LAPORAN PRAKTIKUM

BIOTEKNOLOGI FARMASI

“ISOLASI DNA KROMOSOM DAN DNA PLASMID DARI BAKTERI SERTA

ANALISIS DNA KROMOSOM DAN PLASMID MENGGUNAKAN ELEKTROFORESIS
AGAROSA”

Disusun oleh:
Lintang Qonita Fardliana
182210101016

LABORATORIUM BIOTEKNOLOGI FARMASI

BAGIAN BIOLOGI FARMASI FAKULTAS FARMASI
UNIVERSITAS JEMBER
2020
 BAB I
PENDAHULUAN
1.1 Latar Belakang
Isolasi DNA bakteri merupakan pemisahan molekul DNA dari sel bakteri. Isolasi yang
dilakukan pada praktikum kli ini menggunakan metode cair (solution based method). Secara
umum tahapan isolasi DNA meliputi pemecahan dinding sel, ektraksi DNA, dan presipitasi
dan purifikasi asam nukleat. Pengenalan isolasi DNA penting dipelajari untuk bidang biologi
molekular.
Polymerase Chain Reaction (PCR) merupakan alat yang dapat menunjang proses isolasi
DNA. PCR merupakan teknik untuk mengamplifikasi DNA dalam jumlah kecil melalui proses
enzimatik secara in vitro. Penggandaan yang dilakukan PCR bertujuan untuk memperbanyak
jumlah DNA agar dalam isolasi dapat diperoleh DNA dalam jumlah besar.
Elektroforesis dapat dilakukan dengan gel agarosa dan gel poliakrilamid. Namun pada
praktikum kali ini menggunakan gel agarosa. Elektroforesis ini dilakukan untuk pemisahan
fragmen DNA dari molekul DNA terbesar ke molekul terkecil. Pemisahan ini dilakukan dalam
medan listrik dari kutub negatf ke kutub positif. Hal ini dilakukan karena DNA bermuatan
negatif.

1.2 Tujuan praktikum

 Mahasiswa mampu melakukan isolasi DNA kromosom bakteri
 Mahasiswa mengetahui dan mampu mengisolasi DNA plasmid rekombinan Pet dari
bakteri E.coli
 Mahasiswa mampu menganalisis DNA plasmid menggunakan elektroforesis agarosa
 Mahasiswa mampu menentukan ukuran DNA plasmid hasil restriksi
 BAB II
TINJAUAN PUSTAKA

2.1 Isolasi DNA kromosom dari bakteri

Pada dasarnya sel mengandung dua asam nukleat, yaitu DNA (asam deoksiribosa
nukleat) dan RNA (asam ribonukleat). DNA terbagi menjadi dua yaitu DNA kromosomal dan
ekstra kromosomal seperti DNA mitokondria, kloroplas dan plasmid. DNA kromosomal pada
organisme eukariot terdapat pada inti sel sedangkan DNA kromosomal pada organisme prokariot
terletak pada sitoplasma. DNA (asam deoksiribosa nukleat) termasuk salah satu biomolekul asam
nukleat selain RNA yang penting dalam makhluk hidup khususnya berkaitan dengan fungsi yang
dapat dibawanya dalam mengendalikan karakter makhluk hidup. Karena pentingnya peran DNA
di dalam sebuah sel yaitu sebagai materi genetika, maka isolasi DNA merupakan teknik dasar
yang harus dimiliki untuk mempelajari bioteknologi molecular. DNA kromosom memiliki
ukuran yang besar (>0,5 Mb) dibandingkan dengan DNA plasmid (+ 2 kb).
Untuk mengisolasi DNA kromosom bakteri perlu dilakukan beberapa langkah, yaitu
menumbuhkan bakteri dan pemanenan bakteri untuk mendapatkan sel yang cukup, pemecahan
dinding sel bakteri yang dilanjutkan dengan pemisahan DNA kromosom dari komponen sel
lainnya. Pemecahan dinding sel dapat dilakukan dengan dua cara, yaitu secara fisik dan kimia.
Sel dapat dipecah dengan menggunakan kekuatan mekanik seperti freeze thaw, bead mill
homogenization, atau resonansi misalnya metode sonikasi. Sedangkan secara kimia sel dapat
dirusak dengan buffer lisis berisi senyawa kimia (lisosim, EDTA, Tris HCL, atau detergen
sodium duodecyl sulfat (SDS) yang dapat merusak integritas barrier dinding sel. Selanjutnya,
pemisahan DNA dapat dilakukan dengan sentrifugasi.
Pada praktikum ini, isolasi DNA genom dilakukan dengan menggunakan metode cair
(solution based method). Secara umum tahapan isolasi DNA meliputi pemecahan dinding sel,
ektraksi DNA, dan presipitasi dan purifikasi asam nukleat. Pemecahan dinding sel jaringan dapat
dilakukan dengan cara fisik maupun kimia. Pemecahan sel secara fisik dapat dilakukan dengan
kekuatan mekanik atau resonansi, sedangkan pemecahan secara kimia dapat dilakukan dengan
menggunakan lisozim, Tris HCL, EDTA, dan detergen seperti SDS.
Pada tahap ekstraksi, DNA dipisahkan dari pengotornya menggunakan campuran
fenol:kloroform:isolamil alcohol (25:24:1). DNA yang terdapat pada fraksi air selanjutnya
dipresipitasi menggunakan etanol dingin. DNA yang diperoleh setelah dikeringkan dilarutkan ke
dalam buffer TE dan disimpan -200C.
2.2 Isolasi DNA plasmid dari bakteri
Plasmid merupakan materi genetic ektstra kromosomal yang memiliki kemampuan untuk
melakukan replikasi secara otonom. Ukuran plasmid sangat bervariasi (1 kb-200 kb). Berbeda
dengan DNA genom, DNA plasmid biasanya berbentuk sirkular dan terdapat bebas di dalam
sitoplasma bakteri. Pada satu sel bakteri dapat ditemukan lebih dari satu plasmid dengan ukuran
yang sangat bervariasi. Pada teknologi DNA rekombinan, plasmid digunakan sebagai vector
untuk menyisipkan DNA yang diklon, sehingga perlu diperoleh plasmid yang tidak
terkontaminasi dengan kromosom agar diperoleh produk yang diinginkan.
Prinsip isolasi plasmid dari kromosom dan berbagai komponen sel lainnya berdasarkan
pada ukuran dan sifat konformasi yang dimiliki. Plasmid memiliki ukuran yang jauh lebih kecil
dibandingkan kromosom (8% dari DNA kromosom) dan kenyataan bahwa kromosom di sel
terikat dengan membrane sel sehingga dengan melisiskan sel dan sentrifugasi maka plasmid
dapat dipisahkan dari DNA kromosom. Selain itu plasmid di dalam sel memiliki konformasi
yang berbeda dengan kromosom yaitu sirkular, covalently closed circular (CCC) dan linear
dimana pada kondisi basa (Ph 12-12,5), kromosom akan terfragmentasi dan terdenaturasi
sedangkan plasmid terdenaturasi dan tidak terfragmentasi. Dengan penambahan kalium asetat
dan asam asetat sampai netral, DNA kromosom akan membentuk agregat, berupa gumpalan
kusut bersama protein dan RNA. Sedangkan DNA plasmid kembali renaturasi menjadi untai
ganda yang terlarut. Dengan proses sentrifugasi, agregat dan partikel yang tidak larut lainnya
(protein dan RNA) akan mengendap membentuk pelet, sedangkan DNA plasmid terlarut.
Secara umum isolasi plasmid dari biakan bakteri dapat dibagi menjadi 3 tahap yaitu
pembiakan bakteri, pemanenan dan lisis sel bakteri, dan pemurnial plasmid DNA. Pembiakan
bakteri dilakukan dengan mengambil 1 koloni bakteri dan ditanam pada media padat selama 18
jam kemudian dilakukan sub kultur ke dalam media cair hingga diperoleh bakteri yang cukup
banyak untuk dipanen. Proses lisis dapat dilakukan secara fisik, sel dipecah dengan kekuatan
mekanik atau dengan metode kimia, sel diperlakukan dengan penambahan senyawa kimia.
Dengan metode kimia sel bakteri dipecah pada suasana basa (Ph 12-12,5) untuk mendapatkan
plasmid yang tidak terfragmentasi dan dapat larut kembali dengan penambahan asam (kalium
asetat). Pemurnian DNA plasmid dapat dilakukan dengan ekstraksi dengan pelarut organik
(campuran fenol:kloroform: dan isolamil alcohol) atau dengan metode kolom.

2.3 Analisis DNA Kromosom dan Plasmid

Keberadaan DNA plasmid hasil isolasi dapat dianalisis menggunakan elektroforesis,
sedangkan kadar DNA plasmid dengan menggunakan spektrofotometri. Elektroforesis adalah
suatu cara untuk memisahkan fraksi-fraksi suatu zat berdasarkan migrasinya di bawah pengaruh
medan listrik. Migrasi partikel bermuatan tersebut dapat terjadi karena perbedaan ukuran,
muatan, atau sifat kimia molekul. Penggunaan arus listrik pada elektroforesis mengakibatkan
terjadinya panas yang selanjutnya dapat menyebabkan terjadinya difusi molekul yang akan
dipisahkan. Difusi molekul yang akan dipisahkan dapat dicegah dengan menggunakan matriks
penyangga. Ada dua macam matriks penyangga yang umum digunakan dalam elektroforesis
yaitu pati (agarosa) dan poliakrilamid.
Agarosa merupakan polimer D-galaktosa dan 2,4 anhidro L-galaktosa yang diisolasi dari
ganggang laut. Gel agarosa untuk elektroforesis dibuat dengan melelehkan agarosa konsentrasi
tertentu dalam buffer dan didinginkan. Banyaknya agarosa yang digunakan menentukan
kerapatan gel tersebut. Konsentrasi agarosa yang digunakan berbanding terbalik dengan ukuran
DNA atau bentuk struktur DNA (liniear, sirkuler). Semakin pendek ukuran DNA nya maka
konsentrasi gel semakin tinggi. Struktur DNA sirkuler lebih ringan disbanding DNA linear.
Molekul DNA (bermuatan negatif) akan bergerak ke arah anoda saat diberi medan magnet pada
kedua ujung gel. Ukuran DNA, konformasi DNA, konsentrasi agarosa, dan besarnya tegangan
yang digunakan sangat menentukan kecepatan migrasi molekul DNA. DNA dengan ukuran yang
besar akan berjalan lebih lambat di dalam pori-pori gel agarosa.
Keberadaan DNA dalam gel agarosa dapat dideteksi menggunakan senyawa
berfluoresensi, misalnya etidium bromida, akridin oranye, propidium iodide, SYBR Safe.
Senyawa etidium bromide, akridin oranye, propidium iodide, merupakan karsinogen yang perlu
penanganan hati-hati. Senyawa-senyawa tersebut mampu berinterkalasi di antara untai DNA,
saat diberi sinar UV 254 nm, DNA akan mengabsorpsi sinar dan ditransmisikan pada senyawa
pewarna DNA. Sedangkan radiasi pada 302 dan 366 nm akan diserap oleh senyawa pewarna
DNA. Pada kedua keadaan ini, energy dipancarkan pada 590 nm pada daerah jingga-merah.
 BAB III
METODOLOGI
3.1 Waktu dan tempat
Praktikum dilakukan pada hari Rabu, 8 April 2020 bertempat di laboratorium bioteknologi
farmasi universitas jember. Namun karena ada halangan virus corona, maka praktikum dilakukan
secara daring/online di rumah masing-masing.
3.2 Alat dan bahan
- Isolasi DNA kromosom dari bakteri
Alat
-sentrifuge -tabung reaksi - cawan petri
-vortex - lampu Bunsen -sengkelit
-shaker - mikropipet - erlenmeyer
-pemanas air -tip
-freezer - tabung mikrosentrifus 1,5mL
Bahan
-Bakteri E.coli -PCl
-Media LB cair -etanol dingin
-Bufer STE -bufer TE
-Bufer lisozim -air suling steril
-Bufer lisis
- Isolasi DNA plasmid dari bakteri
Alat
-shaker incubator 370C - tabung mikrosentrifus 1,5 mL
-UV Transilluminator -tip biru
-mikropipet -tip kuning
-ose bulat -tip putih
-sentrifus
Bahan
-Bakteri E.coli PET 32b -Solution III
-Medium Luria Bertani -PCl
-ampisilin -bufer TE
-solution I -etanol pa
-solution II -Na asetat
- Analisis DNA kromosom dan plasmid
Alat
-Neraca analitik -Cetakan gel
-erlenmeyer -mesin elektroforesis
-microwave -UV Transilluminator
-mikropipet dan mikrotip
-tabung mikrosentrifus
Bahan
-Loading dye
-ekstrak DNA
-DNA ladder 1 kb
-agarose
-TBE 1x (tris boric EDTA)
-SYBR Safe

3.3 Prosedur
- Isolasi DNA kromosom dari bakteri

Koloni tunggal E.coli diambil dari media LB padat dibiakkan dalam 5 Ml

media LB cair dan inkubasi selama 18 jam suhu 370C dalam incubator
digoyang dengan kecepatan 150 rpm (dikerjakan 1 hari sebelum jadwal
praktikum)

Sebanyak 1 ml biakan bakteri dimasukkan ke dalam tabung mikrosentrifus

1,5 ml dan disnetrifugasi selama 5 menit dengan kecepatan 12.000 rpm,
supernatant dibuang dengan membalikkan tabung dan diletakkan di atas
kertas tisu dengan posisi terbalik.
 Prosedur di atas diulangi 2 kali hingga 3 ml biakan bakteri yang
disentrifugasi, untuk mendapatkan pelet bakteri

Pelet sel yang diperoleh diresuspensi dengan 1 ml larutan STE dengan

cara vortex. Campuran selanjutnya disentrifugasi dengan kecepatan 7500
rpm selama 5 menit

Supernatan dibuang dan pelet sel ditambah dengan 200 µL larutan lisozim
dengan vortex dan diinkubasi suhu 370C selama 1 jam

Campuran ditambahkan dengan 200 µL buffer lisis dan diresuspensi

dengan dibolak-balik (4-6 kali)

Campuran ditambah dengan PCl, diresupensi dengan dibolak-balik (4-6

kali) dan disentrifugasi dengan kecepatan 10.000 rpm

Fase air (bagian atas) diambil dengan pipet yang ujungnya lebar dan
dimasukkan ke dalam tabung mikrosentrifugasi. Diperkirakan volum airnya

Fase air kemudian ditambah dengan Cl (24:1) sama banyak dengan

volume fase air. Campuran diresuspensi dengan dibolak-balik dan
disentrifugasi kecepatan 10.000 rpm suhu 40C selama 10 menit

Fase air diambil dan ditambah dengan Na asetat 0,1 volume fase air dan
etanol absolut 2x volume fase air

Campuran diresuspensi dan diinkubasi suhu -200C selama 2 jam

 Setelah inkubasi 2 jam, campuran disentrifugasi kecepatan 10.000 rpm 40C
selama 10 menit

Supernatan yang dihasilkan dibuang dan ke dalam tabung ditambah

dengan 500 µL etanol 70%, diresuspensi perlahan dan disentrifugasi
kembali dengan kecepatan 10.000 rpm 40C selama 10 menit

Supernatan dibuang, etanol dihilangkan dengan dikeringanginkan. DNA

yang diperoleh dilarutkan ke dalam 50 µL buffer TE

Isolasi DNA Plasmid dari bakteri

1. Pembiakan dan pemanenan bakteri

Koloni tunggal E.coli Pet 30b diambil dari media LB padat dibiakkan dalam
5 ml media LB cair yang telah diberi kanamisin (konsentrasi akhir 25 µg/ml)
dan inkubasi selama 18 jam suhu 370C dan incubator digoyang dengan
kecepatan 150 rpm

Sebanyak 1,5 ml biakan bakteri dimasukkan ke dalam tabung

mikrosentrifus 1,5 ml dan disentrifugasi selama 2 menit dengan kecepatan
12.000 rpm, supernatant dibuang dengan membalikkan tabung dan
diletakkan di atas kertas tisu dengan posisi terbalik

Prosedur diatas diulangi 2 kali hingga 4,5 ml biakan bakteri yang

disentrifugasi, untuk mendapatkan pelet sel bakteri

1. Isolasi plasmid

Pelet sel diresuspensi dengan 100µL solution I dengan cara memipet naik
turun beberapa kali hingga benar-benar tersuspensi (jika perlu divortex)

Solution II (fress solution/rp) ditambahkan sebanyak 200 µL,

dihomogenkan dengan cara membolak-balikkan tube secara perlahan
selama 6-8 kali, kemudian didiamkan selama 5 menit hingga lisat jernih.
Jangan divortex
 Solution III sebanyak 150 µL dihomogenkan dengan cara membolak-
balikkan tube secara perlahan (6-8 kali). Jangan divortex simpan dalam es
selama 5 menit

Campuran disentrifugasi 12.000 rpm selama 5 menit 40C. diulangi

sentrifugasi jika supernatan tidak jernih

Supernatant dipindahkan ke tabung mikrosentrifus baru (hati-hati jangan

sampai ada endapan yang terikut)

Tambahkan PCl sama banyak dengan volume supernatant, kemudian

vortex 3 menit dan disentrifus 12.000 rpm selama 10 menit

Lapisan atas diambil dimasukkan pada tabung mikrosentrifus baru dan

ditambahkan etanol pa dan 3M Na asetat dengan perbandingan (2,5:0,1)
dari volume supernatant. Diamkan pada freezer -200C selama 1 jam untuk
mempresipitasi plasmid

Setelah 1 jam presipitasi, tabung mikrosemtrifus disentrifugasi 12.000 rpm.

1 menit suhu 40C.

Supernatan dibuang dan pelet dicuci dengan 1 mL etanol 70% kemudian

disentrifus kembali dengan kecepatan 12.000 rpm selama 5 menit pada
suhu 40C

Pelet dikeringkan dan diresuspensi dalam 20 µL buffer TE dan disimpan

pada suhu 40C untuk analisis selanjutnya
- Elektroforesis agarosa

Agarosa ditimbang 0,4 g dan dilarutkan dalam 40 ml buffer TBE 1x dengan

cara pemanasan sampai semua agarosa larut sehingga diperoleh gel
agarosa 1% kemudian tambahkan 1 µL SYBR Safe. Larutan didiamkan
hingga suhu + 600C.

Cetakan/ tray agarosa disiapkan dengan menutup sisi berlubang cetakan

dengan selotip dan menempatkan sisir elektroforesis untuk membentuk
sumur

Larutan agarosa dituang ke dalam cetakan dan dibiarkan hingga memadat

Setelah gel memadat, penutup cetakan dan sisir dilepaskan, kemudian

cetakan ditempatkan dalam tangki elektroforesis yang berisi buffer TBE 1x

Sampel 5 µL hasil isolasi (DNA genom/DNA plasmid) yang telah dicampur

dengan 2 µL loading buffer (6x) dimasukkan ke dalam salah satu sumur
dan 6 µL marka DNA 1 kb ke dalam sumur lainnya

Elektroforesis dijalankan pada 80 V, 400 mA selama 60 menit

Gel hasil elektroforesis diamati di bawah sinar UV

 BAB IV
HASIL PENGAMATAN
1. Berikut hasil Elektroforesis Agarosa dari DNA plasmid yang diisolasi dari 4 koloni
transforman bakteri yang berbeda dan DNA Genom/kromosom yang diisolasi dari
bakteri X.

1. Plsmid dari transforman 1

2. Plasmid dar transforman 2
3. DNA Kromosom
4. Plasmid dari transforman 3
M : Marka DNA 1 Kb

Kesimpulan :
Analisis kualitatif elektroforesis untuk mendapatkan hasil segmen DNA berdasarkan tolak
ukur panjang pita. Analisis kualitatif elektroforesis merupakan usaha mendapatkan segmen DNA
dari pemisahan untai ganda, yang ditunjukkan untuk mendapatkan hasil berupa ada tidaknya
campuran selain DNA yang ada apakah hasilnya clear atau smear. Hasil elektroforesis
menunjukkan adanya garis pita yang panjang dan pendek.
Semakin panjang jarak garis pita yang terbentuk pada gel agarosa dengan sumur, maka
panjang DNA tersebut semakin pendek. Sedangkan semakin pendek jarak garis pita yang
terbentuk pada gel agarosa dengan sumur, maka panjang DNA tersebut semakin panjang.
Molekul yang lebih besar akan bergerak lebih lambat. Jarak migrasi DNA pada gel adalah laju
terbalik proporsional log-10 dari jumlah pasangan basa. Maka:

 Pada hasil tersebut isolate 1,2, dan 4 memiliki jarak garis pita yang panjang maka
panjang isolat tersebut pendek. Dapat disimpulkan bahwa isolate 1,2,dan 4 adalah
DNA plasmid yang memiliki ukuran lebih pendek daripada DNA kromosom.
Sedangkan isolate 3 menunjukkan jarak garis pita yang pendek maka ukuran isolate
tersebut panjang. Isolat 3 adalah DNA kromosom
 DNA pada isolat 1,2, dan 4 memiliki berat yang lebih kecil karena terbukti memiliki
jarak migrasi yang panjang. Sedangkan isolate 3 memiliki berat yang lebih besar
karena terbukti jarak migrasi yang pendek. Isolate 1,2, dan 4 adalah DNA plasmid
berukuran lebih kecil dibandingkan dengan isolate 3 yang merupakan DNA
kromosom.

2. Berikut Elektroforegram plasmid yang direstriksi dengan enzim restriksi tertentu.

Tentukan ukuran dari pita a, b dan c dalam pb (pasangan basa)

M Marka DNA 1 Kb

1. Plasmid utuh
2. Plasmid diporong dengan enzim
restriksi MluI
3. Plasmid dipotong dg enzim retriksi
NdeI dan XhoI
4. Plasmid dipotong dengan enzim
XhoI
 Marka Log pb (x) Jarak migrasi Jarak migrasi
marka sampel
10000 4 1,5 cm 1. Pita A =
8000 3,903 1,65 cm 2,2 cm
6000 3,778 1,9 cm 2. Pita B=3,45
5000 3,699 2 cm cm
4000 3,602 2,2 cm 3. Pita C = 1,7
3000 3,477 2,45 cm cm
2600 3,415 2,65 cm
2000 3,301 3 cm
1600 3,204 3,45 cm
1000 3 4,1 cm
750 2,875 4,6 cm

Persamaan regresi
y=12,239-2,748x
 Pita A
Y =12,239-2,748x
2,2 =12,239-2,748x
2,2-12,239 =-2,748x
-10,039 =-2,748x
Log x = 3,653
X =4497 pb
 Pita B
Y =12,239-2,748x
3,45 =12,239-2,748x
3,45-12,239 =-2,748x
-8,789 =-2,748x
 Log x = 3,198
X =1577 pb
 Pita C
Y =12,239-2,748x
1,7 =12,239-2,748x
1,7-12,239 =-2,748x
-10,539 =-2,748x
Log x = 3,835
X =6839 pb
 BAB V
PEMBAHASAN

5.1 Isolasi DNA Kromosom Bakteri

Isolasi DNA memiliki beberapa tahapan yaitu 1). Isolasi sel, 2).Lisis dinding dan membrane
sel, 3). Ekstraksi dalam larutan, 4). Purifikasi, 5). Presipitasi. Prinsip-prinsip dalam melakukan
isolasi DNA ada 2 yaitu sentrifugasi dan presipitasi. Prinsip utama sentrifugasi adalah memisahkan
substansi berdasarkan berat jenis molekul dengan cara memberikan gaya sentrifugal sehingga
substansi yang lebih berat berada di dasar sedangkan substansi yang lebih ringan terletak di atas.
Teknik sentrifugasi tersebut dilakukan di dalam sebuah mesin yang bernama sentrifuge dengan
kecepatan yang bervariasi. Pada praktikum kali ini digunakan kecepatan 12.000 rpm.
Setelah disentrifuge didapatkan pelet (hasil dari pemisahan berat molekul oleh gaya
sentrifugal) disuspensikan kembali dan timbahkan EDTA yang berfungsi sebagai pengkelat
magnesium kalsium yang berperan dalam menjaga stabilitas membran plasma serta menghambat
DNAse sehingga molekul DNA tidak terdenaturasi.
SDS berfungsi untuk mendenaturasi protein yang ada dalam lisat, dengan jalan
memutuskan ikatan-katan non kovalen (terutama ikatan hidrogen) pada protein, sehingga kembali
ke struktur primernya, sebagai rantai linier polipeptida sehingga dapat melarutkan protein pada
membran sel darah putih. SDS yang merupakan sejenis deterjen dapat digunakan untuk merusak
membran sel. Larutan EDTA berfungsi melindungi DNA dari aktivitas DNAse sehingga DNA
tidak rusak dan digunakan untuk perusak sel dengan cara mengikat magnesium. Ion ini berfungsi
untuk mempertahankan integritas sel maupun mempertahankan aktivitas enzim nuklease yang
merusak asam nukleat pada isolasi DNA plasmid. Tahap lysis tetap menggunakan pelet hasil
sentrifuge pada tahap sebelumnya. Pellet ini diresuspensikan ke dalam buffer lisis yang terdiri dari:
SDS untuk menghancurkan membran sel dan denaturasi protein, enzim lisosim menghancurkan
dinding sel bakteri, lalu campuran tersebut dihomogenkan menggunakan vortex agar pemutusan
ikatan-ikatan peptida tersebut lebih cepat terjadi. Selanjutnya suspensi diinkubasi pada suhu 37oC
selamat 1 jam. Hal tersebut bertujuan untuk mengoptimalkan kerja enzim yang sangat dipengaruhi
oleh suhu. Lisozim ditambahkan guna untuk perusakan atau pembuangan dinding sel yang telah
dilisiskan oleh EDTA. Presipitasi menggunakan fenol atau pelarut organik seperti kloroform
berguna untuk menghilangkan sisa protein (Triwibowo,2005).
 Kemudian dilanjutkan pada ekstraksi DNA dengan tujuan agar didapat ekstrak dari
nukleus. DNA yang telah diekstraksi dari dalam sel selanjutnya perlu dipisahkan dari kontaminan
komponen penyusun sel lainnya seperti polisakarida dan protein agar DNA yang didapatkan
memiliki kemurnian yang tinggi. Campuran fenol:kloroform:isolamil alcohol (25:24:1) digunakan
sebagai pendenaturasi protein, ekstraksi dengan menggunakan campuran tersebut menyebabkan
protein kehilangan kelarutannya dan mengalami presipitasi yang selanjutnya dapat dipisahkan dari
DNA melalui sentrifugasi (Suharsono,2006). Kemudian dilakukan penambahan etanol absolut
berguna untuk mengendapkan kromosom karena perbedaan polaritas, etanol yang ditambahkan
harus dingin agar lebih banyak lagi DNA kromosom yang mengendap. Kromosom yang
didapatkan berupa pellet ditambahkan bufer TE.

5.2 Isolasi DNA Plasmid Bakteri

DNA plasmid mempunyai ukuran yang jauh lebih kecil daripada DNA kromosom. Untuk
memisahkan DNA plasmid, maka memerlukan perlakuan yang sedikit berbeda dengan prosedur
isolasi DNA kromosom. Setelah proses kultur bakteri di sentrifuge 14000-16000 rpm yang
kemudian dibuang supernatannya. Setelah itu pada tahapan resuspensi ditambahkan solution yang
bersifat basa untuk memisahkan DNA plasmid dari DNA kromosomal.
Pemurnian atau isolasi DNA plasmid menggunakan ini menggunakan metode pemurnian
berdasarkan konformasi DNA (dengan denaturasi alkali). Kebanyakan DNA plasmid berada dalam
sel sebagai molekul yang sangat berlilitan (supercoiled) atau disebut covalently closed circular
(CCC) DNA. DNA kromosom jauh lebih longgar ikatan kedua untainya. Molekul supercoiled ini
jauh lebih tahan terhadap denaturasi apabila dibandingkan dengan DNA kromosom dan dapat
dipisahkan dengan dua cara yaitu: denaturasi dengan alkali, dan pemurnian berdasarkan kerapatan
apung (bouyant density) atau dikenal dengan istilah equilibrium density gradient centrifugation
atau sentrifugasi isopiknik (Sudjadi,2008).
Lisis sel dalam isolasi DNA plasmid digunakan solution II yang berisi NaOH dan SDS.
Pada pH 12-12,5 ikatan hidrogen dari DNA kromosom non supercoiled akan terdenaturasi, heliks
ganda terurai dan kedua rantai polipeptida memisah. (Sudjadi,2008). Fungsi dari beberapa
senyawa yang ditambahkan pada isolasi DNA plasmid adalah sebagai berikut:
 1. EDTA : Thrometamine ethylenediamine tetraacetic acid: sebagai kofaktor yang
esensial bagi aktivitas Dnase dalam mencacah molekul DNA. Menginaktivasi enzim
DNAse yang dapat mendenaturasi DNA yang di isolasi.
2. SDS : Sodium dodesil sulfat : Mendenaturasi protein yang ada dalam lisat, dengan jalan
memutuskan ikatan-katan non kovalen (terutama ikatan hidrogen) pada protein,
sehingga kembali ke struktur primernya, sebagai rantai linier polipeptida.
3. NaOH (sodium hidroksida) : Pemisahan DNA plasmid dari DNA kromosomal.
4. Tris HCL: Thrometamine HCL: Buffer menjaga pH, melindungi isi sel agar tidak lisis.
5. Glukosa: berfungsi menjaga tekanan osmotik sel agar tidak pecah.
6. PCl (Phenol : Chloroform : Isoamilalkohol) : Memisahkan kandungan lipid, protein
dari DNA, menghilangkan kontaminan yg masih melekat.
7. Potasium asetat: menyesuaikan kondisi yang tepat bagi enzim agar bekerja secara
maksimal dan menjaga keseimbanagan sel agar tidak lisis.
8. Asam asetat : Menetralkan suasana basa yang diciptakan oleh solution II yang
diberikan pada tahap lisis sebelumnya.
9. Ethanol absolut 70 % : memurnikan DNA
Hasil isolasi DNA yang didapat dari percobaan ini adalah seperti benang-benang halus
yang berwarna putih. Benang-benang tersebut merupakan kumpulan DNA yang berbentuk
kromatin. Kromatin terdiri dari sejumlah molekul DNA yang beruntai ganda yang sangat panjang
dan massa protein dasar yang agak kecil serta hampir sama besarnya yang dinamakan histon
disamping protein non histon dalam jumlah yang lebih sedikit (sebagian diantaranya bersifat asam
dan berukuran lebih besar daripada histon) dan sejumlah kecil RNA. Heliks DNA berantai ganda
dalam setiap kromosom memiliki panjang yang besarnya ribuan kali diameter nukleus sel. Salah
satu tujuan molekul ini, khususnya histon adalah untuk memadatkan DNA.
Presipitasi adalah sentrifuge supernatan beserta campurannya dengan kecepatan 12.000 rpm
selama 5 menit. Hasil yang diperoleh adalah pelet yang mengandung DNA plasmid dan
supernatan yang mengandung larutan potassium asetat dan ethanol absolut. Sehingga, yang
diambil pada tahap ini adalah bagian pellet dan yang dibuang adalah bagian supernatan.
5.3 Elektroforesis agarosa
Elektroforesis gel didasarkan pada pergerakan molekul bermuatan dalam media penyangga
matriks stabil di bawah pengaruh medan listrik. Media yang umum digunakan adalah gel agarosa
dan poliakrilamid. Elektroforesis gel agarosa digunakan untuk memisahkan fragmen DNA yang
berukuran lebih besar dari 100 bp dan dijalankan secara horizontal, sedangkan elektroforesis
poliakrilamid dapat memisahkan 1 bp dan dijalankan secara vertical. Elektroforesis poliakrilamid
biasanya digunakan untuk menentukan urutan DNA atau sekuensing. (Gaffar,2007).
Elektroforesis adalah suatu teknik yang mengukur laju perpindahan atau pergerakan
partikel-partikel bermuatan dalam suatu medan listrik. Prinsip kerja dari elektroforesis berdasarkan
pergerakan partikel-partikel bermuatan negatif (DNA) yang bergerak menuju kutub positif
(anode). Elektroforesis digunakan untuk mengamati hasil amplifikasi dari DNA. Hasil
elektroforesis yang terlihat adalah terbentuknya band yang merupakan fragmen DNA hasil
amplifikasi dan menunjukkan potongan-potongan jumlah pasangan basanya (Carson, 2006).
Elektroforesis digunakan dengan tujuan untuk mengetahui ukuran dan bentuk suatu partikel
baik DNA, RNA dan protein. Selain itu, elektroforesis juga digunakan untuk fraksionasi yang
dapat digunakan untuk mengisolasi masing-masing komponen dari campurannya, mempelajari
fitogenetika, kekerabatan dan mempelajari penyakit yang diturunkan. Elektroforesis dalam bidang
genetika, digunakan untuk mengetahui ukuran dan jumlah basa yang dikandung suatu sekuen DNA
tertentu (Sambrook dan Russel, 2001).
Teknik elektroforesis mempergunakan medium yang terbuat dari gel. Perpindahan partikel
pada medium gel tersebut diperngaruhi oleh factor-faktor seperti ukuran partikel, komposisi dan
konsentrasi gel, densitas muatan, kuat medan listrik dan sebagainya. Semakin kecil partikel
tersebut, maka pergerakan atau migrasinya akan semakin cepat, karena matriks gel mengandung
jaringan kompleks berupa pori-pori sehingga partikel-partikel tersebut dapat bergerak melalui
matriks tersebut. (Muladno, 2010)
DNA dicampurkan dengan laoding dye sebelum proses elektroforesis. Loading dye terdiri
dari glycerol, bromphenol blue, dan xylene cyanol FF. Glycerol berfungsi sebagai pemberat
sehingga DNA berada di bawah sumuran, sedangkan bromphenol blue dan xylene cyanol FF
berfungsi sebagai visualisasi pada gel sehingga proses migrasi DNA pada saat berlangsungnya
elektroforesis tidak melebihi batas gel (Carson, 2006).Sumur-sumur dalam gel agarosa berfungsi
untuk meletakkan larutan DNA yang bermuatan negatif. Arus listrik dialirkan dengan
menggunakan larutan buffer yang sesuai, maka DNA akan bergerak menuju kutub positif. Laju
migrasi DNA dalam medan listrik berbanding terbalik dengan massa DNA. Migrasi DNA terutama
ditentukan oleh ukuran panjang dan bentuk DNA. Fragmen DNA yang berukuran kecil akan
bermigrasi lebih cepat dibanding yang berukuran besar, sehingga elektroforesis mampu
memisahkan fragmen DNA berdasarkan ukuran panjangnya. Kecepatan migrasi ditentukan oleh
beberapa factor diantaranya:
1. Migras molekul DNA berukuran besar lebih lambat daripada migrasi molekul berukuran
kecil
2. Migrasi molekul DNA pada gel berkonsentrasi lebih rendah lebih cepat daripada migrasi
moleul DNA yang sama pada gel berkonsentrasi tinggi. Oleh karena itu penentuan
konsentrasi agarosa dalam membuat gel harus memperhatikan ukuran molekul DNA
yang akan dianalisis.
3. Konformasi atau bentuk rangkaian molekul DNA berukuran sama akan bermigrasi
dengan kecepatan yang berbeda
4. Kecepatan migrasi DNA sebanding dengan tingginya voltase yang digunakan. Akan
tetapi apabila penggunaan voltas dinaikkan, mobilitas molekul DNA meningkat secara
tajam. Ini mengakibatkan pemisahan molekul DNA di dalam gel menurun dengan
meningkatnya voltase yang digunakan. Penggunaan voltase yang ideal untuk
mendapatkan separasi molekul DNA berukuran lebih besar 2 kb adalah tidak lebih dari
5 volt per cm
5. Keberadaan etidium bromide dalam gel mengakibatkan pengurangan tingkat kecepatan
migrasi molekul DNA linier sebesar 15%
6. Apabila tidak ada kekuatan ion di dalam larutan maka aliran listrik akan sangat minimal
dan migrasi DNA sangat lambat. Sementara larutan buffer berkekuatan ion tinggi akan
meningkatkan panas, sehingga aliran listrik menjadi sangat maksimal. Ada kemungkinan
gel akan meleleh dan DNA dapat mengalami denaturasi.
Visualisa maka ditambahkan larutan etidium bromide yang akan masuk di antara ikatan hydrogen
pada DNA, sehingga pita fragmen DNA akan terlihat di bawah lampu UV (Gaffar, 2007). Larutan
etidium bromide sangat berbahaya dan bersifat karsinogen. Semua larutan yang mengandung
etidium bromide harus didekontaminasi sebelum dibualng (Muladno, 2010). Bahaya yang
ditimbulkan oleh etidium bromida dapat dihindari dengan menggunakan larutan SYBR Safe
sebagai penggantinya. Menurut Sambrook dan Russel (2001) pewarna SYBR safe membuat DNA
berpendar di bawah sinar UV. Pita DNA yang berpendar pada gel agarosa menunjukkan hasil
positif bahwa terdapat DNA pada setiap lajur.
 BAB VI
PENUTUP
6.1 Kesimpulan
Prinsip utama dalam isolasi DNA ada tiga yakni penghancuran (lisis), ektraksi atau
pemisahan DNA dari bahan padat seperti selulosa dan protein, serta pemurnian DNA. Pada
praktikum kali ini digunakan metode cair (solution based method) untuk isolasi DNA kromosom
dari bakteri. Sedangkan untuk isolasi DNA plasmid E.coli digunakan metode alkali lisis. Analisis
DNA menggunakan elektroforesis dengan matriks penyangga pati (agarosa).
6.2 Saran
Sebaiknya ada asisten dalam praktikum ini yang membantu menjelaskan bagaimana
mekanisme praktikum supaya praktikan lebih mengerti dan paham akan materi yang sedang
dikerjakan. Dikarenakan keterbatasan untuk work at home menyebabkan praktikum ini tidak dapat
berjalan sebagaimana mestinya.
 DAFTAR PUSTAKA

Carson, Susan & Robertson, Dominique. 2006. Manipulation and Expression of Recombinant
DNA, 2nd Edition. USA: Elsevier Academic Press
Gaffar, Shabarni. 2007. Buku Ajar Bioteknologi Molekul. Bandung: Jurusan kimia, FMIPA
UNPAD
Muladno. 2010. Teknologi Rekayasa Genetika, Edisi kedua. Bogor: IPB Press
Sambrook, J., dan Russel, D. W. 2001. Molecular Cloning, A Laboratory Manual 3rd edition.
New York: Cold Spring Harbor Laboraotory Press
Suhartono, Putra. 1999. Biologi Molekular Kedokteran, editor: Suhartono Taat Putra. Surabaya:
Airlangga University Press
Triwibowo, Y. 2005. Biologi Molekular. jakarta: Erlangga.