Anda di halaman 1dari 22

1.

TUJUAN PRAKTIKUM

Tujuan dilakukannya praktikum ini adalah agar praktikan dapat mengetahui cara
mengisolasi DNA, mengetahui cara mengekstraksi DNA dari inti sel, mengetahui cara
pemurnian DNA, serta mengetahui dan membandingkan bentuk DNA pada sel hewan,
bakteri, dan yeast.

2. TINJAUAN PUSTAKA

DNA adalah asam nukleat yang mengandung materi genetik dan berfungsi untuk
mengatur perkembangan biologis seluruh bentuk kehidupan secara seluler. DNA terdapat
pada nukleus, mitokondria dan kloroplas. DNA nukleus berbentuk linear dan berasosiasi
sangat erat dengan protein histon, sedangkan DNA mitokondria dan kloroplas berbentuk
sirkular dan tidak berasosiasi dengan protein histon. Selain itu, DNA mitokondria dan
kloroplas memiliki ciri khas, yaitu hanya mewariskan sifat-sifat yang berasal dari garis
ibu. Hal ini sangat berbeda dengan DNA nukleus yang memiliki pola pewarisan sifat dari
kedua orangtua. Dilihat dari organismenya, struktur DNA prokariot berbeda dengan
struktur DNA eukariot. DNA prokariot tidak memiliki protein histon dan berbentuk
sirkular, sedangkan DNA eukariot berbentuk linear dan memiliki protein histon (Klug &
Cummings, 1994).

Di dalam sel, DNA bertindak sebagai penyimpan informasi genetik yang tersimpan
sebagai genom (total informasi genetik) dalam sel. Secara nyata, DNA mengisi inti sel
yang penyimpanannya sangat terorganisasi dalam bentuk benang kromatid dan
kromosom. DNA tidak hanya terdapat dalam eukaryot, tetapi juga terdapat dalam
mitokondria dan kloroplastida. Pada eukaryot, DNA di dalam satu kromosom merupakan
molekul linier yang berlipat – lipat, dan spesies yang berbeda mempunyai jumlah
kromosom yang berbeda pula. Fungsi utama DNA adalah penyimpanan dan
mengorganisasikan informasi genetik total dalam sel (Muslim, 2003).

1
Stabilitas dari DNA dipengaruhi oleh matrix yang terkandung dalam DNA. Jadi tidaklah
mengherankan jika DNA pada padatan akan jauh lebih stabil jika dibandingkan dengan
DNA pada media cair. Karena pada padatan, matrix yang dikandung juga lebih banyak.
Sedangkan pada media cair, matrix yang ada kurang kuat, sehingga DNA mudah
terdegradasi. Hal yang sama juga ditemui pada bidang pangan, DNA rekombinan dari
starter yang berasal dari mahkluk hidup pada fermentasi termal akan memberikan
perlindungan bagi DNA untuk mencegah aktivitas Dnase I pada jaringan daging
(Skarger, 2001).

DNA memiliki struktur pilinan utas ganda yang antiparalel dengan komponen-
komponennya, yaitu gula pentosa (deoksiribosa), gugus fosfat, dan pasangan basa.
Pasangan basa pada DNA terdiri atas dua macam, yaitu basa purin dan pirimidin. Basa
purin terdiri atas adenin (A) dan guanin (G) yang memiliki struktur cincin-ganda,
sedangkan basa pirimidin terdiri atas sitosin (C) dan timin (T) yang memiliki struktur
cincin-tunggal. Ketika Guanin berikatan dengan Sitosin, maka akan terbentuk tiga ikatan
hidrogen, sedangkan ketika Adenin berikatan dengan Timin maka hanya akan terbentuk
dua ikatan hidrogen. Satu komponen pembangun (building block) DNA terdiri atas satu
gula pentosa, satu gugus fosfat dan satu pasang basa yang disebut nukleotida (Lewis,
2003).

Sebuah sel memiliki DNA yang merupakan materi genetik dan bersifat herediter pada
seluruh sistem kehidupan. DNA baik pada manusia, tumbuhan maupun hewan, dapat
diisolasi. DNA manusia atau hewan dapat diisolasi melalui darah. Darah manusia dan
hewan terdiri atas plasma darah, globulus lemak, substansi kimia (karbohidrat, protein
dan hormon), dan gas (oksigen, nitrogen dan karbon dioksida). Plasma darah terdiri atas
eritrosit (sel darah merah), leukosit (sel darah putih) dan trombosit (platelet). Komponen
darah yang diisolasi yaitu sel darah putih. Sel darah putih dijadikan pilihan karena
memiliki nukleus, di mana terdapat DNA di dalamnya. DNA pada tumbuhan juga dapat
diisolasi. DNA pada manusia atau hewan lebih banyak dan lebih jelas terlihat daripada
DNA pada tumbuhan (Kimball, 1992).

2
Molekul DNA pada semua macam sel terdiri atas unit – unit keempat mononukleotida
utama yaitu d AMP, d GMP, d TMP, dan d CMP yang dihubungkan dalam suatu variasi
deretan oleh ikatan fosfodiester. DNA suatu spesies atau organisme tertentu mempunyai
perbandingan dan urutan yang khas untuk keempat mononukleotida tersebut. Selain itu,
berat molekul DNA untuk tiap macam organisme juga berbeda. Sel eukaryotik
mengandung beberapa kromosoma dan mempunyai banyak molekul DNA dengan berat
molekul yang sangat besar (Wirahadikusumah, 1989).

Struktur dan fungsi fisiologis bagian-bagian sel dapat dikaji dengan beberapa cara.
Misalnya, kita mengisolasi protein dan DNA serta menganalisis struktur dan fungsinya
secara in vitro. Isolasi protein dan DNA. Protein tertentu suatu sel (misalnya enzim
amilase atau lainnya) dapat difraksinasi, dipisahkan atau dimurnikan dari campuran
molekul lain melalui prosedur purifikasi protein. Aktivitas protein yang telah dimurnikan
kemudian dapat diuji dengan parameter biokimia (misalnya kinetika enzim dll) dan
dengan beberapa cara lainnya struktur primer, sekunder, dan tersier, dan kuartener dapat
ditentukan. Demikian pula aktivitas DNA dan enzim yang bekerja untuk DNA dapat diuji
secara invitro dengan bantuan mesin PCR (Polymerase Chain Reaction). Kita bahkan
dapat melakukan sintesis DNA secara invitro (Choirul, 2003).

Prinsip-prinsip dalam melakukan isolasi DNA ada 2, yaitu sentrifugasi dan presipitasi.
Prinsip utama sentrifugasi adalah memisahkan substansi berdasarkan berat jenis molekul
dengan cara memberikan gaya sentrifugal sehingga substansi yang lebih berat akan
berada di dasar, sedangkan substansi yang lebih ringan akan terletak di atas. Teknik
sentrifugasi tersebut dilakukan di dalam sebuah mesin yang bernama mesin sentrifugasi
dengan kecepatan yang bervariasi (Kimball, 1992).

Menurut Anonim (2006), isolasi DNA memiliki beberapa tahapan, yaitu:


a. Isolasi jaringan yang diinginkan.
b. Dinding dan membran sel dilisiskan
Menggunakan larutan pelisis yang merupakan larutan hipotonis. Karena larutan
tersebut hipotonis, maka akan terjadi hemolisis.

3
c. Diekstraksi dalam larutan
Setelah dilakukan inkubasi, jaringan yang telah bercampur dengan larutan pelisis
tersebut disentrifugasi selama 10 menit dengan kecepatan 2500 rpm. Selanjutnya
supernatan yang terbentuk dibuang dan kemudian dilakukan ekstraksi di dalam
larutan. Hal tersebut bertujuan agar didapat ekstrak nukleusnya.
d. Dipurifikasi
Tahap ini bertujuan untuk membersihkan jaringan dari zat-zat lainnya.
e. Dipresipitasi
Tahap terakhir ini, bertujuan untuk mengendapkan protein histon, sehingga untai-
untai DNA tidak lagi menggulung (coiling) dan berikatan dengan protein histon, yang
menyebabkan DNA menjadi terlihat. Supernatan yang berisi DNA kemudian
dituangkan ke dalam tabung berisi isopropanol dingin dan tabung dibolak-balik
dengan gerakan angka 8. Pemberian isopropanol bertujuan untuk visualisasi DNA.
Selanjutnya tabung disentrifugasi kembali selama 5 menit dengan kecepatan 3000
rpm. Hasil dari sentrifugasi adalah terdapatnya pelet DNA pada dasar tabung yang
kemudian ditambahkan etanol 70% dan dibolak-balik kembali. Pemberian etanol
bertujuan untuk membersihkan DNA dari pengotor-pengotornya. Setelah tercampur,
tabung kemudian disentrifugasi kembali selama 5 menit dengan kecepatan 3000 rpm.
Hasil akhirnya adalah DNA yang berada pada tepi dasar tabung. Langkah akhirnya
adalah dengan pemberian Tris-EDTA yang bertujuan untuk melarutkan kembali DNA
untuk dipreservasi (Harley, 2006).

Genom adalah set lengkap materi genetik (DNA) yang dimiliki suatu organisme dan
terorganisasi menjadi kromosom. DNA juga dapat diisolasi, baik pada manusia maupun
pada tumbuhan. Sel dijadikan pilihan karena memiliki nukleus, di mana terdapat DNA di
dalamnya. DNA pada tumbuhan juga dapat diisolasi. Prinsip-prinsip dalam melakukan
isolasi DNA ada 2, yaitu sentrifugasi dan presipitasi. Prinsip utama sentrifugasi adalah
memisahkan substansi berdasarkan berat jenis molekul dengan cara memberikan gaya
sentrifugal sehingga substansi yang lebih berat akan berada di dasar, sedangkan substansi
yang lebih ringan akan terletak di atas (Anonim, 2006).

4
Fraksinasi sel adalah upaya untuk memisah-misahkan bagian sel dan mengambil organel
yang diingini. Cara fraksinasi umumnya dimulai dengan homogenasi, diikuti dengan
ultrasentrifugasi sehingga akhirnya diperoleh organel yang diinginkan. Homogenasi
adalah upaya penggerusan jaringan agar sel-sel pecah dan isinya diletakkan dalam
medium homogenat dengan buffer yang menjaganya dari kerusakan. Ultrasentrifugasi :
pemusingan dengan kecepatan yang amat tinggi terhadap homogenat. Biasanya
ultrasentrifugasi dilaksanakan secara bertahap :
1. Sentrifugasi pada kecepatan 800 gram memisahkan bahan dari komponen makro
(debre atau kotoran yang harus dipisahkan pada tahap awal akan mengendap sebagai
pelet). Supernatan / cairan dipisahkan dari debre yang mengendap. Pada kecepatan 800
gram s/d 1.000gram inti sel diketahui mengendap.
2. Sentrifugasi bertahap, berturut-turut pada kecepatan yang berbeda (misal 20.000
g, 100.000 g, dan 150.000 g) terhadap supernatan di atas kemudian dilakukan sentrifugasi
dengan kecepatan berbeda-beda secara bertahap yang bertujuan untuk mendapatkan
organel / zat metabolik yang sedang diamati (Muslim, 2003).

Pelet pada setiap tahap sentrifugasi diamati sehingga organel kecil / molekul besar
tertentu mengendap pada tahap sentrifugasi tertentu di atas. Hasil isolat organel ini
biasanya diperoleh dari sentrifugasi dengan kecepatan tertentu sebagai berikut :
a. Pada kecepatan 20.000 s/d 30.000 gram organel mitokondria, kloroplas,
lisosom, dan mikrobodi akan mengendap sebagai pelet
b. Pada 50.000 s/d 80.000 gram retikulum endoplasma akan mengendap
c. Pada 80.000 s/d 100.000 gram retikulum endoplasma halus akan
mengendap
d. Adapun partikel kecil ribosom bebas dan partikel virus akan mengendap
pada kecepatan sentrifugasi 150.000 s/d 300.000 gram (Muslim, 2003).

Komposisi basa N pada DNA bervariasi antara spesies satu dengan lainnya. DNA yang
diisolasi dari bermacam-macam jaringan dalam satu spesies mempunyai basa N yang
sama. Komposisi basa N dalam DNA dalam satu spesies tertentu tidak mengalami
perubahan dengan umur, status nutrisional atau perubahan lingkungan. Ekstrak DNA

5
yang berasal dari spesies yang sangat dekat hubungan keluarganya mempunyai basa N
yang hampir sama dan sebaliknya apabila hubungan kekeluargaan itu jauh, maka
komposisi basa N nya sangat berbeda (Muslim, 2003).

Isolasi DNA dapat digunakan untuk mengecek ketepatan atau keidentikan dari suatu
kloning dengan gen yang diklon. Isolasi ini dapat dilakukan dengan PCR. Sel-sel dapat
diisolasi dari suatu jaringan dan dipisah-pisah menurut jenisnya masing-masing. Mula-
mula jaringan direduksi menjadi suatu suspensi yang hanya terdiri dari sel-sel yang
sejenis dengan cara membongkar matriks ekstraseluler dan sambungan-sambungan
antarsel. Sel-sel dapat dipisahkan dari suspensi sel dengan memanfaatkan perbedaan sifat
fisik sel (Alberts et al, 1994).

Larutan disaring untuk menghilangkan debris, seperti membran sel, protein yang
mengendap, potongan-potongan bahan yang tidak dapat dihancurkan seluruhnya dalam
blender. Molekul DNA yang larut air akan dapat melewati saringan. Lapisan lemak
bilayer dari membran sel dan nukleus dipecah oleh sabun, seperti lauryl atau laureth
sulfate yang terkandung dalam sampo and sabun pencuci piring. Sampo and sabun
pencuci piring juga mengandung EDTA (ethylene diamine tetraacetic acid), yang
mengikat kation seperti Mg2+. Kation bertindak sebagai kofaktor yang membantu enzim
bekerja. Salah satu enzim yang berperan ialah nuklease, yaitu dengan menguraikan DNA.
Kutub positif dari NaCl (Na2+) mengarah ke DNA yang bersifat negatif. Hal ini
menimbulkan shield di sekitar molekul DNA dan menyebabkannya berkumpul
(coalesce). Hal ini membuat DNA dapat terpresipitasi ketika ditambahkan alkohol. Selain
itu, garam juga menyebabkan protein terdenaturasi. Pada akhir percobaan, terbentuk
globula kecil putih. Hal ini merupakan DNA. Molekul DNA bersifat larut air, tapi tidak
larut dalam alkohol. Akibatnya, ketika DNA kontak dengan alkohol, molekul DNA akan
terpresipitasi dalam alkohol dan dapat terlihat secara visual. Namun, yang tampak
tersebut merupakan ribuan molekul DNA yang tergabung bersama. DNA murni
sebenarnya tidak berwarna. Warna yang tampak saat pengamatan berasal dari pigmen
bahan yang diekstrak DNA nya (Kimball, 1992).

6
Dalam proses ekstraksi DNA ditambahkan larutan ethanol. Penambahan ini berfungsi
untuk membantu mendeteksi adanya DNA dalam bahan pangan. Dalam ekstraksi, DNA
akan dihasilkan terdapat pada lapisan atas yang ditambahkan ethanol, karena DNA tidak
larut ethanol. Sehingga dapat diamati dengan melihat lapisan atas dari campuran tersebut
(Mazmur, 1961).

7
3. MATERI METODE

3.1. Materi
3.1.1. Bahan
Dalam praktikum ini, bahan-bahan yang digunakan antara lain adalah kultur bakteri
(Acetobacter xylinum), yeast (Saccharomyces cerevisiae), daging hati, kecambah kacang
hijau, larutan sukrosa 0,5 M dingin, larutan NaCl 1 M dingin, larutan 10 % deterjen
“sunlight”, larutan kloroform, larutan etanol 95 % dingin, dan es batu.

3.1.2. Alat
Alat-alat yang digunakan dalam praktikum ini antara lain timbangan, blender,
erlenmeyer, kain mori, corong, gelas ukur, beker glass , tabung sentrifuge, sentrifuge,
pengaduk, pipet tetes, pipet volum, pompa pileus, pipet mikro, baskom.

3.2. Metode
3.2.1. Sel Tumbuhan
3.2.1.1. Isolasi Inti Sel Tumbuhan
Pertama-tama 4 gram kecambah kacang hijau yang telah diiris ditimbang. Ditambah
dengan 20 ml larutan sukrosa 0,5 M dingin. Lalu dimasukkan ke dalam blender lalu
dihomogenisasi dengan kecepatan maksimum selama 15 detik. Ditambah dengan 20 ml
larutan sukrosa 0,5 M dingin. Kemudian disaring dengan kain saring. Filtrat
disentrifugasi selama 10 menit. Cairan yang dihasilkan dibuang sedangkan endapannya
diambil. Endapan yang didapat ditambah dengan 10 ml larutan sukrosa 0,5 M dingin.
Kemudian disentrifugasi lagi selama 10 menit. Cairan yang dihasilkan dibuang dan
endapannya diambil.

3.2.1.2. Ekstraksi DNA dari Inti Sel Tumbuhan


Endapan inti sel ditambah dengan 20 ml NaCl 1 M dingin dan 0,2 ml larutan “sunlight”
10 %. Campuran tersebut diaduk dalam baskom berisi es batu hingga mengental.
Kemudian ditambah 0,2 ml kloroform. Disentrifugasi selama 10 menit pada kecepatan

8
maksimal. Cairan yang didapat dipindah ke dalam erlenmeyer. Ditambahkan etanol
sebanyak 2 kali volume cairan tersebut. Perubahan yang terjadi diamati.

3.2.2. Sel Hewan


3.2.2.1. Isolasi Inti Sel hewan
4 gram daging hati yang telah diiris ditimbang. Ditambah dengan 20 ml larutan sukrosa
0,5 M dingin. Lalu dimasukkan ke dalam blender lalu dihomogenisasi dengan kecepatan
maksimum selama 15 detik. Ditambah dengan 20 ml larutan sukrosa 0,5 M dingin.
Kemudian disaring dengan kain saring. Filtrat disentrifugasi selama 10 menit. Cairan
yang dihasilkan dibuang sedangkan endapannya diambil. Endapan yang didapat ditambah
dengan 10 ml larutan sukrosa 0,5 M dingin. Kemudian disentrifugasi lagi selama 10
menit. Cairan yang dihasilkan dibuang dan endapannya diambil.

3.2.2.2. Ekstraksi DNA dari Inti Sel Hewan


Endapan inti sel ditambah dengan 20 ml NaCl 1 M dingin dan 0,2 ml larutan “sunlight”
10%. Campuran tersebut diaduk dalam baskom berisi es batu hingga mengental.
Kemudian ditambah 0,2 ml kloroform. Disentrifugasi selama 10 menit pada kecepatan
maksimal. Cairan yang didapat dipindah ke dalam erlenmeyer. Ditambahkan etanol
sebanyak 2 kali volume cairan tersebut. Perubahan yang terjadi diamati.

3.2.3. Sel Kultur


3.2.3.1. Isolasi Inti Sel Kultur Bakteri
20 ml kultur bakteri Acetobacter xylinum diambil lalu disentifugasi selama 30 menit.
Endapan dipisahkan, kemudian ke dalam endapan ditambahkan 30 ml larutan sukrosa
0,5 M dingin. Filtrat disentrifugasi selama 30 menit. Cairan yang dihasilkan dibuang
sedangkan endapannya diambil.

3.2.3.2. Isolasi Inti Sel Kultur Yeast


20 ml kultur yeast Saccharomyces cerevisae diambil lalu disentifugasi selama 30 menit.
Endapan dipisahkan, kemudian ke dalam endapan ditambahkan 30 ml larutan sukrosa

9
0,5 M dingin. Filtrat disentrifugasi selama 30 menit. Cairan yang dihasilkan dibuang
sedangkan endapannya diambil.

3.2.3.3. Ekstraksi DNA dari Inti Sel Kultur


Endapan inti sel ditambah dengan 20 ml NaCl 1 M dingin dan 0,2 ml larutan “sunlight”
10 %. Campuran tersebut diaduk dalam baskom berisi es batu hingga mengental.
Kemudian ditambah 0,2 ml kloroform. Disentrifugasi selama 10 menit pada kecepatan
maksimal. Cairan yang didapat dipindah ke dalam erlenmeyer. Ditambahkan etanol
sebanyak 2 kali volume cairan tersebut. Perubahan yang terjadi diamati.

10
4. HASIL PENGAMATAN

Kelompok Bahan Gambar DNA Warna Bentuk Jumlah


1 Sel Tumbuhan +++ Titik dan serabut ++++
(Kecambah kacang
hijau)

2 Sel Tumbuhan ++ Serabut +++++


(Kecambah kacang
hijau)

3 Sel Hewan +++++ Titik dan serabut ++


(Hati sapi)

4 Sel Hewan ++++ Serabut ++


(Hati sapi)

5 Bakteri + Titik dan serabut +


(Acetobacter
xylinum)

6 Bakteri + Titik dan serabut +


(Acetobacter
xylinum)

7 Yeast +++ Titik dan serabut ++


(Sacharomyces
cereviseae)

Keterangan warna:
+ = bening sekali

11
++ = bening
+++ = agak keruh
++++ = keruh
++++ + = keruh sekali
Keterangan jumlah:
+ = sedikit sekali
++ = sedikit
+++ = agak banyak
++++ = banyak
++++ + = banyak sekali

Pada kelompok 1 dan 2 dilakukan percobaan dengan bahan sel tumbuhan yaitu kecambah
kacang hijau. DNA yang telah diisolasi kelompok 1 mempunyai warna yang agak keruh
pada larutan, berbentuk titik dan serabut, dengan jumlah yang banyak. Sedangkan pada
kelompok 2 DNA yang telah diisolasi berwarna bening pada larutannya, berbentuk
serabut, dan mempunyai jumlah yang sangat banyak. Pada kelompok 3 dan 4 dilakukan
percobaan dengan bahan sel hewan yaitu hati sapi. DNA yang telah diisolasi kelompok 3
mempunyai warna yang sangat keruh pada larutannya, berbentuk titik dan serabut,
dengan jumlah yang sedikit. Sedangkan pada kelompok 4 DNA yang telah diisolasi
mempunyai larutan yang berwarna keruh, berbentuk serabut, dan mempunyai jumlah
yang sedikit. Pada kelompok 5 dan 6 dilakukan percobaan dengan bahan berupa kultur
bakteri yaitu Acetobacter xylinum. DNA yang telah diisolasi kelompok 5 mempunyai
warna larutan yang sangat bening, berbentuk titik dan serabut, dengan jumlah yang
sangat sedikit. Sedangkan pada kelompok 6 DNA yang telah diisolasi berwarna sangat
bening, berbentuk titik dan serabut, dan mempunyai jumlah yang sangat sedikit. Pada
kelompok 7 digunakan kultur yeast yaitu Saccharomyces cereviseae. DNA yang telah
diisolasi berbentuk titik dan serabut dengan jumlah yang sedikit. Warna larutan pun agak
keruh.

12
5. PEMBAHASAN

Percobaan yang dilakukan diatas merupakan percobaan isolasi DNA dari sel tumbuhan
yang diambil dari kecambah kacang hijau, DNA sel hewan yang diambil dari hati sapi,
dan DNA kultur yeast dan bakteri yang diambil dari Acetobacter xylinum dan
Saccharomyces cerevisae. DNA sendiri merupakan asam nukleat yang mengandung
materi genetik dan berfungsi untuk mengatur perkembangan biologis seluruh bentuk
kehidupan secara seluler (Klug & Cummings, 1994). Dengan mengisolasi DNA dari
berbagai macam sel tersebut praktikan dapat mengetahui bentuk DNA dari berbagai
macam sel.

DNA biasanya terdapat pada nukleus, mitokondria dan kloroplas. DNA yang terdapat
pada nukleus berbentuk linear dan berasosiasi sangat erat dengan protein histon. DNA
yang terdapat pada mitokondria dan kloroplas berbentuk sirkular dan tidak berasosiasi
dengan protein histon. Dilihat dari organismenya, struktur DNA prokariot berbeda
dengan struktur DNA eukariot. DNA prokariot tidak memiliki protein histon dan
berbentuk sirkular, sedangkan DNA eukariot berbentuk linear dan memiliki protein
histon (Klug & Cummings, 1994). Setelah dilakukan isolasi DNA, pada DNA sel tidak
terdeteksi bentuk DNA secara jelas, hanya berupa serabut dan titik. Sehingga tidak dapat
diketahui asal dan jenis DNA (prokariot atau eukariot).

Proses isolasi DNA melalui beberapa tahap, antara lain :


1. Isolasi jaringan yang diinginkan.
Jaringan merupakan bagian dari makhluk hidup yang merupakan gabungan dari banyak
sel. Pada tahap ini jaringan yang digunakan adalah bagian kecambah dari tanaman
kacang hijau, bagian hati dari sapi, kultur bakteri dari Acetobacter xylinum, dan kultur
yeast dari Saccharomyces cerevisae. Pengisolasian jaringan hanya dilakukan dengan
menghancurkan bahan dan penambahan sukrosa dingin.
2. Dinding dan membran sel dilisiskan
Proses ini digunakan untuk mendapatkan inti sel yang nantinya akan menghasilkan DNA
yang diperoleh dari dalam sel. Proses ini menggunakan larutan pelisis yang merupakan

13
larutan hipotonis. Karena larutan tersebut hipotonis, maka akan terjadi hemolisis. Setelah
jaringan diisolasi, cairan dan endapan dipisahkan dengan sentrifugasi. Endapan yang
terbentuk adalah inti sel.
3. Diekstraksi dalam larutan
Setelah dilakukan inkubasi, inti sel yang telah bercampur dengan larutan pelisis (larutan
sukrosa 1 M dingin) tersebut disentrifugasi selama 10 menit dengan kecepatan 2500 rpm.
Selanjutnya supernatan yang terbentuk dibuang dan kemudian dilakukan ekstraksi di
dalam larutan. Hal tersebut bertujuan agar didapat ekstrak nukleusnya.
4. Dipurifikasi
Tahap ini bertujuan untuk membersihkan jaringan dari zat-zat lainnya. Larutan yang
digunakan adalah NaCl 1 M dingin yang mendenaturasi protein sehingga larutan lebih
murni.
5. Dipresipitasi
Tahap terakhir ini, bertujuan untuk mengendapkan protein histon, sehingga untai-untai
DNA tidak lagi menggulung (coiling) dan berikatan dengan protein histon, yang
menyebabkan DNA menjadi terlihat. Untuk menguraikan DNA digunakan larutan
“sunlight” 10%. Supernatan yang berisi DNA kemudian dituangkan ke dalam tabung
berisi isopropanol dingin dan tabung dibolak-balik dengan gerakan angka 8. Pemberian
isopropanol bertujuan untuk visualisasi DNA. Larutan isopropanol yang digunakan dalam
praktikum ini adalah khloroform. Selanjutnya tabung disentrifugasi kembali selama 5
menit dengan kecepatan 3000 rpm. Hasil dari sentrifugasi adalah terdapatnya pelet DNA
pada dasar tabung yang kemudian ditambahkan etanol 70% dan dibolak-balik kembali.
Pemberian etanol bertujuan untuk membersihkan DNA dari pengotor-pengotornya.
Setelah tercampur, tabung kemudian disentrifugasi kembali selama 5 menit dengan
kecepatan 3000 rpm. Hasil akhirnya adalah DNA yang berada pada tepi dasar tabung.
Langkah akhirnya adalah dengan pemberian Tris-EDTA yang bertujuan untuk
melarutkan kembali DNA untuk dipreservasi (Harley, 2005).

Dalam praktikum, dilakukan penyaringan ekstrak hati ayam dan ekstrak kecambah
kacang hijau. Menurut Zanta (2006), penyaringan tersebut dimaksudkan untuk
menghilangkan debris, seperti membran sel, protein yang mengendap, potongan-

14
potongan bahan yang tidak dapat dihancurkan seluruhnya dalam blender. Molekul DNA
yang larut air akan dapat melewati saringan. Selain itu, dalam praktikum digunakan pula
larutan “Sunlight” 10 %. Penambahan larutan sabun ini bertujuan untuk memecah lapisan
lemak bilayer dari membran sel dan nukleus. Larutan sabun tersebut juga mengandung
EDTA (ethylene diamine tetraacetic acid), yang mengikat kation seperti Mg2+. Kation
bertindak sebagai kofaktor yang membantu enzim bekerja. Salah satu enzim yang
berperan ialah nuklease, yaitu dengan menguraikan DNA. Kutub positif dari NaCl (Na+)
mengarah ke DNA yang bersifat negatif. Hal ini menimbulkan shield di sekitar molekul
DNA dan menyebabkannya berkumpul (coalesce). Hal ini membuat DNA dapat
terpresipitasi ketika ditambahkan alkohol. Selain itu, garam juga menyebabkan protein
terdenaturasi (Kimball, 1992).

Dalam ekstraksi DNA, ditambahkan pula NaCl. Garam ini memiliki fungsi untuk
memberikan kondisi ionik, sehingga reaksi berjalan lebih stabil. Penambahan kloroform
berfungsi untuk memvisualisasikan DNA dan menetralkan (desalted) sebab kloroform
tidak memiliki muatan, sedangkan DNA bermuatan negatif (-). Kemudian tabung
dibolak-balik untuk mendapatkan DNA) (Anonim, 2006).

Dalam percobaan ini dilakukan berulang kali proses sentrifugasi. Proses tersebut
merupakan proses fraksinasi sel yaitu upaya untuk memisahkan bagian sel dan dapat
mengambil organel yang diingini. Tujuan dilakukannya proses tersebut yaitu untuk
mendapatkan molekul DNA terpisah dari molekul – molekul zat yang lainnya (isolasi
DNA). Sentrifugasi sendiri memiliki pengertian yaitu pemusingan dengan kecepatan
tertentu terhadap homogenat. Adapun tahapan-tahapannya dibedakan berdasarkan tingkat
kecepatan yang digunakan, misal kecepatan 800g, kecepatan 1000g, kecepatan 10.000g,
dan sebagainya (Muslim, 2003).

Prinsip utama sentrifugasi adalah memisahkan substansi berdasarkan berat jenis molekul
dengan cara memberikan gaya sentrifugal sehingga substansi yang lebih berat akan
berada di dasar, sedangkan substansi yang lebih ringan akan terletak di atas (Anonim,

15
2006). Proses ultrasentrifugasi adalah pemusingan dengan kecepatan yang amat tinggi
terhadap homogenat. Biasanya ultrasentrifugasi dilakukan secara bertahap, yaitu:
• Sentrifugasi pada kecepatan 800 g untuk memisahkan bahan dari komponen
makro. Supernatan atau cairan dipisahkan dari debre yang mengendap. Pada
kecepatan 800 g sampai 1000 g, inti sel akan mengendap. Ini adalah sentrifugasi
tahap pertama.
• Sentrifugasi bertahap, berturut-turut pada kecepatan yang berbeda (misal 20000 g,
100000 g dan 150000 g). Terhadap supernatan di atas kemudian dilakukan
sentrifugasi dengan kecepatan berbeda-beda secara bertahap yang bertujuan untuk
mendapatkan organel atau zat metabolik yang sedang diamati. Hasil isolasi organel
biasanya diperoleh dari sentrifugasi dengan kecepatan tertentu sebagai berikut:
- Pada kecepatan 20000 g sampai 30000 g organel mitokondria, kloroplas, lisosom
dan mikrobodi akan mengendap sebagai pelet.
- Pada kecepatan 50000 g sampai 80000 g retikulum endoplasma akan mengendap.
- Pada kecepatan 80000 g sampai 100000 g, retikulum endoplasma halus akan
mengendap.
- Adapun partikel kecil ribosom bebas dan partikel virus akan mengendap pada
kecepatan sentrifugasi 150000 sampai 300000 g.

Setelah melalui beberapa tahapan isolasi DNA, melalui hasil pengamatan dapat diketahui
bahwa DNA yang terbentuk adalah berbentuk titik dan serabut. Pada kelompok 1 dan 2
dengan bahan sel tumbuhan yaitu kecambah kacang hijau mempunyai bentuk titik dan
serabut, dengan jumlah yang banyak pada kelompok 1 dan berbentuk serabut, dengan
jumlah yang sangat banyak pada kelompok 2. Pada kelompok 3 dan 4 dengan bahan sel
hewan yaitu hati sapi didapati DNA yang berbentuk titik dan serabut, dengan jumlah
yang sedikit pada kelompok 3. Sedangkan pada kelompok 4 DNA yang telah diisolasi
berbentuk serabut, dan mempunyai jumlah yang sedikit. Pada kelompok 5 dan 6 dengan
bahan kultur bakteri yaitu Acetobacter xylinum hasil isolasi DNA mempunyai bentuk titik
dan serabut, dengan jumlah yang sangat sedikit pada kelompok 5. Sedangkan pada
kelompok 6 DNA yang telah diisolasi berbentuk titik dan serabut, dan mempunyai
jumlah yang sangat sedikit. Pada kelompok 7 digunakan kultur yeast yaitu

16
Saccharomyces cereviseae dengan bentuk DNA berupa titik dan serabut dengan jumlah
yang sedikit.

DNA tersebut dapat terlihat jika diterawang dibawah sinar lampu. DNA yang terbentuk
pada sel tumbuhan terdapat dalam jumlah yang banyak. Hal tersebut disebabkan karena
sebagian besar hewan dan tumbuhan adalah eukaryotik yaitu terdiri atas banyak sel,
sehingga molekul DNA yang dihasilkan juga sangat banyak (Kunihiro, 1987). Pada hasil
dari DNA sel hewan didapati jumlah DNA yang sedikit. Hal ini dapat terjadi karena
kesalahan praktikan pada saat pengambilan supernatan. Cairan yang terbuang bersama
supernatan akan mengurangi jumlah DNA pada hasil akhir. Teori Kunihiro juga
dikuatkan oleh Wirahadikusumah (1989), yaitu sel eukaryotik mengandung beberapa
kromosom dan mempunyai banyak molekul DNA dengan berat molekul yang sangat
besar.

Dengan menggunakan bahan yang berbeda, yaitu sel tumbuhan, sel kultur dan sel hewan,
dapat terlihat adanya perbedaan dalam jumlah. Dan secara keseluruhan DNA ini terlihat
berupa titik dan serabut yang terlihat di bawah sinar lampu dan berpendar dibanding
larutan sekelilingnya dan ada juga yang berbentuk seperti benang. Menurut Muslim
(2003), molekul DNA yang terbentuk berbeda–beda untuk tiap bahan dikarenakan pada
spesies yang berbeda jumlah kromosom yang dimiliki juga berbeda.

Pada hasil pengamatan, tampak adanya gumpalan putih kecil. Gumpalan kecil inilah yang
merupakan DNA. DNA dapat terlihat sebagai gumpalan karena merupakan kumpulan
dari ribuan molekul DNA. DNA yang terlihat berada dalam bentuk bergerombol karena
adanya shield di sekitar DNA akibat kation Na+ yang menuju ke DNA. Hal ini terjadi
akibat ketidaklarutannya dalam alkohol. Akibatnya, ketika DNA kontak dengan alkohol,
molekul DNA akan terpresipitasi dalam alkohol dan dapat terlihat secara visual. DNA
murni sebenarnya tidak berwarna. Warna yang tampak saat pengamatan berasal dari
pigmen bahan yang diekstrak DNA nya (Zanta, 2006). Oleh karena itu pada kelompok 1
dan 2 yang menggunakan bahan sel tumbuhan yaitu kecambah kacang hijau warna yang
didapat berturut-turut adalah bening dan agak keruh. Pada kelompok 3 dan 4 yang

17
menggunakan bahan sel hewan yaitu hati sapi, mempunyai warna yang sangat keruh dan
keruh pada kelompok 4. Pada kelompok 5 dan 6 yang menggunakan bahan berupa kultur
bakteri yaitu Acetobacter xylinum warna larutan yang sangat bening. Sedangkan pada
kelompok 7 digunakan kultur yeast yaitu Saccharomyces cereviseae yang berwarna
keruh.

18
6. KESIMPULAN

• DNA (Deoxyribonucleic acid) merupakan informasi genetik utama pada sel hidup
dan organisme.
• DNA berfungsi sebagai penyimpan dan pengorganisir informasi genetik total
dalam sel.
• DNA terdapat pada nukleus, kloroplas dan mitokondria.
• Tiap spesies memiliki jumlah kromosom dan berat molekul DNA yang berbeda-
beda.
• Sebuah sel memiliki DNA yang merupakan materi genetik dan bersifat herediter
pada seluruh sistem kehidupan.
• DNA pada nukleus berbentuk linear dan berikatan dengan protein histon (sama
dengan DNA pada organisme eukariot) sedangkan DNA pada kloroplas dan
mitokondria berbentuk sirkuler dan tidak berikatan dengan protein histon (sama
dengan DNA pada organisme prokariot).
• Tahap isolasi DNA adalah : isolasi jaringan, dinding atau membran sel
dihancurkan (lisis), ekstraksi dalam larutan, tahap purifikasi dan terakhir adalah
presipitasi.
• Fraksinasi sel adalah upaya untuk memisahkan sel sehingga diperoleh organel
yang diingini.
• Ekstraksi DNA dilakukan berdasarkan prinsip sentrifugasi dan presipitasi.
• Proses sentrifugasi dilakukan untuk memusingkan homogenat dengan kecepatan
tertentu sehingga diperoleh molekul DNA yang terpisah dari molekul lain.
• Sentrifugasi dilakukan untuk memisahkan substansi berdasarkan berat jenis
molekul dengan cara memberikan gaya sentrifugal, sehingga substansi yang lebih
berat akan berada di dasar, sedangkan substansi yang lebih ringan akan terletak di
atas.
• Ekstraksi DNA akan dihasilkan terdapat pada lapisan atas yang ditambahkan
ethanol, karena DNA tidak larut pada ethanol.
• DNA yang tampak adalah berupa titik-titik yang berwarna putih.

19
• Bila didiamkan beberapa saat maka titik-titik itu dapat membentuk untai (double
helix).
• Larutan sukrosa dingin berfungsi melisiskan membran sel.
• Larutan pencuci piring yang mengandung EDTA (ethylene diamine tetraacetic
acid) berfungsi memecah ikatan lapisan lemak bilayer dari membran sel dan
nukleus.
• Kation dari garam NaCl mengarah ke kutub negatif DNA dan menyebabkan
terkumpulnya DNA dan terpresipitasi saat ditambah dengan alkohol.
• Penambahan ethanol dimaksudkan untuk membantu mendeteksi adanya DNA.
• Perbedaan DNA sel hewan dan tumbuhan dengan sel kultur adalah banyaknya
jumlah DNA pada sel hewan dan tumbuhan
• Warna pada larutan DNA tergantung pada bahan yang digunakan dalam isolasi
DNA

Praktikan Asisten dosen:


- Ayu
- Hendri

Victoria Eduarty Mahu


08.70.0140

20
7. DAFTAR PUSTAKA

Anonim. (2006). Isolasi DNA. http://id.wikipedia.org/wiki/Isolasi_DNA.

Choirul. (2003). Biologi Molekuler Sel. Jurusan Biologi Universitas. Bengkulu.

Harley, J.T. (2005). Regulatory exercises in microbiology. 6th ed. McGraw-Hill


Company, Boston: xiv + 466 hlm.

Kimball, J.W. (1992). Biologi jilid 1 edisi 5. Erlangga. Jakarta.

Klug, W.S. & M.R. Cummings. (1994). Concepts of genetics. Prentice-Hall Inc.,
Englewood Cliffs: xvi + 779 hlm.

Kunihiro, Matsuda. (1987). Bioteknologi PT Elex Media Komputindu. Gramedia. Jakarta

Lewis, R. (2003). Human genetics: Concepts and applications. The McGraw-Hills


Company, Inc., Boston: xviii + 454 hlm.

Mazmur, L. (1961). A Procedure for the Isolation of DNA from Microorganism. Journal
of Molecular Biology. www.ncbe.reading.as.uk/NCBE/Protocols?PDF/PeaDNA.pdf

Muslim, C. (2003). Biologi Molekuler Sel. Jurusan Biologi Universitas Bengkulu.


Bengkulu.

Skarger A. G, Basel C. H. 2001. Safety Consideration DNA in Foods. ILSI Press.


Washington DC, USA.

Wirahadikusumah, M. (1989). Biokimia : Protein, Enzim, dan Asam Nukleat. ITB.


Bandung.

Zanta, C. A. (2006). Biotechnology in a Lunchbox: Extract DNA from fruit & make a
smoothie!!! UIUC-Hughes Biotechnology Education and Outreach Program. Activity
modified from lowa State University Biotechnology Center.
http://www.life.uiuc.edu/hughes/footlocker/Activities/Fruit_DNA.pdf

21
8. LAMPIRAN

8.1. Laporan Sementara


8.2. Jurnal
8.3. Review Jurnal

22