilakukan dengan tujuan melakukan pembuktian keamanan jangka panjang
(subkronis) FH pada hewan coba secara in vivo.

Metode : metode uji yang digunakan yaitu metode in vivo karena menggunakan hewan percobaan
yaitu hewan tikus.

Alat dan bahan

Adapun alat yang digunakan yaitu : kandang individual hewan tikus (Rital), timbangan hewan
(Kern), spektrofotometer UV-Vis (Thermo), mikrosentrifus (mikro22 Hettich zentrifuge), dan
mikropipet (Ependrof), serta perlengkapan berupa tabung plastik sekali pakai 1,5 mL (Axigen).

Adapun bahan yang digunakan yaiu : kombinasi ekstrak gambir dan secang.

Prosedur :

 Perlakuan hewan coba

a. Hewan coba diaklimatisasi pada kondisi percobaan (siklus cahaya dibuat gelap dan terang
12 jam, suhu 23±3°C, kelembapan ruangan 50%-70%) selama sekitar 7 hari kemudian
dikelompokkan secara acak menjadi 4 kelompok terdiri dari 8 ekor jantan dan 8 ekor betina
per kelompok, yaitu DOSIS-1 (75 mg/kg bb), DOSIS-2 (300 mg/kg bb), DOSIS-3 (1200 mg/kg
bb) dan kontrol tanpa perlakuan. Hewan ditempatkan dalam kandang individual yang
terbuat dari polikarbonat dengan jumlah tikus 4 ekor setiap kandang yang dipisahkan antara
tikus betina dan tikus jantan. Tikus diberi pakan standar dan minum dalam jumlah ad
libitum. FH disuspensikan dalam pembawa larutan CMC 0,5% secara aseptik sesuai masing-
masing dosis dengan volume pemberian sebesar 1 mL/100 g bb. FH diberikan menggunakan
sonde lambung setiap hari pada jam 08.00-10.00 WIB, kecuali kelompok kontrol diberi
pembawa.
b. Penimbangan berat badan dilakukan sekali seminggu selama pengujian.
c. Selanjutnya setelah 7 minggu pemberian FH, dilakukan analisis biokimia darah.
 Analisis parameter uji
a. analisis biokimia darah untuk parameter hati (kadar ASAT dan ALAT, gama GT, dan
bilirubin total) dan parameter kesehatan ginjal (kadar urea dan kreatinin) menggunakan
 reagen diagnostik Diasys secara spektrofotometri dengan mengikuti protokol uji yang
tersedia
 Pengolahan data
a. Analisis statistik menggunakan metode oneway ANOVA untuk data parameterik atau
Kruskal Wallis untuk data non parameterik. Semua analisis statistik dilakukan menggunakan
program SPSS 13 pada tingkat kepercayaan 95% (p=0,05)

Hasil dan pembahasan :

Hasil pengukuran biokimia darah disajikan pada Tabel 1 (hewan jantan) dan Tabel 2 (hewan
betina). Data kesehatan ginjal, yaitu kadar urea dan kreatinin, menunjukkan bahwa nilai kedua
parameter tersebut tidak berbeda bermakna antara kelompok perlakuan FH dibanding kontrol
(p>0,05), baik pada hewan jantan maupun betina. Hal yang sama juga diamati pada parameter
kesehatan hati yaitu kadar ASAT, ALAT, gama-GT dan bilirubin total, yakni tidak terdapat
perbedaan yang bermakna antara kelompok perlakuan pada ketiga dosis dan kontrol (p>0,05), baik
pada hewan jantan dan betina. Hal ini berarti bahwa pemberian FH hingga 16 kali dosis efektif
selama 7 minggu tidak menunjukkan adanya gangguan organ ginjal dan hati.

Hasil pengukuran hematologi lengkap dengan 10 parameter disajikan pada Tabel 2. Secara
statistik, pada hewan jantan, semua parameter hematologi tidak berbeda bermakna antara ketiga
kelompok perlakuan FH dibanding kontrol (p>0,05). Sementara itu, pada hewan betina juga
menunjukkan hasil yang sama kecuali pada kelompok DOSIS-2 dimana kadar neutrophil (NEUT)
menunjukkan ada perbedaan bermakna dibanding kontrol (p<0,05). Kondisi ini menunjukkan bahwa
hewan betina lebih rentan dibanding hewan jantan. Penelitian sebelumnya membuktikan bahwa
pengujian toksisitas umumnya menunjukkan bahwa hewan betina lebih sensitif dibandingkan hewan
jantan
 Hasil skoring derajat kerusakan organ hati, ginjal, lambung, usus halus dan jantung (Tabel 3)
menunjukkan bahwa pada kontrol jantan dan betina ditemukan adanya kelainan atau lesi dengan
derajat ringan pada organ hati dan ginjal. Hal ini menunjukkan bahwa hewan yang digunakan tidak
termasuk jenis specific pathogen free (SPF), sehingga kemungkinan adanya lesi sudah merupakan
bawaan hewan tersebut. Analisis histologi pada kelompok yang diberi dosis 1, hewan jantan dan
betina, ditemukan adanya perubahan histologi/lesi khususnya pada organ hati, ginjal, jantung dan
usus halus, namun kelainan tersebut secara statistik tidak berbeda bermakna dibandingkan dengan
kontrol (p>0,05).

Secang juga memiliki perlindungan terhadap kerusakan hati melalui mekanisme antioksidan.
Pemberian ekstrak etanol secang pada dosis 500 mg/kg BB mampu meningkatkan enzim-enzim
antioksidan tikus yang dipapar dengan parasetamol seperti superoksida dismutase (SOD) dan
katalase (CAT) serta kelompok glutation seperti glutathione peroxidase (GPX), glutathione-s-
transferase (GST) dan reduced glutathione (GSH). Selain itu, secang juga mampu memperbaiki
makroinflamasi yang setara dengan silimarin 25 mg/kg BB akibat induksi parasetamol. Keamanan
ekstrak gambir telah diteliti dalam beberapa penelitian sebelumnya. Hasil analisis sitotoksisitas in
vitro ekstrak etanol gambir terhadap sel Vero menunjukkan nilai IC50 antara 400-500 ppm. Graidist
P et al menyatakan bahwa sampel ekstrak bahan alam yang mempunyai nilai IC50 lebih besar dari
80 ppm pada uji sitotoksisitas terhadap sel kontrol in vitro termasuk dalam kategori kurang toksik.
Uji sitoksisitas terhadap ekstrak air gambir terhadap sel epitel intestinal lestari IEC-6 menunjukkan
bahwa sampai konsentrasi 200 ppm, tingkat kehidupan sel masih bertahan hingga 93%.
 Sampel uji merupakan kombinasi dari ekstrak bahan alam sehingga terdapat kemungkinan
terjadi interaksi antar komponen, terutama interaksi yang bersifat antagonis pada dosis yang lebih
tinggi. Ketepatan dosis adalah salah satu faktor penting dalam menentukan sukses tidaknya terapi
dengan obat tradisional. Selain itu, efek kontra indikasi antara beberapa senyawa aktif pada obat
tradisional juga dapat terjadi, misalnya efek antioksidan akan berkurang jika dosis gambir terlalu
tinggi.

Hasil penelitian ini sejalan dengan hasil studi yang dilakukan oleh Hilpiani yang melakukan
uji toksisitas akut terhadap ekstrak etil asetat gambir. Ditemukan adanya lesi pada organ hati berupa
sel radang akut pada dosis pemberian 8000 mg/kg BB, sedangkan pada dosis 1000, 2000 dan 4000
mg/kg BB tidak terdapat lesi yang bermakna.

Jurnal yang digunakan : Uji Toksisitas Subkronik Kombinasi Ekstrak Daun Uncaria gambir dan
Caesalpinia sappan

Pendahuluan/ latar belakang riset 2

Pembuangan berlebihan beberapa konstituen, seperti padatan tersuspensi, nutrisi, mikroorganisme

dan toksik senyawa dari air limbah kota menjadi air ekosistem menyebabkan kualitas air tidak cocok
untuk kelangsungan hidup atau pertumbuhan organisme akuatik. Kota air limbah mengandung
spektrum luas kontaminan (Rowsell et al., 2010).

Sebagian besar pabrik pengolahan air limbah tidak mengolah semua jenis kontaminan dan bagian
baru yang muncul senyawa terutama bahan kimia organik dan metabolit dapat lolos dari eliminasi
dalam pengobatan tanaman dan memasuki lingkungan air. Sebuah angka Studi telah menunjukkan
terjadinya kontaminan organik dalam air limbah kota limbah pabrik pengolahan.

Sejumlah spesies dari keluarga Daphnidae adalah digunakan untuk uji toksisitas yang sangat umum.
Selain mereka direkomendasikan untuk pengujian (USEPA, 2002), the organisme umumnya tersedia
sepanjang tahun dan mudah dibudidayakan di laboratorium. Sebagai tambahannya ini, daphnids
sensitif terhadap berbagai polutan dan telah banyak digunakan sebagai organisme biotest untuk
mengevaluasi berbagai zat beracun (ISO, 1996; Sarma dan Nandini, 2006; Sánchez- Meza et al.,
2007; Oral et al., 2007; Tatarazako dan Oda, 2007).

Dalam penelitian ini, spesies yang umum seperti kutu air tawar D. magna (Cladocera, Crustacea)
adalah digunakan untuk menilai toksisitas akut yang tidak diobati dan air limbah olahan dari air
limbah kota pabrik pengolahan di Manisa, Turki. Tujuan dari Penelitian ini adalah untuk menyelidiki
keamanan pemakaian limbah cair kota menjadi air tawar organisme untuk melindungi biota air dan
mencapai standar kualitas air.

Metode : dalam penelitian ini D.magna dikultur dan ditangani sesuai dengan prosedur yang
diuraikan dalam badan perlindungan lingkungan AS (USEPA)

Alat dan bahan

Adapun alat dan bahan yang digunakan diantaranya sampel yang disimpan dalam kotak dan keadaan
gelap di lemari es pada suhu 4 derajat,
Prosedur

Untuk mengkarakteristik kualitas air parameter pengaruh dan efluen MMWTP, seperti ph, COD,
BOD dan TSS diukur. Dalam penelitian ini D. magna dikultur, limbah akut dan keseluruhan dari
toksisitas yang dilakukan mengikuti USEPA. Pengujian konsentrasi dimulai dari 0,1% hingga 100%
ditetapkan oleh pengenceran air limbah yang tidak diolah(mentah) dan diolah.

Hasil dan pembahasan

Hasil analisis kimia dari air limbah disajikan pada tabel 1.

Tabel 1 karakteristik kimia dari air limbah yang tidak diolah dan dikumpulkan dari MMWTP

Salah satu parameter penting yaitu ph, yang pengukurannya menunjukkan tidak ada perbedaan yang
signifikan antara yang dirawat dan yang tidak diolah dalam ph interval. Menurut hasil pemeriksaan
COD dan BOD, nilainya dalam wastewater dan MMWTP berkurang setelah perawatan, yang
membuktikan D.magna bekerja dengan baik. Mengikuti proses perawatan, nilai BOD dan COD
ditemukan berada di dalam batas pembuangan . pengukuran nilai TSS menunjukkan bahwa mereka
berada dalam batas standar. Di samping itu karakteristik kmia dari limbah MMWTP diuji dalam
penelitian ini konsisten dengan peraturan criteria pemakaian limbah.

Hasil parameter fisikokimia diukur dalam air limbah menunjukkan penurunan yang signifikan,
penurunan nilai tes sementara tes toksisitas aktif D. magna tidak menunjukkan pengurangan(Tabel
2)

Tabel 2 mortalitas D.magna terpapar pada konsentrasi yang berbeda dari limbah yang diolah dan
tidak diolah.

Penelitian ini menunjukkan bahwa limbah cair bisa berbahaya bagi biota bahkan jika terbukti
memnuhi standar untuk pembuangan air batas, karena pengukuran jumlah yang memadai parameter
fisikokimia memerlukan penentuan standar batas pembuangan. .

Jurnal yang digunakan : Daphnia magna as a Test Species for Toxicity Evaluation of Municipal
Wastewater Treatment Plant Effluents on Freshwater Cladoceran in Turkey
Pendahuluan/latar belakang riset 3

Secara tradisional daun rosella (warna kemerahan dengan hijau panjang 10-15 cm dan memiliki rasa
asam) digunakan untuk keperluan pengobatan di cina dan india dalam mengendalikan tekanan darah
tinggi, nyeri haid, pireksia, dan kerusakan hati(Link et al. 2007). Ekstrak daun rosella tidak beracun
dan memiliki hipoglikemia, hipolipidemia, antioksian, efek estrogenic dan efek antikanker( Link et
al. 2012).

CN atau yang biasa dikenal dengan rumput ular atau belalai gajah secara luas dikenal sebagai
tanaman obat tradisional di asia tenggara yang biasa dikonsumsi sebagai teh untuk mengobati kanker
dan diabetes, dan juga digunakan untuk mengobati infeksi virus, kulit ruam,gigitan serangga dan
ular.

Stevia rebaudiana (stevia) adalah semak kecil abadi dan berkayu di keluarga asteraceae dan telah
digunakan sebagai pengganti gula, yang berguna untuk menurunkan kadar gula darah, tumbuhan ini
juga dikenal sebagai ramuan manis, daun madu,daun permen atau madu yerba (carakostas et al.
2008)

Metode : Adapun metode yang digunakan yaitu dengan cara in vivo karena dengan menggunakan
hewan percobaan

Alat dan bahan

Adapun alat dan bahan yang digunakan diantaranya daun HS, CN dan Stevia dikeringkan pada
pengering oven komersial suhu 40 derajat hingga kadar air dibawah 10% , hewan percobaan(20
sprague dawley tikus perempuan)

Prosedur

Ekstrak campuran herbal disiapkan dengan konsentrasi yang berbeda pada tiga tempat untuk studi
toksisitas oral. Mempersiapkan hewan percobaan yang dikelompokkan menjadi 4 kelompok, sebuah
control dan 3 kelompok perlakuan(setiap sampel dicatat bobot, detail fisik pemeriksaan bulu, kulit
dan kesehatan yang dilakukan 2 kali dalam masa aklimatisasi untuk memastikan status hewan yang
sehat. Selama penelitian hewan-hewan diberikan ad libitum dengan di pellet standard dan air suling.

melakukan pemeriksaan hematologi dan analisis serum biokimia , dimana hewan-hewan dipuasakan
sekitar 12 jam dan sampel darah diambil untuk analisis hematologi dan biokimia untuk aspartate
aminotransferase (AST),(ALT), dsb. Semua data dinyatakan sebagai standar deviasi dan ANOVA
menggunakan sistem SAS ver 9,0.

Hasil dan pembahasan

Tidak ada kelainan dalam tanda-tanda klinis termasuk kematian yang terlihat pada tikus. Pada
gambar 1 menunjukkan peningkatan berat badan yang tidak signifikan antara control dan kelompok
hewan percobaan. Hasil menunjukkan bahwa tikus yang dirawat berat badan positif naik yang berarti
tidak ada efek racun dari campuran sama sekali, perubahan berat badan telah digunakan sebagai
indicator efek samping obat dan bahan kimia.
Menurut mumoli et aal(2006) dan giannini et al(2005) mengemukkan bahwa hepatotoksik terkait
dengan peningkatan berat hati, aminotransferases dan alkaline phosphate. Namun demikian , dalam
penelitian ini pengurangan berat hati tidak meyakinkan yang dikaitkan dengan toksisitas sejak darah
profil enzimatik ada di dalam rentang referensi normal. Pada tabel juga menunjukkan konsentrasi
ALT,AST, bilirubin dan protein pada tikus Sprague dawley.

Jurnal yang digunakan : In-vivo toxicity studies of a mixture of Hibiscus sabdariffa L., Clinacanthus
nutans L. and Stevia leaves in Sprague Dawley rats
JURNAL NASIONAL

Uji Toksisitas Subkronik Kombinasi Ekstrak Daun Uncaria gambir dan Caesalpinia sappan

Sub-Chronic Toxicity Test of Uncaria gambir and Caesalpinia Sappan Combined Extract

Sri Ningsih*1, Kurnia Agustini1, Nizar1, Rini Damayanti2

1
Pusat Teknologi Farmasi dan Medika – Badan Pengkajian dan Penerapan Teknologi

Kawasan Puspiptek Serpong, Tangerang Selatan, Banten, Indonesia

2
Balai Besar Penelitian Veteriner, Bogor, Jawa Barat, Indonesia.

*E-mail : sri.ningsih@bppt.go.id

Diterima: 7 November 2017 Direvisi: 12 Februari 2017 Disetujui: 28 Februari 2017

Abstrak

Prevalensi hiperuresemia cenderung meningkat di masyarakat. Formula herbal (FH) mengandung

ekstrak Uncaria gambir (gambir) dan Caesalinia sappan (secang) terbukti menurunkan asam urat
secara in vivo. Penelitian ini bertujuan untuk menguji keamanan subkronis FH pada hewan tikus
galur Sprague Dawley jantan dan betina. Tikus dikelompokkan secara acak menjadi 4 kelompok,
yaitu DOSIS-1 (75 mg/kg BB), DOSIS-2 (300 mg/kg BB), DOSIS-3 (1200 mg/kg BB) dan kontrol
pembawa. FH diberikan secara peroral selama 7 minggu. Hasil menunjukkan bahwa pemberian FH
pada ketiga dosis uji tidak memengaruhi biokimia darah dan hematologi darah secara bermakna
dibandingkan kontrol (p>0,05), kecuali pada hewan betina DOSIS-2 menunjukkan kadar NEUT
lebih rendah dan berbeda bermakna dibanding kontrol (p<0,05). Gambaran histopatologi organ
ginjal, hati, jantung, usus halus, dan lambung menunjukkan tidak ditemukan ada lesi yang berbeda
bermakna dibanding kontrol (p>0,05), khususnya pada kelompok DOSIS-1. Selanjutnya, DOSIS-1
tidak memengaruhi konsumsi pakan dan berat badan hewan coba. Dapat disimpulkan bahwa
pemberian FH dosis 75 mg/kg BB selama 7 minggu tidak menyebabkan gangguan biokimia darah,
hematologi darah dan gambaran histopatologi ginjal, hati, jantung, usus halus, dan lambung.

Kata Kunci: Biokimia darah; Histopatologi; Uji toksisitas subkronik; Uncaria gambir;
Caesalpinia sappan

Abstract

Hiperuresemia prevalence tends to increase in society. A combined extract of Uncaria gambir

(gambir) and Caesalinia sappan (secang), had been proven to reduce blood uric acid level in vivo.
This study aimed to evaluate the subchronic toxicity of this combination in male and female Sprague
Dawley rat strain. Animals were randomly grouped into four groups, namely, DOSE-1 (75 mg/kg
bw), DOSE-2 (300 mg/kg bw), DOSE-3 (1200 mg/kg bw) and control group gavaged with carrier.
The tested sample was given for 7 weeks orally. The result of blood biochemical parameters were
not different significantly compared to control (p> 0.05), as well as the results of hematology
analysis. However, the NEUT level of female of DOSIS-2 showed lower and significantly different
compared to control (p <0.05). Histopathological evaluation of liver, kidney, heart, small intestine,
and stomach organs illustrated that no lesions found in animals especially in DOSE-1 compared to
control significantly (p>0,05). Furthermore, this dose did not influence feed intake and body weight
of animals in each sex. From this study, it could be concluded that the combination administrated at
the dose of 75 mg/kg bw for 7 consecutive weeks did not affect blood biochemistry and hematology
and also organ histopathology of kidney, liver, heart, small intestine, and stomach.

Keywords: Blood biochemistry; Histopathology; Subchronic toxicity test; Uncaria gambir;

Caesalpinia sappan
34
PENDAHULUAN
Indonesia adalah salah satu negara
dengan kekayaan sumber daya alam yang
melimpah. Upaya pencarian bahan obat yang
berasal dari alam merupakan langkah
strategis dalam rangka mengoptimalkan
keunggulan komparatif yang ada, salah
satunya untuk mengatasi keluhan kondisi
hiperuresemia. Hiperuresemia merupakan
salah satu kelainan metabolisme yang
ditandai dengan kadar asam urat tinggi.
Prevalensi penderita hiperurisemia
cenderung meningkat sepanjang tahun
sejalan dengan tingkat kemajuan status
ekonomi suatu masyarakat.1 Penelitian
sebelumnya membuktikan bahwa kombinasi
ekstrak gambir (Uncaria gambir) dan secang
(Caesalpinia sappan), yang selanjutnya akan
disebut dengan formula herbal (FH), mampu
menurunkan kadar asam urat darah tikus
hiperuresemia yang diinduksi menggunakan
kalium oksonat. Pemberian FH pada dosis
75, 150 dan 300 mg/kg BB mampu
menurunkan kadar asam urat sekitar 35-45%
relatif terhadap kelompok kontrol sakit. 2
Caesalpinia sappan L. atau dikenal
dengan secang termasuk dalam famili
Leguminose yang merupakan salah satu
jenis tanaman yang banyak digunakan secara
tradisional sebagai bahan makanan dan
minuman serta dikenal luas memiliki
berbagai aktivitas biologi. Studi ilmiah
membuktikan bahwa Sappan wood memiliki
aktivitas dalam mengatasi tuberkulosis,
diare, disentri, infeksi kulit dan anemia. 3
Uncaria gambir (Hunter) Roxb, atau yang
dikenal dengan gambir, termasuk ke dalam
suku Rubiaceae yang merupakan tanaman
spesifik lokasi yang banyak ditemukan
khususnya di pulau Sumatera, Indonesia. 4
Gambir mengandung senyawa polifenol
khususnya flavonoid (+) katekin sekitar 40-
80% berat dalam sediaan ekstrak air kering.5
Berdasarkan ketentuan BPOM, dalam
pengembangan sediaan obat atau obat
tradisional, selain memiliki bukti khasiat,
dipersyaratkan juga pengujian toksisitas
pada hewan percobaan guna menjamin
keamanan saat penggunaan pada manusia,
baik pengujian secara akut maupun jangka
panjang (subkronis). Pengujian toksisitas
pada hewan berguna untuk melihat adanya
reaksi biokimia, fisiologik dan patologik
yang mungkin akan muncul sebelum
penggunaan pada manusia.6
Penelitian toksisitas terhadap ekstrak
secang dan gambir secara tunggal telah
dilakukan sebelumnya. Secang dalam bentuk
sediaan infus yang diberikan baik dosis
tunggal dan jangka panjang 30 hari tidak
menyebabkan mortalitas dan gangguan efek
toksik hewan coba.3 Nalla MK melaporkan
bahwa pemberian ekstrak kloroform secang
dosis tunggal hingga dosis 2000 mg/kg BB
tidak menyebabkan kematian dan reaksi
toksik yang nyata.7 Ekstrak etanol secang
termasuk dalam kategori aman pada uji
toksisitas akut.8 Ekstrak etanol secang juga
terbukti mampu melindungi hati akibat
senyawa radikal melalui aktivitas
antioksidan. 9
Uji kemanan ekstrak gambir juga secara
in vitro pada sel Vero10 sel intestinal IEC-6
dan uji mutagenik menunjukkan bahwa
ekstrak ini aman.11,12 Sementara itu, uji pada
hewan coba hingga dosis 4 g/kg BB tidak
menyebabkan lesi organ hati yang
bermakna.13
Pengujian keamanan dari kombinasi
kedua ekstrak tersebut belum pernah
dilakukan. Oleh karena itu, penelitian ini
dilakukan dengan tujuan melakukan
pembuktian keamanan jangka panjang
(subkronis) FH pada hewan coba secara in
vivo. Diharapkan hasil penelitian dapat
mengungkap tingkat keamaan dari FH dan
dijadikan dasar pada pengujian keamanan
berikutnya
METODE
Pelaksanaan penelitian telah mendapat
persetujuan Komisi Etik FKUI dengan
nomor 712/UN2.F1/ETIK/2015 tertanggal
25 Agustus 2015. Pengujian toksisitas
subkronis dilakukan mengacu pada
6
ketentuan BPOM.
Alat penelitian meliputi kandang
individual hewan tikus (Rital®), timbangan
hewan (Kern®), spektrofotometer UV-
Vis(Thermo®), mikrosentrifus (mikro22
Hettich zentrifuge®), dan mikropipet
(Ependrof), serta perlengkapan berupa
tabung plastik sekali pakai 1,5 mL (Axigen).
Bahan uji formula herbal (FH) berupa
kombinasi ekstrak gambir dan secang.
Hewan uji yang digunakan adalah tikus
putih galur SD jantan dan betina yang dibeli
dari BPOM. Usia hewan coba saat pengujian
6-8 minggu dengan berat badan 90-125 g.
Bahan kimia yang digunakan meliputi
Heparin (Inviclot®), CMC (foodgrade),
NaH2PO4.H2O (Merck), K2HPO4 (Merck),
formaldehid (Merck), reagen kit untuk
analisis biokimia darah ASAT, ALAT,
Gama-GT, Urea, Kreatinin, Bilirubin total
(Diasys®), dan vacutainer EDTA 3 mL
(Vaculab®). Analisis hematologi darah
dilakukan di Laboratorium Kesehatan
Daerah Tangerang Selatan. Analisis
histopatologi organ dilakukan
diLaboratorium Patologi Balai Besar
Penelitian Veteriner mengacu pada protokol
uji yang ada.
Perlakuan hewan coba
Pelaksanaan pengujian berpedoman pada
ketentuan BPOM.6 Hewan coba
diaklimatisasi pada kondisi percobaan
(siklus cahaya dibuat gelap dan terang 12
jam, suhu 23±3°C, kelembapan ruangan
50%-70%) selama sekitar 7 hari kemudian
dikelompokkan secara acak menjadi 4
kelompok terdiri dari 8 ekor jantan dan 8
ekor betina per kelompok, yaitu DOSIS-1
(75 mg/kg bb), DOSIS-2 (300 mg/kg bb),
DOSIS-3 (1200 mg/kg bb) dan kontrol tanpa
perlakuan. Hewan ditempatkan dalam
kandang individual yang terbuat dari
polikarbonat dengan jumlah tikus 4 ekor
setiap kandang yang dipisahkan antara tikus
betina dan tikus jantan. Tikus diberi pakan
standar dan minum dalam jumlah ad libitum.
FH disuspensikan dalam pembawa larutan
CMC 0,5% secara aseptik sesuai masing-
masing dosis dengan volume pemberian
sebesar 1 mL/100 g bb. FH diberikan
menggunakan sonde lambung setiap hari
pada jam 08.00-10.00 WIB, kecuali
kelompok kontrol diberi pembawa.
Penimbangan berat badan dilakukan
sekali seminggu selama pengujian. Jika
terdapat hewan coba yang mati, segera
dilakukan otopsi dan diamati adanya
kelainan organ secara makroskopis.
Penimbangan pakan dilakukan pada setiap
kandung setiap minggu sekali. Nilai rata-rata
konsumsi pakan per hewan coba disajikan
dengan membagi konsumsi pakan
perkandang dibagi dengan jumlah hewan
coba per kandang.
Setelah 7 minggu pemberian FH,
dilakukan analisis biokimia darah. Hewan
coba dipuasakan selama overnight 16-18 jam
tetapi tetap diberi air minum, kemudian
dilakukan pengambilan darah sekitar 1-1,5
mL melalui sinus orbitalis dan ditampung
dalam tabung ependrof yang diberi
heparin10 uL dan digoyang perlahan-lahan.
Plasma darah dipisahkan dengan sentrifugasi
pada kecepatan 10000 rpm suhu 4°C selama
5 menit. Plasma dipisahkan dan disimpan
dalam lemari pendingin pada suhu 4°C
untuk proses selanjutnya. Untuk analisis
kadar urea, tidak digunakan antikoagulan
heparin.14 Untuk analisis hematologi
lengkap, cara pengambilan darah sama
seperti di atas namun darah ditampung
dalam tabung Vaculab®.15 Selanjutnya,
seluruh hewan coba dikorbankan dengan
cara dislokasi leher. Organ-organ hewan
berupa hati, ginjal, usus halus, lambung dan
Jurnal Kefarmasian Indonesia.
2017;7(1):34-45
jantung diambil, dibersihkan darahnya
dengan menempelkan pada kertas tissue dan
difiksasi dalam larutan BNF 10% (buffer
neutral formalin). Penyiapan preaparat
histopatologi organ dilakukan menggunakan
metode standar.16
Analisis parameter uji
Analisis parameter uji yang dilakukan
sebagai berikut: analisis biokimia darah
untuk parameter hati (kadar ASAT dan
ALAT, gama GT, dan bilirubin total) dan
parameter kesehatan ginjal (kadar urea dan
kreatinin) menggunakan reagen diagnostik
Diasys® secara spektrofotometri dengan
mengikuti protokol uji yang tersedia;14
analisis hematologi darah (white blood cell
(WBC), red blood cell (RBC), hemoglobin
(Hb), hematokrit (Ht), mean corpuscular
hemoglobin concentration (MCHC),
platelets (PLT), the relative distribution
width of red blood cells by volume (RDW-
CV), ratio of large platelets (P-LCR),
neutrophil (Neut), dan limfosit (LYMPH))
dilakukan mengacu pada pedoman analisis
alat cell counter otomatis Sysmex XS-
800i®;15 analisis histopatologi dengan teknik
skoring oleh seorang patolog untuk
mengevaluasi tingkat kerusakan. Ketentuan
skoring adalah sebagai berikut: TKS: Tidak
ada kelainan spesifik. Skor 0: Tidak ada
sampel. Skor 1: Lesi ringan. Skor 2: Lesi
sedang. Skor 3: Lesi parah.16
Pengolahan data
Data disajikan dalam bentuk rata-rata ±
SD. Analisis statistik menggunakan metode
oneway ANOVA untuk data parameterik
atau Kruskal Wallis untuk data non
parameterik. Guna melihat perbedaan lebih
lanjut antara kelompok dilakukan uji dengan
metode least significancy difference (LSD)
untuk data parameterik atau Mann Whitney
untuk data non parameterik. Semua analisis
statistik dilakukan menggunakan program
SPSS 13 pada tingkat kepercayaan 95%
(p=0,05).16
HASIL DAN PEMBAHASAN
Pengujian keamanan subkronis terhadap
FH dilakukan guna mengetahui tingkat
keamanan FH jika digunakan pada waktu
lama dengan berpedoman pada ketentuan uji
non-klinik BPOM. Pengujian bertujuan
untuk memperoleh informasi adanya efek
toksik zat yang tidak terdeteksi pada uji
toksisitas akut, informasi kemungkinan
adanya efek toksik setelah pemaparan
sediaan uji secara berulang dalam jangka
waktu tertentu, serta informasi dosis yang
tidak menimbulkan efek.6
Pengujian dilakukan pada 3 tingkatan
dosis. Dosis paling rendah (DOSIS-1)
sebesar 75 mg/kg BB adalah dosis khasiat
FH dalam menurunkan asam urat.2 Dosis
tertinggi (DOSIS-3, 1200 mg/kg BB) adalah
4× dosis efektif. Pada dosis ini diharapkan
akan diperoleh informasi adanya organ
sasaran efek toksik tanpa menyebabkan
kematian hewan coba secara bermakna.6
Penetapan DOSIS-3 juga harus
memperhatikan kemudahan pada pemberian
FH kepada hewan coba sebab FH diberikan
dalam bentuk suspensi menggunakan sonde
lambung dengan volume maksimal
pemberian pada hewan adalah 10% BB
hewan.10 DOSIS-2 adalah dosis tengah
antara kedua dosis tersebut.
Hasil pengukuran biokimia darah
disajikan pada Tabel 1 (hewan jantan) dan
Tabel 2 (hewan betina). Data kesehatan
ginjal, yaitu kadar urea dan kreatinin,
menunjukkan bahwa nilai kedua parameter
tersebut tidak berbeda bermakna antara
kelompok perlakuan FH dibanding kontrol
(p>0,05), baik pada hewan jantan maupun
betina. Pemberian FH jangka panjang pada
ketiga dosis uji tidak menimbulkan
gangguan pada kadar kreatinin dan urea. Hal
yang sama juga diamati pada parameter
kesehatan hati yaitu kadar ASAT, ALAT,
gama-GT dan bilirubin total, yakni tidak
terdapat perbedaan yang bermakna antara
kelompok perlakuan pada ketiga dosis dan
 Tabel 1. Biokimia darah setiap kelompok hewan jantan dan betina

Parameter uji KONTROL DOSIS-1 DOSIS-2 DOSIS-3

Hewan jantan

ASAT (U/L) 86,34±19,90 78,67±9,40 74,09±18,90 85,69±12,20

ALAT (U/L) 44,61±10,68 45,30±11,07 41,08±10,39 41,99±9,48

Gama-GT (U/L) 4,40±1,51 3,81±2,66 3,31±1,59 3,98±2,43

Urea (mg/dL) 45,32±19,25 38,56±16,93 39,03±23,03 42,96±21,99

Kreatinin (mg/dL) 0,54±0,19 0,53±0,16 0,44±0,14 0,50±0,18

Bilirubin total
(mg/dL) 1,40±0,46 1,12±0,27 1,34±0,52 1,26±0,38

Hewan betina

ASAT (U/L) 72,89±15,00 79,54±12,70 76,71±11,4 87,21±27,60

ALAT (U/L) 37,04±6,24 39,04±8,00 36,94±6,37 36,65±7,73

Gama-GT (U/L) 4,36±0,88 4,68±1,31 4,01±0,87 4,51±1,47

Urea (mg/dL) 46,76±21,06 47,42±20,06 42,05±26,75 43,54±26,12

Kreatinin (mg/dL) 0,63±0,16 0,60±0,20 0,65±0,11 0,67±0,20

Bilirubin total
(mg/dL) 0,93±0,22 1,10±0,41 1,20±0,60 0,98±0,39

Nilai adalah rata-rata kadar ± SD. n=8 ekor per kelompok. Pengukuran biokimia darah
dilakukan terhadap plasma heparin kecuali kadar urea darah menggunakan serum,
menggunakan reagen kit Diasys® dilakukan secara spektrofotometri. DOSIS1, DOSIS2,
DOSIS3 mendapat FH 75, 300, 1200 mg/kg BB. KONTROL mendapat pembawa larutan
CMC 0,5%.

kontrol (p>0,05), baik pada hewan jantan
dan betina. Hal ini berarti bahwa pemberian
FH hingga 16 kali dosis efektif selama 7
minggu tidak menunjukkan adanya
gangguan organ ginjal dan hati.
Kreatinin adalah sejenis asam amino
yang merupakan produk buangan di dalam
darah dan diekskresikan melalui ginjal ke
dalam urin. Umumnya kreatinin disimpan
dalam otot sebagai cadangan energi dalam
bentuk kreatinin-fosfat sumber ATP. Tempat
lain yang memproduksi kreatinin di hati,
pankreas dan ginjal. Kadar kreatinin yang
tinggi diduga karena aktivitas otot yang
berat (olah raga keras) atau karena sistem
pembuangan ginjal yang terganggu. Kadar
kreatinin relatif stabil karena tidak
dipengaruhi oleh protein dari diet. 18
Urea merupakan hasil metabolisme
nitrogen atau katabolisme protein. Pada
proses katabolisme protein, gugus amino
dilepas dari asam amino dengan proses
deaminasi oksidatif, selanjutnya gugus
amino akan melalui serangkaian daur ulang,
dirombak atau dikeluarkan dari tubuh.
Enzim aminotransferase di beberapa
jaringan mengkatalisis pertukaran gugus
amino antar senyawa yang terlibat dalam
rangkaian reaksi sintesis. Gugus amino yang
dilepaskan akan dirombak menjadi amonia
dan diangkut ke hati untuk proses
pembentukan urea, yang selanjutnya akan
diangkut ke ginjal untuk diekresikan ke urin.
Sekitar 50% urea yang difiltrasi oleh
glomerulus akan direabsorbsi kembali di
tubulus. Sebaliknya, sel-sel tubulus tidak
permeabel terhadap kreatinin, insulin dan
manitol sehingga semua akan diekskresi
melalui urin. Sejumlah urea akan
dimetabolisme lebih lanjut sebagian kecil
diekskresikan melalui keringat dan feses.
Konsentrasi urea dalam darah dipengaruhi
oleh kesimbangan pembentukan urea dan
katabolisme protein serta kemampuan
ekskresi urea oleh ginjal. Peningkatan kadar
urea dapat disebabkan oleh karena terjadi
peningkatan katabolisme protein jaringan
yang disertai dengan keseimbangan nitrogen
yang negatif, proses pemecahan protein yang
berlebihan terjadi pada kasus leukmia
dimana terjadi pelepasan protein leukosit,
adanya gangguan ekresi urea, karena
gangguan prerenal, renal atau postrenal atau
dikarenakan konsumsi makanan tinggi
protein.19 Pemeriksaan kadar kreatinin dan
urea darah menjadi acuan untuk mengetahui
adanya gangguan fungsi ginjal. Gangguan
fungsi ginjal menyebabkan penurunan
kecepatan filtrasi ginjal, disertai dengan
penumpukan sisa metabolisme (ureum dan
kreatinin) dalam darah sehingga kadar kedua
zat ini dalam darah ini dapat digunakan
sebagai indikator derajat kesehatan ginjal.
Enzim ALAT dan ASAT berperan dalam
mengkatalis transfer gugus amin dari
glutamat untuk menghasilkan asam amino
alanin dan aspartat pada siklus asam sitrat.20
Kadar ASAT dan ALAT yang melebihi
kontrol menunjukkan adanya gangguan
terhadap keutuhan sel hepatosit. Jika ada
kerusakan hepatosit, ALAT dan ASAT akan
dikeluarkan ke dalam aliran darah sehingga
ditemukan kadar dalam darah tinggi. ALAT
dan ASAT juga diproduksi di jantung, otot,
ginjal, otak, sel darah merah dan otot dalam
kadar rendah. Sementara itu, peningkatan
kadar Gama-GT dan bilirubin menunjukkan
adanya gangguan fungsi hati terkait
kholestatis. Gama-GT berkaitan dengan
fungsi mengkatalisis perpindahan gugus
gama-glutamil dari suatu peptida ke asam
amino. Adanya peningkatan kadar dalam
darah menunjukkan adanya inflamasi awal
saluran empedu. Bilirubin berfungsi
mengkonjugasi senyawa glukoronat pada
produk hemolisis sehingga diperoleh
senyawa komplek yang larut air
memudahkan diekresikan melalui empedu.
Adanya peningkatan bilirubin menjadi
indikator kelainan fungsi hati.21
Hasil pengukuran hematologi lengkap
dengan 10 parameter disajikan pada Tabel 2.
Secara statistik, pada hewan jantan, semua
parameter hematologi tidak berbeda
bermakna antara ketiga kelompok perlakuan
FH dibanding kontrol (p>0,05). Sementara
itu, pada hewan betina juga menunjukkan
hasil yang sama kecuali pada kelompok
DOSIS-2 dimana kadar neutrophil (NEUT)
menunjukkan ada perbedaan bermakna
dibanding kontrol (p<0,05). Kadar
neutrophil pada DOSIS-2 lebih rendah
dibandingkan kelompok kontrol (0,7×103/Ul
terhadap 1,5×103/uL). Kondisi ini
menunjukkan bahwa hewan betina lebih
rentan dibanding hewan jantan. Penelitian
sebelumnya membuktikan bahwa pengujian
toksisitas umumnya menunjukkan bahwa
hewan betina lebih sensitif dibandingkan
hewan jantan.22 Sistem hematopoesis
merupakan salah satu sistem yang sangat
sensitif terhadap senyawa toksik.23 Pada
dosis yang lebih tinggi (DOSIS-3) tidak
ditemukan kondisi yang sama. Tidak
ditemukan adanya keteraturan antara
peningkatan dosis akan menghasilkan
peningkatan efek toksik. Kemungkinan
penyebab hal ini hanya efek beberapa ekor
saja yang menyimpang diantara hewan yang
ada dalam satu kelompok. Hasil ini
menyerupai dengan penelitian yang
24
dilakukan oleh Bo Li B, et al. yang
mempelajari efek toksik jangka panjang
pemberian ekstrak bunga teh. Bo Li B
menemukan bahwa beberapa parameter
hematologi darah tidak memiliki pola yang
konsisten antara peningkatan dosis dengan
perubahan parameter hematologi dan
terhadap waktu pengukuran. Pola yang tidak
tetap ini diduga disebabkan adanya variasi
dari sedikit hewan coba dalam satu
kelompok dan tidak dapat dikatakan bahwa
sampel uji memberikan efek toksik terhadap
parameter dimaksud.
Hasil skoring derajat kerusakan organ hati,
ginjal, lambung, usus halus dan jantung
(Tabel 3) menunjukkan bahwa pada kontrol
jantan dan betina ditemukan adanya kelainan
atau lesi dengan derajat ringan pada organ
hati dan ginjal. Hal ini menunjukkan bahwa
hewan yang digunakan tidak termasuk jenis
specific pathogen free (SPF), sehingga
kemungkinan adanya lesi sudah merupakan
bawaan hewan tersebut. Analisis histologi
pada kelompok yang diberi dosis 1, hewan
jantan dan betina, ditemukan adanya
perubahan histologi/lesi khususnya pada
organ hati, ginjal, jantung dan usus halus,
namun kelainan tersebut secara statistic tidak
berbeda bermakna dibandingkan dengan
kontrol (p>0,05).

Tabel 2. Hematologi lengkap pada hewan jantan dan betina

KONTRO
Parameter uji L DOSIS-1 DOSIS-2 DOSIS-3

Hewan jantan

WBC x103/uL 14,8±2,5 14,2±1,7 13,9±3,7 14,2±2,2

RBC x106/uL 8,1±0,5 7,8±0,4 8,1±0,2 8,0±0,5

Hb g/dL 14,9±0,7 14,5±0,7 14,9±0,4 14,5±0,6

Ht % 43,4±1,6 42,4±1,7 43,6±0,9 42,3±1,6

MCHC g/dL 34,4±0,4 34,1±0,4 34,3±0,4 34,3±0,4

PLT x103/uL 479,0±92,4 475,0±175,2 547,0±61,9 489,0±112,3

RDW-CV % 18,9±3,0 17±0,8 17,7±0,4 17,9±1,1

P-LCR % 12,9±1,7 10,6±1,1 12,1±1,7 10,9±1,5

NEUT x103/uL 2,0±0,8 1,7±1,0 1,5±0,6 2,3±0,6

LYMPH x103/uL 10,1±4,1 8,7±5,1 8,4±3,1 10,4±2,1

Hewan betina

WBC x103/uL 12,3±1,6 11,8±1,6 13,1±2,8 12,7±3,4

RBC x106/uL 7,3±0,5 7,5±0,2 7,7±0,4 7,5±0,2

Hb g/dL 14,3±0,9 14,2±0,3 14,4±0,7 14,0±0,5

Ht % 41,0±2,4 40,8±0,6 41,5±2,0 40,4±1,1

MCHC g/dL 34,8±0,4 32,0±6,5 34,7±0,4 34,6±0,5

PLT x103/uL 401,7±157,4 348,5±136,8 588,4±213,3 325,8±149,1

RDW-CV % 14,5±1,1 14,5±0,6 14,9±0,6 15,3±1,2

P-LCR % 13,3±2,1 11,4±2,4 11,0±1,1 9,8±3,5

 NEUT x103/uL 1,5±0,3 1,3±0,2 0,7±0,2* 2,0±0,7

LYMPH x103/uL 9,9±1,3 9,8±1,6 5,6±0,6 9,8±2,8

*Berbeda bermakna dibanding kelompok kontrol (p<0,05). n=8 ekor per kelompok.
Pengukuran hematologi lengkap dilakukan terhadap darah-EDTA menggunakan alat otomatis
Sysmex XS800i®. DOSIS1, DOSIS2, DOSIS3 mendapat FH 75, 300, 1200 mg/kg BB.
KONTROL mendapat pembawa larutan CMC 0,5%.

Tabel 3. Hasil skoring derajat kerusakan organ

Kelompok Jantung Lambung Usus Hati Ginjal

halus

Hewan
jantan

KONTROL 0,0 0,0 0,5 0,8 1,0

DOSIS-1 0,1 0,0 0,3 1,0 1,0

DOSIS-2 0,3 0,0 0,9 1,9* 1,4

DOSIS-3 0,3 0,0 1,4* 2,6* 1,8*

Hewan
betina

KONTROL 0,0 0,0 0,0 1,0 1,0

DOSIS-1 0,4 0,0 0,1 1,3 1,3

DOSIS-2 0,3 0,0 0,3 1,6* 1,4*

DOSIS-3 0,2 0,0 0,1 2,1* 2,0*

*Secara statistik berbeda secara bermakna dibanding control (p<0,05). ). Nilai = rata-rata
skoring. n=8 ekor per kelompok. Analisis histopatologi dengan teknik skoring oleh seorang
patolog untuk mengevaluasi tingkat kerusakan. Ketentuan skoring: TKS: Tidak ada kelainan
spesifik. Skor 0: Tidak ada sampel. Skor 1: Lesi ringan. Skor 2: Lesi sedang. Skor 3: Lesi
parah. DOSIS1, DOSIS2, DOSIS3 mendapat FH 75, 300, 1200 mg/kg BB. KONTROL
mendapat pembawa larutan CMC 0,5%.
Pada gambar 1 dapat dilihat lesi pada organ
hati dan ginjal hanya berupa lesi ringan.
Kelompok DOSIS-1 tidak ditemukan lesi
pada organ lambung.
Efek kerusakan organ akibat perlakuan
FH DOSIS-2 terhadap kelima jenis organ
pada hewan betina lebih parah dibanding
jantan. Pada hewan jantan kerusakan yang
bermakna ditemukan hanya pada organ hati
(vs kontrol, p<0,05). Sementara pada hewan
betina ditemukan pada dua organ yaitu organ
hati dan ginjal (vs kontrol, p<0,05). Organ
yang lain tidak terjadi kerusakan yang
bermakna.
Selanjutnya, perlakuan FH DOSIS-3
pada hewan jantan ditemukan lesi yang
bermakna pada organ hati, ginjal dan usus
(vs kontrol, p<0,05). Sementara, pada hewan
betina ditemukan pada organ hati dan ginjal
vs kontrol, p<0,05). Kondisi ini
menunjukkan bahwa peningkatan dosis FH
akan menambah keparahan lesi beberapa
organ hal ini disebabkan semakin besar
jumlah FH yang masuk ke dalam tubuh. FH
merupakan ekstrak tanaman yang
mengandung berbagai macam senyawa
kimia seperti katekin, polifenol, dan
flavonoid.25 Sampai pada takaran tertentu
tubuh masih bisa mengantisipasi bahan asing
yang masuk ke dalam tubuh, namun pada
jumlah yang berlebih maka akan
berpengaruh terhadap beberapa organ,
khususnya yang terlibat langsung pada
proses detoksifikasi dan ekskresi.
Hasil pengamatan penimbangan berat
badan selama pelaksanaan pengujian untuk
hewan jantan (Gambar 2) dan betina
(Gambar 3) menunjukkan bahwa pemberian
FH pada ketiga dosis uji tidak menyebabkan
penurunan BB secara berarti, baik pada
hewan jantan maupun hewan betina. BB
hewan jantan dan betina selama pengujian
cenderung meningkat. Terlihat bahwa berat
badan rata-rata setiap minggu dari setiap
kelompok berfluktuasi, namun secara umum
terdapat kecenderungan peningkatan.
Data konsumsi pakan mendukung hasil
pengukuran berat badan, yaitu tidak terdapat
perbedaan secara signifikan (p>0,05) antara
kontrol dengan kelompok yang mendapat
FH pada ketiga dosis uji pada kedua jenis
kelamin (Tabel 4). Konsumsi pakan akan

Gambar 1. Gambaran kerusakan/lesi histopatologi organ hati dan ginjal hewan

dengan perlakuan FH Dosis 1.

Keterangan: Pewarnaan dilakukan menggunakan Hematoksilin dan Eosin. A.

Histopatologi organ hati, terjadi dilatasi sinusoid hati (tanda panah). B. Histopatologi
organ ginjal, terjadi degenerasi sel tubulus ginjal (tanda panah).
 Gambar 2. Rata-rata berat badan hewan jantan selama pengujian

Keterangan: Penimbangan berat badan dilakukan setiap minggu. n=8 ekor. Data = rata-rata±SD.
DOSIS1, DOSIS2, DOSIS3 mendapat FH 75, 300, 1200 mg/kg BB. KONTROL mendapat
pembawa larutan CMC 0,5%.

Gambar 3. Rata-rata berat badan hewan betina selama pengujian

Keterangan: Berat badan hewan ditimbang setiap minggu. n=8 ekor. Data = rata-rata berat badan
± SD. DOSIS1, DOSIS2, DOSIS3 mendapat FH 75, 300, 1200 mg/kg BB. KONTROL mendapat
pembawa larutan CMC 0,5%.

berefek secara langsung pada berat badan
hewan coba. Pada studi toksisitas, hewan
coba yang mendapat dosis tinggi umumnya
akan kehilangan berat badan yang
disebabkan penurunan nafsu makan.
µM pada sel RAW264.7 pada inkubasi
selama 18 jam. Demikian juga inkubasi
brazilin selama 24 jam hingga konsentrasi
100 µM tidak mengubah viabilitas sel
fibroblast dermal.3

Perubahan berat badan secara nyata
merupakan indikator yang paling mudah
terlihat dan menjadi indikator awal adanya
efek toksik dari sampel uji yang diberikan. 19
Ekstrak secang sudah dikenal sejak lama dan
digunakan dalam bidang pangan sebagai
pewarna dan juga sebagai obat. Peneliti
sebelumnya telah membuktikan bahwa
secang terbukti aman pada pengujian
keamanan secara in vitro dan in vivo.
Senyawa utama secang, brazilin, dan fraksi
kaya brazilin sampai dengan konsentrasi 500
µg/mL tidak menunjukkan efek toksik pada
sel fibroblat yang diinkubasi selama 24 jam.
Brazilin juga tidak menyebabkan
sitotoksisitas pada konsentrasi di bawah 300
Pengujian keamanan pada hewan coba
menunjukkan bahwa pemberian ekstrak air
per oral tidak menunjukkan adanya gejala
gangguan efek klinik, mortalitas dan
perubahan berat organ. Selanjutnya,
pemberian ekstrak etanol secang pada dosis
250, 500, dan 1000 mg/kg bb per oral
selama 30 hari menunjukkan bahwa tidak
ditemukan adanya abnormalitas berat organ
dan berat badan, hematologi, biokimia dan
histologi organ jika dibandingkan dengan
kontrol, baik pada hewan jantan maupun
betina.3
Secang juga memiliki perlindungan
terhadap kerusakan hati melalui mekanisme
antioksidan. Pemberian ekstrak etanol
secang pada dosis 500 mg/kg BB mampu
meningkatkan enzim-enzim antioksidan
tikus yang dipapar dengan parasetamol
seperti superoksida dismutase (SOD) dan
katalase (CAT) serta kelompok glutation
seperti glutathione peroxidase (GPX),
glutathione-s-transferase (GST) dan reduced
glutathione (GSH). Selain itu, secang juga
mampu memperbaiki makroinflamasi yang
setara dengan silimarin 25 mg/kg BB akibat
induksi parasetamol.9
Keamanan ekstrak gambir telah diteliti
dalam beberapa penelitian sebelumnya.
Hasil analisis sitotoksisitas in vitro ekstrak
etanol gambir terhadap sel Vero
menunjukkan nilai IC50 antara 400-500
ppm.10 Graidist P et al menyatakan bahwa
sampel ekstrak bahan alam yang mempunyai
nilai IC50 lebih besar dari 80 ppm pada uji
sitotoksisitas terhadap sel kontrol in vitro
termasuk dalam kategori kurang toksik. 26 Uji
sitoksisitas terhadap ekstrak air gambir
terhadap sel epitel intestinal lestari IEC-6
menunjukkan bahwa sampai konsentrasi 200
ppm, tingkat kehidupan sel masih bertahan
hingga 93%.11
Selain aman, baik ekstrak dan senyawa
kimia gambir mempunyai aktivitas biologi
melindungi kerusakan tubuh dari serangan
radikal bebas. Senyawa kimia utama gambir,
yakni flavonoid (+) katekin memiliki
aktivitas antioksidan yang tidak berbeda jauh
dengan vitamin C. Pada pengujian dengan
metode ABTS (2,2'-azinobis-(3-
ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid) dan
NBT (Nitroblue tetrazolium), (+)katekin
meredam radikal bebas dengan nilai IC50
pada konsentrasi 40,47 ppm dan 9,36 ppm
pada setiap metode, sementara itu senyawa
standar vitamin C menunjukkan nilai IC50
masing-masing 11,4 ppm dan 9,04 ppm.27
Yunarto et al menguji aktivitas antioksidan
ekstrak terpurifikasi gambir dan
menghasilkan bahwa aktivitas anti-
oksidannya lebih baik dari vitamin C.28
Ekstrak air gambir juga mampu menekan
peningkatan kadar MDA hati dan serum
akibat induksi CCl4, namun tidak bermakna
dibanding kelompok kontrol.29
Sampel uji merupakan kombinasi dari
ekstrak bahan alam sehingga terdapat
kemungkinan terjadi interaksi antar
komponen, terutama interaksi yang bersifat
antagonis pada dosis yang lebih tinggi.
Ketepatan dosis adalah salah satu faktor
penting dalam menentukan sukses tidaknya
terapi dengan obat tradisional.30 Selain itu,
efek kontra indikasi antara beberapa
senyawa aktif pada obat tradisional juga
dapat terjadi, misalnya efek antioksidan akan
berkurang jika dosis gambir terlalu tinggi. 31
Hasil penelitian ini sejalan dengan hasil
studi yang dilakukan oleh Hilpiani yang
melakukan uji toksisitas akut terhadap
ekstrak etil asetat gambir. Ditemukan adanya
lesi pada organ hati berupa sel radang akut
pada dosis pemberian 8000 mg/kg BB,
sedangkan pada dosis 1000, 2000 dan 4000
mg/kg BB tidak terdapat lesi yang
bermakna.12
KESIMPULAN
Pemberian FH pada dosis 75 mg/kg bb
selama 7 minggu pada tikus jantan dan
betina galur Sprague Dawley terbukti aman
tidak memengaruhi kadar kimia darah (urea,
kreatinin, bilirubin total, ASAT, ALAT dan
gama-GT) dan hematologi darah (WBC,
RBC, HGB, HCT, MCHC, PLT, RDW-CV,
P-LCR, PCT, NEUT, LYMPH), tidak
menyebabkan kerusakan/lesi organ jantung,
lambung, usus, hati dan ginjal, serta tidak
menyebabkan penurunan berat badan hewan
dan komsumsi pakan yang bermakna
dibanding kontrol.
UCAPAN TERIMA KASIH
Ucapan terima kasih disampaikan kepada
Kemenristekdikti atas bantuan pendanaan
penelitian ini melalui kegiatan Kegiatan
INSINas 2015 dan kepada Pusat Teknologi
Farmasi dan Medika (Pusat TFM), Badan
Pengkajian dan Penerapan Teknologi yang
telah menyediakan sarana dan prasarana
untuk pelaksanaan penelitian. Demikian
juga, terima kasih disampaikan kepada
asisten laboratorium farmakologi Pusat TFM
yaitu Julham Effendi dan Dea Kurniadi yang
telah membantu dalam pemeliharaan hewan
percobaan.
DAFTAR RUJUKAN
1. Zhao X, Zhu JX, Mo SF, Pan Y, Kong
LD. Effects of cassia oil on serum and
hepatic uric acid levels in oxonate-
induced mice and xanthine
dehydrogenase and xanthine oxidase
activities in mouse liver. Journal of
Ethnopharmacology. 2006 Feb
20;103(3): 357–65.
2. Ningsih S, Rismana E, Srijanto B,
Supriyono A, Nizar, Fahrudin F, et al.
Pengembangan obat herbal terstandar
berbasis gambir sebagai penurun asam
urat. Disampaikan pada Seminar Ilmiah
Insentif Riset SINas, Kementerian Riset
dan Teknologi: Membangun Sinergi
Riset Nasional untuk Kemandirian
Teknologi; 1-2 Oktober 2014; Bandung,
Indonesia.
3. Nirmal NP, Rajput MS, Prasad RGSV,
Ahmad M. Brazilin from Caesalpinia
sappan heartwood and its
pharmacological activities: A Review.
Asian Pacific Journal of Tropical
Medicine. 2015 Jun;8(6):421–30.
4. Hussin MH, Kassim MJ. The corrosion
inhibition and adsorption behavior of
Uncaria gambir extract on mild steel in
1 M HCl. Material Chemistry and
Physics. 2011 Feb;125(3):461-8.
5. Widiyarti G, Sundowo A, Hanafi M. The
free radical scavenging and anti-
hyperglycemic activities of various
gambiers available in Indonesian market.
Makara Sains. 2011 Nov;15(2):129-34.
6. Republik Indonesia. Peraturan Kepala
Badan Pengawas Obat dan Makanan
Republik Indonesia Nomor 7 tahun 2014
tentang Pedoman uji toksisitas nonklinik
secara in vivo. Berita Negara Republik
Indonesia Tahun 2014 Nomor 875.
Jakarta: Menteri Hukum dan Hak Asasi
Manusia; 2014.
7. Nalla MK, Elsani MM, Chinnala KM.
Effect of Caesalpinia sappan Linn
chloroform extract on alloxan induced
diabetes mellitus in rats. World Journal
of Pharmacy And Pharmaceutical
Sciences. 2015;4(6):1480-9.
8. Hasti S, Muchtar H, Bakhtia A. Uji
aktivitas hepatoproteksi dan toksisitas
akut dari ekstrak gambir terstandarisasi.
Jurnal Penelitian Farmasi Indonesia.
September 2012;1(1):34-8.
9. Sarumathy K, Vijay T, Palani S,
Sakthivel K, Rajan MSD. Antioxidant
and hepatoprotective effects of
Caesalpinia sappan against
acetaminophen induced hepatotoxicity in
rats. International Journal of
Pharmacology and Therapeutics.
2011;1:19-31.
10. Ningsih S. Efek hepatoprotektor gambir
(Uncaria gambir (Hunter) Roxb.) dalam
menghambat pembentukan kolagen
 dengan menekan TIMP-1 (tissue
inhibitor of metalloproteinase-1) in vivo
[disertasi]. Jakarta: Universitas
Indonesia; 2015.
11. Anggraini T, Tai A, Yoshino T, Itani T.
Antioxidative activity and catechin
content of four kinds of Uncaria gambir
extracts from West Sumatra Indonesia.
African Journal of Biochemistry
Research. 2011;5(1):33-38.
12. Hilpiani D. Uji toksisitas akut isolat
katekin gambir (Uncaria gambir Roxb)
dari fase etil asetat terhadap mencit putih
jantan secara in vivo [skripsi]. Jakarta:
Universitas Islam
13. Sulistyaningrum N, Rustanti L,
Alegantina S. Uji mutagenik ames untuk
melengkapi data keamanan ekstrak
gambir (Uncaria gambir Roxb.). Jurnal
Kefarmasian Indonesia. 2012 Feb
28;3(1):36-45.
14. Diasys Diagnostic Systems [Internet].
Date unknown [cited 2017 Feb 21].
Available from: http://www.diasys-
diagnostics.com/
fileadmin/promotoolbox/DiaSys_catalog
ues/
DiaSys_Katalog_RZ_170121.pdf?_=148
577 9300
15. Automated Hematology Analyzer XS
Series XS-1000i/XS-800i Instruction for
use. Kobe: Sysmex Corporation; 2006.
16. Say CE, editor. Histophatology: Methods
and Protocols. Methods in Molecular
Biology. Vol. 1180. New York: Spinger
Science-Business Media; 2014.
17. Dahlan MS. Statistik untuk Kedokteran
dan Kesehatan: Deskriptif, bivariat dan
multivariat dilengkapi dengan aplikasi
dengan menggunakan SPSS. Edisi 5.
Jakarta: Penerbit Salemba Medika; 2009.
18. Adebayo AH, Zeng GZ, Zhang YM, Ji
CJ, Akindahunsi AA, Tan NH.
Toxicological evaluation of precocene II
isolated from Ageratum conyzoides L.
(Asteraceae) in Sprague Dawley rats.
African Journal of Biotechnology.
2010;9(20):2938-44.
19. Sireeratawong S, Piyabhan P, Singhalak
T, Wongkrajang Y, Temsiririrkkul R,
Punsrirat J, et al. Toxicity evaluation of
sappan wood extract in rats. J Med
Assoc Thail. 2010;93(7):S50-S57.
20. Thapa BR, Walia A. Liver Function
Tests and their Interpretation. Indian
Journal of Pediatrics. 2007 July;74:663-
71.
21. BPAC (Best Practice Advocacy Centre).
Liver function testing in primary care
[Internet]. 2007 [cited 2013 Feb 27]
Available from:.
http://www.bpac.org.nz/
resources/campaign/lft/bpac_lfts_poem_
wv. pdf.
22. Mir AH, Sexena M, Malla MY. An acute
oral toxicity study of methanolic extract
from Tridex procumbens in Sprague
Dawley’s rats as per OECD guidelines
423. Asian Journal of Plant Science and
Research. 2013;3(1):16-20.
23. Adeneye AA, Ajagbonna OP, Adeleke
TI,Bello SO. Preliminary toxicity and
phytochemical studies of the stem bark
aqueous extract of Musanga cecropioides
in rats. Journal of Ethnopharmacology
2006;105, 374–379.
24. Bo Li B, Jin Y, Xu Y, Wu Y, Xu J, Tu Karanganyar: Balai Besar Penelitian dan
Y. Safety evaluation of tea (Camellia Pengembangan Tanaman Obat dan Obat
sinensis (L.) O. Kuntze) flower extract: Tradisional, Badan Penelitian
Assessment of mutagenicity, and acute Pengembangan Kesehatan, Departemen
and subchronic toxicity in rats. Journal Kesehatan RI; 2008
of Ethnopharmacology. 2011;133:583–
90.
31. Frinanda D, Efrizal, Resti R. Efektivitas
gambir (Uncaria gambir Roxb) sebagai
25. Ningsih S, Wibowo AE, Indriyani HN, antihiperkolesterolemia dan stabilisator
Efendi J, Mufidah R. Pengembangan nilai darah pada mencit putih (mus
sediaan farmasi penurun asam urat musculus) jantan. Jurnal Biologi
berbasis gambir (Uncaria gambir Universitas Andalas. 2014
(HUNTER) ROXB). Laporam akhir September;3(3):231-237.
Program Insentif Riset Sistim Inovasi
Nasional (InSinas) 2016. Jakarta:
Direktorat Jenderal Penguatan Riset dan
Pengembangan. Kementerian Riset,
Teknologi, dan Pendidikan Tinggi; 2016.

26. Graidist P, Martla M, Sukpondma Y.

Cytotoxic activity of Piper cubeba
extract in breast cancer cell lines.
Nutrients. 2015;7:2707-18.

27. Raj PV. Exploration of hepatoprotective

mechanisms of actions of some known
hepatoprotective agents through bax
pathway [PhD dissertation]. Manipal:
Manipal University; 2010.

28. Yunarto N, Aini N. Effect of purified

gambir leaves extract to prevent
atherosclerosis in rats. Health Science
Journal of Indonesia. 2015;6(2
Des):105-10.

29. Edward Z. The function utilization of

gambier (Uncaria gambir) as the
hepatoprotector. Riset Kimia. 2009;2(2).

30. Katno. Tingkat manfaat keamanan dan

efektifitas tanaman obat dan obat
tradisional. Prapti IY, Rahmawati N,
Mujahid R, Widyastuti Y, editor.
 www.trjfas.org

ISSN 1303-2712

Turkish Journal of Fisheries and Aquatic Sciences 15: 619-624 (2015) DOI: 10.4194/1303-
2712-v15_3_05

Daphnia magna as a Test Species for Toxicity Evaluation of Municipal

Wastewater Treatment Plant Effluents on Freshwater Cladoceran in Turkey

Fatma Koçbaş1,*, Rahime Oral2

Celal Bayar University, Faculty of Arts and Sciences, Department of Biology, Muradiye
Kampüsü 45140 - Yunusemre - Manisa, Turkey. Ege University, Faculty of Fisheries,
Department of Hydrobiology, 35100 Izmir, Turkey

* Corresponding Author: Tel.: +90.236 2013279 ; Fax: +90.236 2013040; Received 31

March 2015

E-mail: fatma.kocbas@cbu.edu.tr Accepted 10

August 2015

Abstract

Aquatic toxicity of municipal wastewater was evaluated in an acute toxicity test using
water flea, Daphnia magna as an freshwater aquatic experimental animal model. Toxicity test
were performed on samples of both untreated (raw) and treated wastewaters were collected
Manisa municipal effluents. Undiluted untread and treated effluents were very toxic to D.
magnaand cause to death of all exposed daphnids. Dilution of wastewaters was observed to
decrease percentage of influence of biological toxicity based on dilutional rate. Acute toxic
effect of untreated wastewater on D. magna was more than that of treated wastewater. In
addition, the longer the period of exposure to D. magna, the more significantly toxic effect
increased.

Keywords: Water flea, acute toxicity, municipal wastewater.

Türkiye Tatlısu Kladoseranları Üzerine Belediye Atıksu Arıtma Tesisisi
Atıklarının Toksisite Değerlendirmesinde Bir Test Türü Olarak Daphnia
magna

Özet

Evsel atıksuların sucul toksisitesi, bir tatlısu sucul deneysel hayvan modeli olan su piresi
Daphnia magna akut toksisite kullanılarak değerlendirildi. Toksisite testleri hem arıtılmamış
(ham) ve hem de arıtılmış Manisa evsel atıksuları ile gerçekleştirildi. Hiç seyretilmeyen
arıtılmamış ve arıtılmış atıksular D. magna üzerine çok toksik olduğu ve maruz kalan tüm
dafnidlerin ölümüne neden oldu. Atıksularda seyrelme yapıldığında seyrelme oranına bağlı
olarak biyolojik toksik etkinin azaldığı görüldü. Yine arıtılmamış atıksuların D. magna üzerine
akut toksik etkisi arıtılmış atıksulardan daha fazla bulundu. İlave olarak D. magna’ nın
atıksulara maruz kalma süresi arttıkça toksik atkinin de belirgin bir şekilde artığı bulundu.

Anahtar Kelimeler: Su piresi, akut toksisite, evsel atıksu.

Introduction hundred different identified chemicals

Urban activities are a major source of
pollution in aquatic ecosystems. Many
freshwater ecosystems are increasingly
degraded due to the input of wastewater-
borne pollutants (Fent, 1996; Wang et al.,
2003; Nakada et al., 2006; Lindqvist et al.,
2005). Excessive discharge of some
constituents, such as suspended solid,
nutrients, microorganisms and toxic
compounds from municipal wastewater into
aquatic ecosystems cause water quality is not
suitable for survival or growth of aquatic
organisms. Municipal wastewater contains a
broad spectrum of contaminants (Rowsell et
al., 2010). They can contain: 1) suspended
solids; 2) disease-causing pathogens (e.g.,
bacteria and viruses); 3) decaying organic
wastes; 4) nutrients; and 5) about two
(Environment Canada, 2001).
Most wastewater treatment plants not
treat all types of contaminants and a high
part of emerging compounds especially
organic chemicals and their metabolites may
escape elimination in treatment plants and
enter the aquatic environments. A number of
studies have demonstrated the occurrence of
organic contaminants in municipal
wastewater treatment plant effluents. These
studies mostly concered with occurance of
pharmaceuticals, personal care products,
diagnostic imaging contrast agents, estrogens
and pesticides in wastewaters (Paxéus, 1996;
Ternes, 1998; Daughton and Ternes, 2000;
Ternes et al., 1999; Boyd et al., 2003;
Lindstrom et al., 2002; Lishman et al., 2006;
Odjadjare and Okoh, 2010; Rowsell et al.,
2010, Zein et al.,2015).

Hazard assessment of municipal (COD) and pH. Bioassays for evaluating

wastewater in Turkey is based on treated municipal wastewaters are not used.
physicochemical parameters e.g. total However, the complexity of wastewaters
suspended solids (TSS), biological oxygen limits analyses of all chemicals and these
demand (BOD), chemical oxygen demand give rise to the suspicion of the safety of
wastewater treatment plants effluents. At the
same time volume of effluents is too much.
For this reason, toxicity tests have been
carried out to assess the potential effects of
wastewater discharges on aquatic life. One
of the most internationally used bioassays for
monitoring of effluents is the acute toxicity
test with daphnid cladocerans and in
particular that performed with Daphnia
magna. Standard methods have been
developed for this assay that were gradually
endorsed by national and international
organisations dealing with toxicity testing
procedures, in view of its application within
a regulatory framework (Persoone et al.,
2009).
A number of species of Daphnidae
family are used for toxicity test very
common. Besides they are well
recommended for testing (USEPA, 2002),
the organisms are generally available
throughout the year and easily cultured in the
laboratory. In addition to this, daphnids are
sensitive to a variety of pollutants and have
been widely used as the biotests organisms
for evaluating different toxic substances
(ISO, 1996; Sarma and Nandini, 2006;
Sánchez- Meza et al., 2007; Oral et al.,
2007; Tatarazako and Oda, 2007).
In this study, a common species such as
the freshwater flea D. magna (Cladocera,
Crustacea) was used to assess the acute
toxicity of untreated and treated wastewaters
from the municipal wastewater treatment
plant in Manisa, Turkey. The objective of
this study was to investigate the safety for
discharging municipal wastewaters effluents
into fresh water organisms to protect aquatic
biota and achieve water quality standards.
Materials and Methods
Manisa Municipal Wastewater
Treatment Plant (MMWTP) provided
treatment to wastewater from approximately
332.346 residents and discharges to Gediz
River. In 2007, the average daily flow of
MMWTP was 7000 m3/day. Samples of raw
influent and mechanically and biologically
treated effluent from MMWTP were
collected in June 2007. The samples were
transferred to the laboratory in cooled box
and stored in darkness in refrigerator (+4oC)
prior to chemical analyses and performance
of bioassays. The bioassays were performed
within a week.
All chemical analysis of MMWTP
influents and efluents were performed in
accordance with Standard Methods (APHA,
1998). In this research, D. magna were
cultured and handled according to the
procedures outlined in the U.S.
Environmental Protection Agency (USEPA)
manual (USEPA, 2002). The acute and
whole effluent toxicity tests performed
followed the U.S.EPA guideline (USEPA,
2002). Four replicates of five neonates (less
than 24 h old) were used for each treatment
and control without feeding. The test
concentrations ranging from 0.1% to 100%
were set by dilution of untreated (raw) and
treated wastewater effluents. In each
treatment schedule 20 daphnids were scored
for their frequencies of immobilized
daphnids.
TU =
100/LC50 (1)
The toxicity data were classified
according to the hazard classification system
for wastewaters discharged into the aquatic
environment as shown in Table 1 (Persoone
et al., 2003). The LC50 values were
determined at 24, 48, 72 and 96 hours by
probit analysis. The calculations were done
using Probit Programme Version 1.5, which
is available in USEPA (USEPA, 2002).
Following to this, toxicity values (LC50) were
transformed into Toxic Units (TU) according
to the equation 1.
Results Wastewater Characterization
A large amount of municipal
wastewaters are discharged directly or
indirectly into the water bodies in Turkey.
63.3% and 36.4% of wastewaters are
discharged into the recipient environment
treated and untreated, respectively. Almost
half of municipal wastewaters (49.6%) is
dumped into freshwaters such as rivers, lakes,
Table 1. Hazard classification system for waste waters discharged into the aquatic
environment (Persoone et al., 2003)
TU Class
< 0.4 Class I
< 0.4 < TU < 1 Class II
1 < TU < 10 Class III
10 < TU < 100 Class IV
TU > 100 Class V
is of increasing importance.
In order to characterize the water quality
parameters of MMWTP influents and
efluents, such as pH, COD, BOD5 and TSS
were measured. Results of chemical analyses
of wastewaters are presented in Table 2. One
of the important parameters in municipal
wastewater is pH, whose measurements
show that there were no significant
differences between treated and untreated
wastewaters in pH value with optimum
intervals. According to results of COD and
BOD examination, their values in
wastewaters of MMWTP decrease after
treatment, which proves that the system
reservoirs and dams (TurkStat, 2013), with
great amount various contaminants in
municipal wastewaters becoming a major
threat to freshwater organisms in particular.
Water fleas, as D. magna, are small inverte
brate crustaceans and a key source of food
for many fish in fresh water ecosystems.
41.24% of all known species of fish are
found in fresh water (Marzan et al., 2014),
which indicates that the subject
Toxicity Symbol
No acute toxicity
Slight acute toxicity
Acute toxicity
High acute toxicity
Very high acute toxicity
works well. Following the treatment
process, both COD and BOD values were
found to be within the discharge limits in
Turkey (Turkish Official Newspaper, 2004).
Measurement of TSS values indicated that
they were within the standard limits of
wastewater discharge in Turkey both in
treated and untreated wastewaters with a
significant reduction in TSS value only after
the process. On the other hand, chemical
characteristics of MMWTP waste effluents
tested in the study are consistent with the
regulation of effluent discharging criteria of
European Union (EU) (1991 ) (Table 2).
Values of treated MMWTP effluents were in
agreement with EU discharge limits.
 The mean untreated wastewawater
COD, BOD5 and TSS were found to be
288.0 mgO2/L, 96.0 mgO2/L and 57.3 mg/L
respectively. After treatment all were
observed as 44.2 mgO2/L, 16.0 mgO2/L and
26.5 mg/L respectively. The findings
revealed that the mean percentage removal in
COD, BOD5 and TSS after treatment
procedure were found to be 84.7%, 83.3%
and 53.8% respectively.
respectively. Consequently TU values were
found as 3.0, 3.4, 4.0 and 4.2 after 24, 48, 72
and 96 hours, respectively (Table 4).
Discussion
Consequences of the study on acute
toxicity of treated municipal wastewaters on
D. magna in Korea

Whole Effluent Toxicity Test

Results of physicochemical parameters

measured in wastewaters showed a
significant decrease in the values while those
of toxicity tests on D. magna did not indicate
such a reduction (Table 3). None of D.
magna individuals allowed to live in 100%
untreated and treated wastewaters managed
to survive even in the shortest time of testing.

However, the value of toxicity in

immobilized D. magna was defined as LC50
and TU varying with testing time (Table 4).

Although all the MMWTPs wastewaters

were discharged under the regulations for the
conventional water quality standards,
revealed toxicities in the whole effluent
toxicity tests with D. magna. In addition,
biological toxic effect increased based on the
duration of the test. LC50 value of the tests
performed with untreated wastewater was
24.9 after 24 hours while it dropped to 15.8,
12.7 and 11.3 following 48, 72 and 96 hours,
respectively. Accordingly, TU values were
measured as 4.0, 6.3, 7.9 and 8.8 after 24, 48,
72 and 96 hours, respectively. Toxic effect of
treated waters on D. magna immolization was
less than that of untreated waters on it.
However, toxic effect of treated wastewaters
on D. magna increased in longer periods,
which was similar to that of untreated
wastewaters on it. Although LC50 value was
32.9 following 24 hours, it decreased to 29.4,
25.1 and 23.8 after 48, 72 and 96 hours,
Table 2. Chemical characteristics of untreated and treated wastewaters collected from
MMWTP

COD BOD5 TSS pH

mgO2/L mgO2/L mg/L

Untreated WW 288.0 96.0 57.3 7.3

Treated WW 44.2 16.0 26.5 7.5

Discharge limits in Turkey ( Turkish Official

Newspaper, 2004) 180.0 50.0 70.0 6-9

Discharge limits EU (91/271/EEC) 125.0 25.0 35.0 -

Table 3. Mortality of D. magna exposed to different concentrations of both untreated and

treated wastewaters collected from MMWTP

Wastewater

Concentrations
% Mortality %

24 48 72 96
h h h h

Treate Treate Treate Treate

Untreated d Untreated d Untreated d Untreated d

0 0 0 0 0 0 0 0 0

1 0 0 0 0 0 0 0 0

3 5 0 15 0 15 0 15 0

10 20 5 20 15 30 25 35 25

30 40 15 70 35 80 40 85 45

100 100 100 100 100 100 100 100 100

Table 4: Toxicity evaluation of untreated and treated wastewaters collected from MMWTP
using D. magna
 95% Confidence
Hour LC50 Limits TU Class Toxicity

Untreated

24 24.9 17.2 - 37.2 4.0 III Acute toxicity

48 15.8 10.7 - 23.4 6.3 III Acute toxicity

72 12.7 8.7 - 18.5 7.9 III Acute toxicity

96 11.3 7.8 - 16.4 8.8 III Acute toxicity

Treated

24 32.9 24.7 - 44.6 3.0 III Acute toxicity

48 29.4 21.2 - 41.4 3.4 III Acute toxicity

72 25.1 17.7 - 36.2 4.0 III Acute toxicity

96 23.8 16.9 - 34.1 4.2 III Acute toxicity

indicated that of TU values in five different
municipal wastewaters after 48 hours, only
one wastewater TU value exceeded 1 (1.31)
while the other four TU values remained
below 1 (0.10-0.80) (Ra et al., 2007), as
compared to which treated wastewaters of
MMWTP were found to have significantly
more toxic effect on D. magna. Because
municipal wastewaters are complex mixtures,
it is natural for them to show different
physicochemical properties based on time
and location, from which it could be
concluded that toxic effect remains variable
as well.
The present study showed that
municipal wastewaters could be harmful to
biota even if they evidently met standards for
wastewater discharge limits, since
measurement of sufficient amount of
physicochemical parameters requires
determination of standards of discharge
limits. However, as we previously cited,
municipal wastewaters could include
complex toxic, carcinogenic and mutagenic
organic and inorganic substances which are
all difficult to determine (Ricking et al.,
2003; Servos et al., 2005; Cristale and
Lacorte, 2015).
Zein et al. (2015) determined similar
values of toxicity removal for D. magna
after primary and secondary treatment. The
potential impact of complex chemical
mixtures (e.g., treated wastewater) can
enhance the toxicity of exposure to the
insecticide. Complex chemical mixtures
exposure in aqueous systems is an input of
contaminants in the environment (Zein et al,
2015).
No significant reduction was observed
for whole effluent acute toxicity by
luminescent bacteria assay and cladoceran
assay (Sun et al., 2015).
Feeding rate inhibition and oxidative
stress of effluent from a liquid crystal
display (LCD) wastewater treatment plant
(WWTP) to D. magna (reference species)
and Moina macrocopa were monitored and
raw wastewater was acutely toxic to both D.
magna and M. macrocopa, but the toxicity
reached less than 1 TU in the final effluent
(FE) as treatment proceeded (Kim et al.,
2012).
It has been reported that D. magna can
be a useful analytical tool for early warning
system to monitor of WWTP. Results of
ecotoxicity tests presented Daphnia mobility
ranges from 0 to 100% at the untreated and
from 15 to 100% after treated(Mendonça et
al., 2013).
In conclusion, we claim and propose that
measurement of toxicity and monitoring of
physicochemical parameters be performed
simultaneously in large-scale treatment plants
and that discharge limits be standardized in
view of protection of biota in fresh waters.
Furthermore, it should be considered whether
there are other possible discharges into the
recieving environment and if there are what
types and how much they are so as to protect
biota.
Based on the results of the study and on
other experiences, we reported that
ecotoxicological tests should be used for
assessment municipal whole effluents in
Turkey since they help predetermine whether
municipal wastewaters are toxic in the
shortest time possible. Data of the present
study on water flea show that wastewater
discharges into receiving environment could
enable us to understand their toxic potential.
Municipal effluents which are treated
and compared with standards of permissible
discharge limits in Turkey have toxic
potential to living D. magna. Therefore,
whole effluent toxicity tests are needed to
combine measurement of physicochemical
parameters with assessment to better protect
the quality of the fresh water environment.
Acknowledgment
The authors would like to thank Celal
Bayar University (Project Code: BAP - FEF
2006-088) for providing financial support for
the project.
References
APHA (American Public Health
Association), 1998. Standart methods
for the examination of water and
wastewater/prepared and published
jointly by American Public Health
Association, American Water Works
Association, Water Environment
Federation., 20 Edition (Joint editorial
board, Lenore S. Clesceri, Arnold E.
Greenberg, Andrew D. Eaton ;
Managing editor, Mary Ann H.
Franson). American Public Health
Association, Washington DC.
http://trove.nla.gov.au/version/38126605.
Boyd, G.R, Reemtsma, H., Grimm, D.A and
Mitra, S. 2003. Pharmaceuticals and
personal care products (PPCPs) in
surface and treated waters of Louisiana,
US and Ontario, Canada. Science of the
Total Environment, 311(1-3): 135–49.
Cristale, J. and Lacorte, S. 2015. PBDEs
versus NBFR in wastewater treatment
plants: occurrence and partitioning in
water and sludge. AIMS Environmental
Science, 2(3): 533-546. doi:
10.3934/environsci.2015.3.533
Daughton, C.G. and Ternes, T.A. 2000.
Pharmaceuticals and personal care
products in the environment: Agents of
subtle change?. Environmental Health
Perspectives, 107 (6): 907-38.

Environment Canada, 2001. State of
Municipal Wastewater Effluents in
Canada (State of the Environment
Report). Prepared by Indicators and
Assessment Office, Ecosystem Science
Directorate, Environmental
Conservation Service, Environment
Canada. ISBN 0-662-29972-8. Cat. No.
En1-11/96E, Ottawa, Ontario, 74 pp.
E.U. (European Union) Council Directive
91/271/EEC of 21 May 1991.
Concerning urban waste-water
treatment (91/271/EEC), 1991, Official
Journal of the European Communities,
No. L 135, 30 May 1991. 40-52.
Fent, K. 1996. Organotin compounds in
municipal wastewater and sewage
sludge: contamination, fate in treatment
process and ecotoxicological
consequences. Science of The Total
Environment, 185 (1–3): 151–159. doi:
10.1016/0048-9697(95) 05048-5.
ISO (International Organisation for
Standardisation). 1996. Water Quality:
Determination of the inhibition of the
mobility of Daphnia magna Straus
(Cladocera, Crustacea) – Acute Toxicity
Test. ISO 6341, Geneva, Switzerland.
Kim, S-B., Kim, W-K., Chounlamany, V.,
Seo, J., Yoo, J., Jo, H-J and Junga, J.
2012. Identification of multi-level
toxicity of liquid crystal display
wastewater toward Daphnia magna and
Moina macrocopa. Journal of
Hazardous Materials, 227–228: 327–
333.
doi:10.1016/j.jhazmat.2012.05.059.
Lindstrom, A., Buerge, I.J., Poiger, T.,
Bergqvist, P.A., Muller, M.D. and
Buser, H.R. 2002. Occurrence and
environmental behavior of the
bactericide triclosan and its methyl
derivative in surface waters and in
wastewater. Environmental Science and
Technology, 36: 2322–2329.
Lindqvist, N., Tuhkanen, T. and Kronberg,
L. 2005. Occurrence of acidic
pharmaceuticals in raw and treated
sewages and in receiving waters. Water
Research, 39 (11): 2219–2228.
Lishman, L., Smyth, S.A., Sarafin, K.,
Kleywegt, S., Toito, J., Peart, T., Lee,
B., Servos, M., Beland,
M. and Seto, P. 2006. Occurrence and
reductions of pharmaceuticals and personal
care products and estrogens by municipal
wastewater treatment plants in Ontario,
Canada. Science of the Total Environment,
367 (2-3): 544-558.
Marzan, L.W., Barua, P., Akter, Y., Mannan,
A., Hossain, A. and Ali, Y. 2014.
Molecular investigation on
clinopathological, genetic and
biochemical changes in Channa
punctata infected with internal parasites
and subjected to metals pollution in
Chittagong, Bangladesh. Journal of
Biomolecular Research and
 Therapeutics, 3: 113. doi: 10.4172/2167-
7956.1000113.
Mendonça¸ E., Picado, A., Paixão, S.M.,
Silva, L.,
Oral, R., Meric, S., De Nicola, E., Petruzelli,
D., Della Rocca, C. and Pagano, G.,
2007. Multi-species toxicity evaluation
of a cromium-based leather tannery
wastewater. Desalination, 211: 48-57.

Barbosa, M. and M.A. Paxéus N. 1996. Organic pollutants in the

Cunha, 2013.
Ecotoxicological evaluation
wastewater in a municipal WWTP in
Lisbon area (Portugal). Desalination and
Water Treatment, 51: 4162– 4170. doi:
10.1080/19443994.2013.768021
Nakada, N., Tanishima, T., Shinohara, H.,
Kiri, K. and Takada, H. 2006.
Pharmaceutical chemicals and endocrine
disrupters in municipal wastewater in
Tokyo and their removal during
activated sludge treatment. Water
Research, 40 (17): 3297–3303.
effluents of large wastewater treatment
plants in Sweden. Water Research, 30:
1115–1122.
of
Persoone, G., Marsalek, B., Blinova,I.,
Törökne, A., Zarina, D., Manusadzianas,
L., Nalecz-Jawecki, G., Tofan, L.,
Stepanova, N., Tothova, L. and Kolar,
B. 2003. A practical and user-friendly
toxicity classification system with
microbiotests for natural waters and
wastewaters. Environmental
Toxicology, 18 (6): 395–402.
doi: 10.1002/tox.10141.

Persoone, G., Baudo, R., Cotman, M.,

doi: Blaise, C., Thompson, K. C., Moreira
10.1016/j.watres.2006.06.03 Santos, M., Vollat, B., Törökne, A. and
9 Han, T. 2009. Review on the acute
Daphnia magna toxicity test -
E.E Evaluation of the sensitivity and the
Odjadjare, . and Okoh, A.I. 2010. precision of assays performed with
organisms from laboratory cultures or
Physicochemical quality of an urban
hatched from dormant eggs. Knowledge
municipal
and Management of Aquatic
wastewater effluent and its impact on the Ecosystems, 393: 1-29.

receivin Environmen
g environment. tal
Ra, J.S., Kim, H.K., Chang, N.I. and Kim,
Monitoring and Assessment, 170: 383– S.D. 2007. Whole effluent toxicity
394. (WET) tests on wastewater treatment
plants with Daphnia magna Selenastrum
doi: 10.1007/s10661-009-1240-y. capricornutum. Environmental
 Monitoring and Assessment, 129 (1-3):
107-113.
Ricking, M., Schwarzbauer, J., Hellou, J.,
Svenson, A. and Zitko, V. 2003.
Polycyclic aromatic musk compounds in
sewage treatment plant effluents of
Canada and Sweden-first results. Marine
Pollution Bulletin, 46 (4): 410-7.
Rowsell, V.F., Tangney, P., Hunt, C. and
Voulvoulis, N. 2010. Estimating levels
of micropollutants in municipal
wastewater. Water Air Soil Pollution,
BB 357–368. doi: 0.1007/s11270-009-
0112-y Sarma S.S.S. and Nandini, S. 2006.
Review of recent ecotoxicological studies on
cladocerans. Journal of Environmental
Science and Health, Part B,
4. 1417-1430.
Sánchez-Meza, J.C., Pacheco-Salazar, V.F.,
Pavón-
T.B., Guiérrez- V.G.,
Silva., García, Avila-
González Cde, J. and Guerrero-García,
P. 2007.
Toxicit assessment of a complex
y industrial
wastewater using aquatic and terrestrial
bioassays Daphnia pulex and Lactuca
sativa. Journal of Environmental
Science and Health. Part A,
Toxic/Hazardous Substances and
Environmental Engineering, 42 (10):
1425-31.
Servos, M.R., Bennie, D.T., Burnison, B.K.,
Jurkovic, A., McInnis, R., Neheli, T.,
Schnell, A., Seto, P., Smyth, S.A. and
Ternes, T.A. 2005. Distribution of
estrogens, 17β-estradiol and estrone, in
Canadian municipal wastewater
treatment plants. Science of the Total
Environment, 336: 155–170.
Sun, J., Quan, Y., Wang, W., Zheng , S. and
Liu, X. 2015. Potential contribution of
inorganic ions to whole effluent acute
toxicity and genotoxicity during sewage
tertiary treatment. Journal of
22–
Hazardous Materials, 295: 28.
doi:
10.1016/j.jhazmat.2015.04.012.
Tatarazako, N. and Oda, S. 2007. The water
flea Daphnia magna (Crustacea,
Cladocera) as a test species for
screening and evaluation of chemicals
with endocrine disrupting effects on
crustaceans. Ecotoxicology, 16: 197-
203.
Ternes, T.A. 1998. Occurrence of drugs in
German sewage treatment plants and
rivers. Water Research, 32 (11): 3245-
3260.
Ternes, T.A., Stumpf, M., Kreckel, P.,
Mueller, J., Haberer, K., Wilken, R.D.
and Servos, M.R. 1999. Behavior and
occurrence of estrogens in municipal
sewage treatment plants. I.
Investigations in Germany, Canada and
Brazil. Science of the Total
Environment, 225 (1-2): 81–90.
Turkish Official Newspaper. 2004. Su
kirliliği kontrolü yönetmeliği (Water
pollution control regulations Date:
31.12.2004 Number: 25687) (in
Turkish).

TurkStat, 2013. Turkey’s Statistical Year

Book, 2013, Turkish Statistical Institut
Printing Division,Ankara, Türkiye.

USEPA (United States Environmental

Protection Agency). 2002. Methods for
measuring the acute toxicity of effluents
and receiving waters to freshwater and
marine organism, Fifth edition, EPA-
821-R-02- 012, Office of Water (4303T),
Washington, DC.

Wang, C., Wang, Y., Kiefer, F., Yediler, A.,

Wang, Z. and Kettrup, A. 2003.
Ecotoxicological and chemical
characterization of selected treatment
process effluents of municipal sewage
treatment plant. Ecotoxicology and
Environmental Safety,

13. (2): 211-217. doi: 10.1016/S0147-

6513(02)00121-5.

Zein, M.A., McElmurry, S.P., Kashian,

D.R., Savolainen, P.T. and Pitts, D.K.
2015. Toxic effects of combined
stressors on Daphnıa pulex: interactions
between diazinon, 4-nonylphenol, and
wastewater effluent. Environmental
Toxicology and Chemistry, 34 (5):
1145–1153. doi: 10.1002/etc.2908.
J. Trop. Agric. and Fd. Sc. 45(1)(2017): 111 – 119

In-vivo toxicity studies of a mixture of Hibiscus sabdariffa L.,

Clinacanthus nutans L. and Stevia leaves in Sprague Dawley rats

(Kajian ketoksikan in-vivo campuran daun Hibiscus sabdariffa L.,

Clinacanthus nutans L. dan Stevia terhadap tikus Sprague Dawley)

10Hasnisa1, M. Syahida1, H. Hadijah1, Z. Kharis1, A. Sharizan1, D. Mohd

Nazrul Hisham1, R. Suri1, Z.J. Arif1, S. Ahmad Tarmizi1 and M.F. Nurul
Nabilah1

1
Food Science Technology Research Centre, MARDI Headquarters, Persiaran
MARDI-UPM,

43400 Serdang, Selangor, Malaysia

Abstract

Natural products from medicinal plants are widely used

worldwide as they are claimed to generate new alternative
medicines. Following its proven medicinal properties, a
mixture of Hibiscus sabdariffa L., Clinacanthus nutans L.,
Stevia rebaudiana in the ratio of 1:1:0.5 (HS:CN:Stevia;
w/w/w) was shown to be effective therapy as diuretic and in
chemoprevention. However, no study has been conducted to
assess the toxic effect or the LD50 of this mixture. Therefore, a
standard in-vivo toxicological assessment was carried out in a
28-day oral administration study. The doses tested were 1,000
mg/kg, 2,000 mg/kg and 5,000 mg/kg of body weight in
Sprague Dawley rats. No mortality, adverse clinical signs and
abnormal changes in body weight. Toxicologically significant
changes were only seen in relative liver weight, red blood cell
count, haematocrit, haemoglobin and total protein. However,
the difference was toxicologically insignificant since the values
were within normal physiological ranges. These observations
suggest that the mixture is practically non-toxic in Sprague
Dawley rats and the no-observed-adverse-effect level
(NOAEL) is greater than 5,000 mg/kg.

Keywords: tocixity, Hibiscus sabdariffa L.,

Clinacanthus nutans L., Stevia rebaudiana, rats
Introduction family. It is widely known as a
traditional medicinal plant in
Natural products from medicinal Southeast Asia such as Malaysia,
plants are widely used worldwide as Indonesia, Thailand and China. In
they are believed to be new Malaysia, the fresh leaves are
alternative medicines for usually boiled with water and
conventional therapy. Malaysia has consumed as herbal tea for treating
numerous plants with high cancer and diabetes (Muhammad
medicinal values such as Hibiscus Shahzad et al. 2015). In Indonesia
sabdariffa L. (HS), Clinacanthus and Thailand, CN is used to treat
nutans L. (CN), Stevia rebaudiana inflammation and viral infection
and others. HS is also known as (Yong et al. 2013), skin rashes,
roselle, sorrel, mesta and karkade is insects and snake bites, lesions
an annual herbaceous shrub of the caused by simplex herpes virus,
Malvaceae family (Lin et al. 2007). diabetes mellitus, fever and diuretics
Traditionally, the roselle leaves (Lau et al.2014). Several scientific
(green reddish color with 10 – 15 reports proved that CN is non-toxic
cm length and have a sour taste) are
(Chavalittumrong et al. 1995), has
used for medicinal purposes in anti-inflammatory, anti-hepatitis and
China and India in controlling high anti-herpes activities (Yoosook et al.
blood pressure, reducing menstrual 1999, Wanikiat et al. 2008, Sittiso et
pain, pyrexia and liver damage (Lin al. 2010) and anti-cancer activity
et al. 2007). Previous studies have (Yong et al. 2013)
demonstrated that roselle leaves
extract is non-toxic and posses
hypoglycaemic, hypolipidaemic,
antioxidant, oestrogenic effects and
anticancer effects (Lin et al. 2012).
Prasongwatana et al. (2008)
reported that infusions of the leaves
and calyx extracts could alleviate
fever, act as cholerectic, diuretic
and uricosuric substance. The
infusions could also decrease the
blood viscosity which revealed the
effect of anti-hypertension, anti-
obesity, anti-diabetic and anti-
cholesterol.

CN or commonly known as
Sabah snake grass or ‘Belalai
Gajah’ in Malaysian language is a
perennial herb in Acanthaceae
Stevia rebaudiana (Stevia) is a small
perennial and woody shrub in the
Asteraceae family and has been used
as a bio-sweetener and sugar
substitute (Gupta et al. 2013) to
lower blood sugar level (Goyal et al.
2010). It is also known as sweet herb,
sweet leaf, honey leaf, candy leaf or
honey yerba (Carakostas et al. 2008).
This magical natural herb is non-
toxic which its secondary metabolites
did not produce teratogenic,
mutagenic or carcinogenic effects
and no allergic reactions (Pol et al.
2007). Stevia has many
pharmacological and therapeutic
applications which could act as an
efficient medication for curing
chronic and non-chronic diseases like
diabetes, cardiovascular disease,
cancer, renal disease, obesity,
inflammatory bowel disease and
dental caries (Gupta et al. 2013)
Materials and methods
Sample preparation
The HS, CN and Stevia leaves were
dried using commercial oven dryer
at 40 °C until the moisture content
reached below 10 %. Dried samples
were then ground using Waring
blender (Waring, Connecticut) for 2
– 3 s and sieved (0.5 mm). The
herbal mixture was prepared by
mixing the leaves at ratio of 1:1:0.5
(HS:CN:Stevia; w/w/w) in sachets.
Sub acute oral toxicity study
CC sub-acute or 28-days repeated
dose oral toxicity study was
performed according to Ryu et al.
(2004). During the oral
The extract of the herbal mixture
was prepared by infusing the mixed
dried leaves with boiling water for
10 min. The extract were prepared
at three different concentrations
(1,000, 2,000 and 5,000 mg/kg) for
the oral toxicity study.
Experimental animals
A total of twenty female Sprague
Dawley rats weighing approximately
200 g each and 5 – 6 weeks old were
randomly assigned into four groups;
a control and three treatment groups
(n = 5). Individual body weights
were recorded and detailed physical
examinations on the fur, skin and
health condition were performed
twice during the7 days period of
acclimatisation to ensure the status of
healthy animals. The animals were
housed in a system controlled
environment in the light-dark cycle
(12 – 12 h, lights on 7:00 –19:00),
temperature (24 ± 2 °C) and a
relative humidity (30 – 70 %) during
the study.
The animals were provided ad
libitum with a standard pellet
(Specialty Feeds, Australia) and
distilled water.
administration period, Sprague
Dawley rats were respectively dosed
with distilled water (control group,
C) or herbal mixture at doses of
1,000 mg/kg of body weight (low
dose, LD), 2,000 mg/kg of body
weight (medium dose, MD) and
5,000 mg/kg of body weight (high
dose, HD) via drinking bottles as
they can access ad libitum. On
average, each rat usually consumed
about 100 ml of sample per day. Any
remaining sample left will be
measured. General appearance or
behaviour of each rat was observed
daily during the 28-days study and
the body weight was recorded
weekly.
Haematology and serum
biochemistry analysis
The animals were fasted for
approximately 12 h and blood
samples were withdrawn from the
vena cava under light ether
anesthesia. Samples of blood for
haematology and biochemistry
analyses were withdrawn. An
aliquot of blood per animal
(approximately 20 µl) was treated in
3 ml ethylen-diamino-tetracetic-acid
(K3-EDTA) tube (Bacton
Dickinson, BD Vaccutainer) to
analyse haematological indexes.
The blood sample was analysed for
complete blood profile: red blood
cell (RBC), white blood cell
(WBC), platelet (PLT), haematocrit
(HCT), and haemoglobin (Hb) level.
The measurements were performed
in a haematology analyser (Medonic
CA530, Italy).
For serum biochemical blood
analysis, one aliquot of blood per
animal was placed in a 5 ml Z-serum
tube (Bacton Dickinson, BD
Vaccutainer) and centrifuged at
3,000 rpm for 20 min. The serum
was analysed for aspartate
aminotransferase (AST), alanine
aminotransferase (ALT) activities,
bilirubin, total protein (TP), albumin
(Alb), globulin, glucose (Glu), urea,
creatinine (Cr), total cholesterol
(TC), triglyceride (TG), low density
lipoprotein (LDL) and high density
lipoprotein (HDL) by using blood
clinical analyser (Vitalab Selectra E,
Italy). All reagents for the tests were
obtained from Randox (Randox
Laboratories Ltd, Antrim, United
Kingdom).
Statistical analysis
All data for obtained were
expressed as mean ± standard
deviation (SD) and subjected to
one-way analysis of variance
(ANOVA) using SAS System,
ver. 9.0 statistical software. When
statistically significant differences
were indicated (p < 0.05), the
Duncan New Multiple Range Test
(DMRT) was employed for
comparisons between control and
treated groups.
Results and Discussion
Sub-acute oral toxicity study
Clinical observations and body
weight assessment
No abnormalities in terms of
clinical signs including death were
seen in rats from any groups. Figure
1 shows a non-significant increment
in body weight between the control
and treated groups. The results
showed that even the treated rats
have gained positive body weight Thus, this result suggested a within
signifying the absence of toxic normal function of the organs. The
effects of the mixture at all doses. relative liver weight of the low dose
Body weight changes have been treated group (6.42%) decreased
used as an indicator of adverse significantly (p <0.05) as compared
effects of drugs and chemicals (Teo to control group (7.96%) while the
et al. 2002; Hilaly et al. 2004) medium and high dose treated group
showed no significant difference.
Toxicity studies of herbal mixture in
Sprague Dawley Mumoli et al. (2006) and Giannini
et al. (2005) suggested that,
hepatotoxicity is associated with
increased of liver weight,
aminotransferases and alkaline
phosphatase enzyme level in
plasma. While, reduction of body
weight gain and internal organ
weight are generally considered as a
sensitive indicator of toxic effect
(Thanabhorn et al. 2006).
Nevertheless, in this study, the
Figure 1. Normalised mean body
reduction of liver weight is not
weight of rats at the end of the
conclusively attributed to toxicity
study period
since the blood enzymatic profiles
Relative organ weights (Table 2) were within normal
reference range (Petterino and
Argentino-Storino 2006).
Organ weight is the most sensitive
indicator of drug toxicity whereby
significant differences in organ
weights may occur in the absence of
any gross morphological changes
(Piao et al. 2013). Organ weights are
usually presented as relative values
and expressed as a percentage of
body weight (Wolfsegger et al.
2009). In this study, the actual and
relative organ weights at necropsy
following 28 days of toxicity study.
The results for relative organ
weights (liver, heart, lung, kidney
and spleen) were shown in Table 1.
 Meanwhile, the gross
examination at necropsy did not
reveal any experiment-related
changes. The gross interpretation
showed no lesion, inflammation,
bleeding, abnormal enlargement or
spots of internal organs been
observed in all treated rats as
compared to control.
Haematology
Table 3 shows no significant
differences in PLT and WBC (p
>0.05) between groups and such
values were in the normal reference
range (Petterino and Argentino-
Storino 2006). While, RBC in the
MD and HD group significantly (p
<0.05) increased as compared to the
control. The HD group had a
significant (p <0.05) increase in HCT
and Hb concentration compared to
control group. However, the result
did not show any toxicity-related
changes since the RBC and HCT
values were within the normal
reference range (Han et al. 2010).
This again, suggested no adverse
effect of herbal mixture on the
haematology values of the treated
rats.
Serum biochemistry
Table 2 shows concentration of ALT,
AST, bilirubin and protein in Sprague
Dawley rats during the study period.
Blood liver enzymes often measured
and used as an indicator of liver
damage and overall liver health
(Giannini et al. 2005). The ALT and
AST are liver marker enzymes
involved in the catabolism of amino
acids. The measurement of serum
levels of these two enzymes is a
standard feature of clinical chemistry
investigations in regulatory toxicity
studies (Ennulat et al. 2010). The
ALT is considered as liver specific
enzyme present in greatest
concentration in the hepatocytes of
most species (Hall 2001). Previous
study also showed that an increased
level of ALT activity in the serum is
accepted as an indication of hepatic
toxicity in rats whenever the damage
is more than 70% (Ennulat et al.
2010; Witthawaskul et al. 2003). It is
possible that in this study, there are
damages within the liver in the
treated group, but it did not exceed
70% for a significant rise in ALT to
be seen. Future work on the histology
of the liver will give a better
assessment on the actual toxic nature
of this mixture.
There was no significant
increased in the concentration of
bilirubin in all treated groups
compared to control group (Table
2).
Table 1. The percentage of relative organ weight of rats at the end of the study
period (Mean ± SD)

H
Analysis n Control LD MD D

1.4 ± 1. 1. ±
Kidney (%) 5 0.12a 1.4 ± 0.23 a
3 ± 0.14a 5 0.20a

0.9 ± 0. 0. ±
Heart (%) 5 0.12a 0.8 ± 0.11 a
7 ± 0.08a 9 0.15a

1.4 ± 1. 1. ±
Lung (%) 5 0.32a 1.2 ± 0.36 a
3 ± 0.12a 4 0.14a

0.5 ± 0. 0.
Spleen (%) 5 0.11a 0.4 ± 0.12 a
4 ± 0.06a 4 ± 0.05a

7.9 ± 7. 7. ±
Liver (%) 5 0.77a 6.4 ± 0.67 b
1 ± 0.36 ab
6 0.99a

Values bearing similar superscript/s do not

differ at p >0.05

Table 2. Selected serum biochemistry of rats at the end of the study

period (Mean ± SD)

Contr
Analysis ol LD MD HD

±
ALT (U/l) 52.3± 6.12a 58.8 ± 15.92a 51.3 8.76a 53.2 ± 8.79a

110. ± 114.
AST (U/l) 0 ± 12.54a 116.0 ± 20.86a 116.8 17.96a 7 ± 17.13a

Bilirubin ±
(µmol/l) 3.1± 0.79a 3.5 ± 0.79a 3.9 0.56a 3.6 ± 1.11a
 Globulin ±
(g/l) 30.7± 3.67a 35.3 ± 5.01a 35.7 3.44a 34.0 ± 3.90a

Albumin ±
(g/l) 48.5± 2.60a 49.0 ± 0.72a 50.6 1.13a 50.5 ± 1.83a

Total Protein ±
(g/l) 79.9± 4.73a 84.4 ± 5.62ab 86.0 2.64b 84.5 ± 2.84ab

Values bearing similar superscript/s do not

differ at p >0.05

Table 3. Haemogram of rats at the end of the study

period (Mean ± SD)

Analysis Control LD MD HD

RBC
(1012/l) 8.3 ± 0.78a 8.9 ± 0.36ab 9.3± 0.44b 9.3 ± 0.82b

HCT (%) 43.6 ± 3.62a 46.6 ± 2.59ab 47.8± 2.57ab 48.8 ± 4.10b

1474. 1576. ± 1395.± 1464.

9 a
PLT (10 /l) 4 ± 229.05 0 132.23a 7246.91a 4 ± 209.84a

WBC
(109/l) 5.6 ± 2.93ab 5.1 ± 0.25b 4.3± 0.26b 8.5 ± 1.60a

Hb (g/l) 163.2 ± 14.75a 177.3 ± 7.37ab 175.0± 9.84ab 182.2 ± 13.15b

Values bearing similar superscript/s do not differ at p >0.05

 A small elevation in plasma bilirubin concentration is an important
indicator of liver damage in laboratory animals (Rasekh et al. 2008). These
results indicated that based on gross and selected enzymes (Petterino and
Argentino-Storino 2006) and bilirubin (Han et al. 2010) parameters, there were
no adverse effect of herbal mixture on the liver of Sprague Dawley rats.

The serum protein profile showed no significant changes (Table 2) except

for slight significant (p < 0.05) increase on total protein level in MD group
(86.02 g/l) compared to the control (79.90 g/l). A decreased concentration of
total protein, albumin and globulin are associated with cirrhosis or liver
malfunction (Patel et al. 2008). A high protein level showed the possibility of
the liver and kidney malfunction where protein were not completely digested or
absorbed. A lower protein level usually related to dehydration or myeloma
multiple (Petterino and Argentino-Storino 2006). A cirrhotic liver is unlikely to
happen in this study as the duration was quite short.

Table 4 shows the creatinine and urea concentration as a measure of the

kidney status. A high level of urea and creatinine in blood indicates the
occurence of severe kidney damage since the kidney has failed to filter the urea
nitrogen out of circulation into the urine (Hassan et al. 2007; Rhionani et al.
2008). No evidence of kidney failure or malfunction were registered since the
concentration of urea and creatinine are within normal limits and comparable in
all (Petterino and Argentino-Storino 2006).

Table 5 shows the serum lipid profile TC, HDL, LDL and TG indicated no
significant changes in all treated rats.

The blood glucose concentration (Figure 2) also showed comparable levels

between all groups. This likely suggested that the oral administration of the
herbal mixture did not affect the general metabolism of glucose. All of the
presented results showed the absence of toxic effects in all tissues as the
measured profiles were within normal physiological ranges (Petterino and
Argentino-Storino 2006; Han et al. 2010). Likewise, the comparable values
between treated groups are evidence of an absent of a dose-response toxic
effect.

Conclusion

In conclusion, this 28-days oral toxicity study reveals that daily doses of 1,000,
2,000 and 5,000 mg/kg of the mixture did not elicit toxicity in Sprague Dawley
rats. The dose of 5,000 mg/kg/day was identified as the no-observed-adverse-
effect level (NOAEL) in this study.
Acknowledgement

The authors are thankful to the financial supports from MARDI and Malaysian
Ministry of Agricultural for the research development grant of P-161. The
authors also wish to thank Ms Nazarifah Ibrahim, Ms Nurhafiqa Mohamad
Hayadi and Ms Siti Nor Aslina Kamaruzaman for their technical support and
assistance.

Table 4. Kidney function assay of rats at the end of the study

period (Mean ± SD)

M
Analysis Control LD D HD

Urea (mmol/l) 7.6 ± 1.21a 8.2 ± 0.54a 8.0 ± 1.01a 7.8 ± 1.17a

Creatinine 63.
a a
(µmol/l) 63.6 ± 4.33 61.0 ± 3.39 7 ± 4.46a 64.8 ± 3.03a

Table 5. Serum lipid profile of rats at the end of the study

period (Mean ± SD)

M
Analysis Control LD D HD

TC (mmol/l) 1.9 ± 0.22a 1.7 ± 0.57a 1.4 ± 0.19a 1.5 ± 0.34a

HDL (mmol/l) 0.7 ± 0.09a 0.8 ± 0.26a 0.7 ± 0.15a 0.7 ± 0.17a

LDL (mmol/l) 0.6 ± 0.15a 0.5 ± 0.31a 0.3 ± 0.11a 0.5 ± 0.16a

TG (mmol/l) 1.2 ± 1.00a 0.8 ± 0.27a 0.8 ± 0.23a 0.8 ± 0.23a


Figure 2. The mean blood glucose
concentration of rats at the end of
the study period
Carakostas, M.C., Curry, L.L.,
Boileau, A.C. and Brusick,
D.J. (2008). Overview: The
history, technical function and
safety of rebaudioside A, a
naturally occurring steviol
glycoside, for use in food and
beverages. Food and
Chemical Toxicology 46: S1 –
S10
Chavalittumrong, P., Attawish, A.,
Rugsamon, P. and Chuntapet,
P. (1995). Toxicological Study
of Clinacanthus nutans
(Burm.f.) Lindau. Bulletin of
the Department of Medical
Sciences 37(4): 323 – 338
Ennulat, D., Walker, D., Clemo, F.,
Magid-Slav, M., Ledieu, D.,
Graham, M., Botts, S. and Boone, Han, Z.Z., Xu, H.D., Kim, K.H., Ahn,
14. (2010). Effects of
hepatic drug-metabolizing
enzyme induction on
clinical pathology
parameters in animals and
man. Toxicology Pathology
38: 810 – 828
15.
Giannini, E.G., Testa, R. and Savarino,
V. (2005). Liver enzyme
alteration: a guide for clinicians.
Canadian Medical Association
Journal 172: 367 – 379
Goyal, S.K., Samsher and Goyal, R.K.
(2010). Stevia (Stevia rebaudiana)
a bio-sweetener: a review.
International Journal of Food
Sciences and Nutrition 61(1): 1 –
10
Gupta, E., Purwar, S., Sundaram, S. and
Rai, G.K. (2013). Nutritional and
therapeutic values of Stevia
rebaudiana: A review. Journal of
Medicinal Plants Research
7(46): 3343 – 3353
Hall, R.L. (2001). Principles of clinical
pathology for toxicology studies. In:
Principles and methods of
toxicology, 4th Edition. (A Wallace
Hayes Taylor and Francis, eds.),
Philadelphia: CRC Press
T.H., Bae, J.S., Lee, J.Y., Gil, K.H.,
Lee, J.Y., Woo, S.J., Yoo, H.J., Lee,
H.K., Kim, K.H., Park, C.K., Zhang,
H.S. and Song, S.W. (2010).
Reference data of the main
physiological parameters in control
 Sprague-Dawley rats from pre-
clinical toxicity studies. Laboratory
Animal Research 26 (2): 153 – 164
Hassan, S.W., Ladan, M.J., Dogondaji,
R.A., Umar, R.A., Bilbis, L.S.,
Hassan, L.G., Ebbo, A.A. and
Matazu, I.K. (2007). Phytochemical
and toxicological studies of aqueous
leaves extracts of Erythrophleum
africanum. Pakistan Journal of
Biological Sciences10: 3815 – 382
Hilaly, J.E., Israili, Z.H. and
Lyoussi, B. (2004). Acute and
chronic toxicological studies of
Ajugaiva in experimental animals.
Journal of Ethnopharmacology 91:
43 – 50
Lau, K.W., Lee, S.K. and Chin, J.H.
(2014). Effect of the methanol
leaves extract of Clinacanthus
nutans on the activity of
acetylcholinesterase in male
mice. Journal of Acute Disease
22 – 25
Lin, H.H., Chen, J.H., Kuo, W.H.
and Wang, C.J. (2007).
Chemopreventive properties of
Hibiscus sabdariffa L. on
human gastric carcinoma cells
through apoptosis induction and
JNK/p38 MAPK signaling
activation. Chemico-Biological
Interactions 165: 59 – 75
Lin, H.H., Chan, K.C., Sheu, J.Y.,
Hsuan, S.W., Wang, C.J. and
Chen, J.H. (2012). Hibiscus
sabdariffa leaf induces
apoptosis of human prostate
cancer cells in vitro and in vivo.
Food Chemistry 132: 880 – 891
Muhammad Shahzad, A.,
Muhammad Syarhabil, A. and
Awang Soh, M. (2015). A
review on phytochemical
constituents and
pharmacological activities of
Clinacanthus nutans.
International Journal of
Pharmacy and Pharmaceutical
Sciences 7(2): 30 – 33
Mumoli, N., Cei, M. and Cosimi,
A. (2006). Drug-related
hepatotoxicity. The New
England Journal of Medicine
354(20): 2191 – 2193
Patel, C., Dadhaniya, P.,
Hingorani, L. and Soni, M.G.
(2008). Safety assessment of
pomegranate fruit extract:
Acute and subchronic
toxicity studies. Food and
Chemical Toxicology 46:
2728 – 2735
Petterino, C. and Argentino-Storino,
A. (2006). Clinical chemistry
and haematology historical data
in control Sprague-Dawley rats
from pre-clinical toxicity
 studies. Experimental and
Toxicology Pathology 57: 213 –
219
Piao, Y., Liu, Y. and Xie, X.
(2013). Change trends of organ
weight background data in
Sprague Dawley rats at
different ages. Journal of
Toxicologic Phatology 26: 29 –
34
Pol, J., Hohnová, B. and
Hyötyläinen, T. (2007).
Characterization of Stevia
rebaudiana by comprehensive
two-dimensional liquid
chromatography time-of-flight
mass spectrometry. Journal of
Chromatography A 1150: 85 –
92
Prasongwatana, V., Woottisin, S.,
Sriboonlue, P. and
Kukongviriyapan, V.(2008).
Uricosuric effect of Roselle
(Hibiscus sabdariffa) in normal
and renal-stone former subjects.
Journal of Ethnopharmacology
117: 491 – 495
Rasekh, H.R., Nazari, P., Kamli-
Nejad, M. and Hosseinzadeh,
L. (2008). Acute and
subchronic oral toxicity of
Galega officinalis in rats.
Journal of Ethnopharmacology
116: 21 – 26
Rhionani, H., Elhilaly, J., Israili, Z.
and Lyoussi, B. (2008). Acute
and sub-chronic toxicity of an
aqueous extract of the leaves of
Herniaria glabra in rodents.
Journal of Ethnopharmacology
118: 378 – 386
Ryu, S.D., Park, C.S., Baek, H.M.,
Baek, S.H., Hwang, S.Y. and
Chung, W.G. (2004). Anti-
diarrheal and spasmolytic
activities and acute toxicity
study of Soonkijangquebo, a
herbal anti-diarrheal formula.
Journal of Ethnopharmacology
91: 75 – 80
Sittiso, S., Ekalaksananan, T.,
Pientong, C.,
Sakdarat, S., Charoensri, N.
and Kongyingyoes, B. (2010).
Effects of compounds from
Clinacanthus nutans on
dengue virus type II infection.
Srinagarind Medical Journal
25 (Suppl).
Teo, S., Stirling, D., Thomas, S.,
Hoberman, A. and Khetani, V.
(2002). A 90-day oral gavage
toxicity study of D-
methylphenidate and D,L-
methylphenidate in Sprague-
Dawley rats. Toxicology 179:
183 – 196

Thanabhorn, S., Jaijoy, K.,
Thamaree, S., Ingkaninan,
K. and Panthong, A. (2006).
Acute and subacute toxicity
study of the ethanol extract
from Lonicera japonica
Thunb. Journal of
Ethnopharmacology 107:
370 – 373
Witthawaskul, P., Panthong, A.,
Kanjanapothi, D., Taesothikul,
T. and Lertprasert-suke, N.
(2003). Acute and subacute
toxicities of the saponin
mixture isolated from
Schefflera leucantha Viguier.
Journal of
Ethnopharmacology 89: 115 –
121
Wolfsegger, M.J., Jaki, T., Dietrich,
B., Kunzler, J.A. and Barker,
K. (2009). A note on statistical
analysis of organ weights in
non-clinical toxicological
studies. Toxicology and Applied
Pharmacology 240: 117 – 122
Yong, Y.K., Tan, J.J., Teh, S.S.,
Siau, H.M., Lian Ee, G.C.
Wanikiat, P., Panthong, A.,
Sujayanon, P., Yoosook, C.,
Rossi, A.G. and Reutrakul, V.
(2008). The anti-inflammatory
effects and the inhibition of
neutrophil responsiveness by
Barleria lupulina and
Clinacanthus nutans extracts.
Journal of Ethnopharmacology
116 (2): 234 – 244
Chiong, H.S. and Zuraini, A.
(2013). Clinacanthus nutans
extracts are antioxidant with
antiproliferative effect on
cultured human cancer cell
lines. Evidence-Based
Complementary and Alternative
Medicine Article ID 462751, 8
p.
http://dx.doi.org/10.1155/2013/4
62751
Yoosook, C., Panpisutchai, Y.,
Chaichana, S., Santisuk, T.
and Reutrakul, V. (1999).
Evaluation of anti-HSV-2
activities of Barleria lupulina
and Clinacanthus nutan.
Journal of
Ethnopharmacology 67(2):
179