LAPORAN PRAKTIKUM KIMIA FISIKA INSTRUMEN DAN BIOKIMIA

High Performed Liquid Chromatography (HPLC)

Tanggal Praktikum :12 Oktober 2017

Tanggal pengumpulan :19 Oktober 2017

Disusun oleh :

Putu Chandra Maheswari

10715025

Kelompok: L-2

Nama Asisten : Aryo Dimas Pamungkas

LABORATORIUM KIMIA FISIKA

PROGRAM STUDI SAINS DAN TEKNOLOGI FARMASI

SEKOLAH FARMASI

INSTITUT TEKNOLOGI BANDUNG

2017
I. Tujuan
a. Menentukan peak area dari kafein dan parasetamol (standard)
b. Menentukan persamaan kurva kalibrasi dari peak area vs konsentrasi untuk
setiap kafein dan parasetamol standard
c. Menentukan rata-rata, standar deviasi dan % koefisien variasi dari konsentrasi
sampel yang diuji
II. Cara Kerja
Larutan standar kafein dan parasetamol disiapkan dalam 5 konsentrasi standar
yaitu 5g/mL, 10 g/mL, 15 g/mL, 20 g/mL dan 25 g/mL dari larutan stok kafein
dan parasetamol

Diencerkan dengan pelarut yang digunakan pada HPLC

Diukur standard dan sampel dengan sistem HPLC sebagai berikut

Kolom :C-18
Detektor :UV
Panjang Gelombang :272 nm
Flow rate :0,8 mL/mom
Fase Gerak:Air distilasi : methanol (60 : 40)

Diinjeksikan masing-masing larutan standar parasetamol dan kafein ke dalam

sistem HPLC

Didapatkan kromatogram dan dicatat waktu retensi dan nilai dari AUC

Diinjeksikan masing-masing 5 larutan standar kafein-parasetamol murni ke dalam

sistem HPLC

Didapatkan kromatogram, dicatat waktu retensi dan nilai dari AUC

 Diinjeksi sampel ke dalam sistem HPLC dan diulangi tiga kali

Didapatkan kromatogram, dicatat waktu retensi dan nilai dari AUC

Seluruh standard dan sampel harus difiltrasi terlebih dahulu pada membran 0,45
µm sebelum diinjeksikan ke sistem HPLC

Dibuat kurva kalibrasi dari nilai AUC (y) vs Konsentrasi (x) dari 5 larutan standar
parasetamol-kafein

Dibuat regresi dan dicari persamaan regeresinya pada kurva kalibrasi

Dimasukkan nilai AUC sampel pada persamaan regeresi untuk mendapatkan nilai
konsentrasi dari sampel

III. Perhitungan dan Pengolahan Data

3.1 Tabel Data Pengamatan Standar

Standar Konsentrasi AUC Waktu Retensi

Parasetamol 25 ppm 883517 3,036 menit
Kafein 25 ppm 2930851 4,49 menit

3.2 Tabel Data Pengamatan Standar Campuran dan Sampel

Konsentrasi Waktu Retensi AUC Waktu Retensi AUC Kafein
Parasetamol Parasetamol Kafein
(menit) (menit)
5 ppm 3,04 148838 4,48 345840
10 ppm 3,0433 351552 4,4933 726573
15 ppm 3,0433 512919 4,4933 1202814
20 ppm 3,0467 648644 4,49 1548031
25 ppm 3,0467 962483 4,4933 1958038
 3.3 Tabel Data Pengamatan pada Sampel

Injeksi Parasetamol Kafein

ke Waktu retensi AUC Waktu retensi AUC
(menit) (menit)
1 3,0867 784847 4,5367 1859035
2 3,0567 780547 4,5067 1835020
3 3,05 798849 4,4900 1863806

3.4 Kurva Kalibrasi Parasetamol dan Kafein

3.5 Perhitungan Sampel

3.5.1 Perhintungan sampel parasetamol
a. AUC Injeksi parasetamol 1 : 784847
 y = 38488x - 52427
784847 =192438x – 52427
x =21,75 ppm
b. AUC injeksi Parasetamol 2:780547
y = 38488x – 52427
780547 =38488x-52427
x =21,642 ppm

c. AUC Injeksi Parasetamol 3:798849

y = 38488x – 52427
798849 =38488x – 52427
x =22,11 ppm
 Rata-rata =21,834 ppm
 Standar devias i =0,244
 % Koefisien variasi =1,117%
| |
 Galat =

=2,96 %

3.5.2 Perhitungan Sampel Kafein

y=80917x-57497
a. AUC Injeksi Kafein 1 :1859035
y =80917x-57497
1859035 =80917x-57497
x =23,685 ppm

b. AUC Injeksi Kafein 2:1835020

y =80917x-57497
1835020 =80917x-57497
x =23,38 ppm
c. AUC Injeksi Kafein 3:1863806
y =80917x-57497
 1863806 =80917x-57497
x =23,744 ppm

Rata-rata =23,603 ppm

Standar deviasi =0,194

% Koefisien variasi =0,8%

| |
Galat =

=4,902 %

IV. Pembahasan

Kromatografi adalah suatu teknik pemisahan senyawa campuran dan kromatografi

dengan cairan sebagai fase gerak dan digunakan untuk pemisahan senyawa yang larut
dalam fase gerak . Kromatografi cairan jika dibedakan berdasarkan metode pemisahan
solut atau zat terlarut adalah adsorption chromatograpy yaitu pemisahan berdasarkan
adsorpsi , partition chromatography yaitu pemisahan solut berdasarkan partitioning
antara fase gerak cairan dan fase diam cairan yang dilapisi padatan , ion-exchange
chromatography yaitu pemisahan solut berdasarkan adsorpsi pada support yang
mengandung muatan yang diketahui pada permukaannya. Muatan dengan konsentrasi
tinggi ditambahkan pada fase gerak untuk elusi analit pada kolom, affinity
chromatography yaitu pemisahan berdasarkan penggunaan molekul biologi yang tidak
bergerak sebagai fase diam, dan size-exclusion chromatography yaitu pemisahan
berdasarkan perbedaan ukuran molekul.

Dalam kromatografi cairan terdapat Low Performance Liquid Chromatography

(LPLC) dan High Performance Liquid Chromatography(HPLC) dengan prinsip
pemisahan berdasarkan polaritas dan hidrofobisitas. Perbedaan pada LPLC dan HPLC
adalah pada efisiensi atau performanya dengan HPLC lebih sensitif, spesifik dan efisien
dalam memisahkan senyawa. Pada LPLC digunakan support material yang besar dan
tidak rigid, efisiensi rendah, large plate heights memiliki karakteristik kromatogram yang
memiliki puncak yang lebar, limit deteksi yang rendah, waktu pemisahan yang lama
karena digunakan kolom dengan tekanan yang rendah yang hanya mengandalkan gaya
gravitasi. Sedangkan pada HPLC menggunakan support material yang kecil,tidak
seragam, dan rigid yaitu partikel dengan ukuran diameter <40 µm, biasanya partikel
dengan ukuran 3-10 µm, memiliki efisiensi sistem yang baik, small plate heights,
kemudian memilki karakterisitik puncak yang sempit, limit deteksi yang rendah, waktu
pemisahan yang pendek, kolom dapat digunakan tekanan yang tinggi dan flow rates yang
cepat. Sistem operasi tekanan tiggi diperlukan untuk fase gerak maka digunakan pompa
khusus dan komponen sistem yang lain contohnya adalah menggunakan closed system
dengan terdapat injection valve. Deteksi pada HPLC juga menggunakan flow-through
detector. Saat ini performa dari HPLC ditingkatkan melalui instrumen bernama Ultra
Performance Liquid Chromatography (UPLC) yaitu suatu alat yang memilki prinsip yang
sama dengan HPLC, namun dengan performa yang lebih baik. UPLC memilki
keunggulan dalam lebih cepat, lebih sensitif, dan memilki resolusi yang lebih baik. UPLC
dapat diaplikasikan untuk partikel dengan ukuran diameter <2 µm sehingga didapatkan
resolusi yang lebih baik dari HPLC. Kemudian digunaakn tekanan yang sangat tinggi
yaitu sampai 100M Pa. Jika dibaut menjadi tabel maka dapat dilihat perbedaan sebagai
berikut

Karakteristik HPLC UPLC

Ukuran partikel 3-5 µm < 2 µm
Tekanan maksimum 300-400 bars 1000 bars
Kolom Anlitikal C18 UPLC BEH C18
Dimensi Kolom 150 x 3,2mm 50 x 2,1 mm
Kolom Injeksi 5 µL 2 µL
Suhu Kolom 30 0C 65 0 C
Total run time 10 menit 1,5 menit
Resolusi USP 3,2 3,4
Plate count 2000 7500
Flow rate 3 mL/menit 0,6 mL/menit
 Diagram bagan dari apparatus pada HPLC

Komponen instrumen HPLC dapat diterangkan sebagai berikut

a. Sistem pelarut
Aparatus digunakan dengan 1 atau lebih glass atau steel solvent reservoirs.
Pelarut dapat dipanaskan atau diaduk, atau reservoir pelarut yang terdapat lubang
masuk untuk gas inert untuk degassing. Degassing adalah proses penghilangan gas
pada fasa gerak. Proses penghilangan gas menjadi penting karena jika terdapat gas
yang memilki kandungan oksigen dan nitrogen maka akan menambah jumlah gas
terlarut dan mengganggu sistem pompa yang akan mengalirkan fase gerak ke kolom
dan detektor yang akan menyebarkan cahaya pada detektor UV-vis, fluoresens dan
refractive index detektor sehingga menyebabkan noise dalam kromatogram.
Degassing dalam sistem HPLC dapat dilakukan dengan helium purging yaitu
menghilangkan 80% udara yang terlarut. Untuk fase gerak pada organik-aqueous
digunakan volume yang sama dari helium untuk membersihkan hingga bersih.
Kecepatan untuk menyuplai helium dapat dikurangi setelah beberapa waktu dengan
excessive purging dapat menyebabkan kehilangan komponen volatil pada fase gerak
 lebih banyak. Lalu degassing dengan cara vacuum degassing yang dapat
menghilangkan 60 % udara terlarut.
b. Pompa
Pompa pada HPLC terdiri dari satu atau beberapa pompa. Pompa akan
menggerakakan fase gerak ke kolom. Pompa menggunakan tekanan sebesar 6000 psi
untuk membuat fase gerak bergerak pada kecepatan 0,1-10 mL/min. Melalui kolom
yang panjang dan sempit dengan partikel yang berukuran kecil dan seragam. Tekanan
terjadi sebelum sampel diinjeksikan. Faktor yang mempengaruhi tekanan dari pompa
adalah kecepatan mengalir, viskositas fase gerak dan ukuran partikel dari fase diam.
Pada pemisahan dapat digunakan satu pelarut atau campuran pelarut dengan
komposisi yang tetap yang disebut elusi isokratik. Kemudian dapat juga digunakan
pelarut dengan jumlah dua atau lebih pelarut yang sangat berbeda dalam polaritas.
Saat elusi dimulai, maka perbandingan pelarut akan bervariasi dalam sistem
terprogram, kadang-kadang secara kontinyu dan kadang-kadang dalam beberapa
tahap. Efisiensi pemisahan sangat meningkat dengan elusi gradien.
Pemilihan menggunakan elusi isokratik atau gradien didasarkan jika akan
dilakukan pemisahan pada 2 senyawa dengan polaritas yang tidak jauh berbeda,
gradient baseline mencegah adanya bekas analisis maka dapat digunakan elusi
isokratik (P,Schellinger Adam dan W.Carr,Peter ,2006). Sedangkan jika untuk tujuan
menganalisis ketidakmurnian, senyawa yang memiliki campuran yang berbeda-beda
atau menganalisis sediaan herbal yang terdiri dari beberapa komponen dnegan
polaritas yang berbeda, maka digunakan elusi gradien.
c. Sample Introduction
Pada sample introduction yang merupakan tempat untuk memasukkan sampel
maka dapat digunakan valve type injectors, contohnya six port fixed volume Rheodyne
dengan volume injeksi yang reprodusibel, variable loop size, mudah digunakan dan
reliabel, dan six port variable volume waters dengan volume injeksi yang variabel
without loop change increased maintenance, namun dibutuhkan skill operator yang
tinggi. Kemudian auto injectors atau auto sampler dengan injeksi secara kontinyu
tanpa menggunakan operator, memilki presisi dan akurasi yang comparable dengan
manual, memiliki harga lebih mahal, dapat digunakan untuk menganalisis 100 sampel
dan standar dengan kontrol pada mikroprossesor.

d. Kolom
 Kolom HPLC biasanya dikonstruksi dari tubing yang terbuat dari stainless
steel. Fitting dan plug harus inert dan tidak mengurangi homogenitas dari aliran.
Kolom analisis panjangnya berkisar dari 10 sampai 150 cm. Diameter dalam
bervariasi dari 1-20 mm.
e. Fase diam
Fase diam adalah tempat di mana terjadi pemisahan dan merupakan bagian
yang penting dari HPLC. Fase diam yang terdpat pada HPLC adalah:
 Gel Silika
Gel silika disiapkan dalam kondisi hidrolisis yang terkontrol dengan
polimerisasi dari tetraethoxysilane dalam bentuk emulsi sehingga menaikkan
sampai microspheres dari diameter yang tidak seragam pada ukuran 2-5 µm.
Sol-gel dibentuk dalam proses sehingga ukuran partikel dapat tejadi dengan
baik dan didapatkan diameter dari mikrometer yang kecil. Material yang
digunakan harus terbebas dari ion logam. Partikel pada silika gel yang
didapatkan harus dalam bentuk yang tidak seragam untuk menghindari
terjadinya jalur lain pada kolom. Gel silika adalah material yang polar yang
bekerja berdasarkan adsorpsi dan suatu fenomena yang mengakibatkan
akumulasi dari senyawa yang memisahkan antara fase gerak dan diam.
 Bonded Silica

Bonded silika terbentuk dari reaksi antara alkylchlorosilanes dengan silika

gel dengan adanya agen alkaline. Sehingga didapatkan fase RP-
8(dimethyloctadecyilane groups),RP-18 atau ODS
(dimethyloctadecusilane groups). Prosedur ini mengubah kira0kira
setengah grup silanol ke grup terikat. Reaksi semakin lengkap dengan
chlorotrimethylsilane(CISIMe3) atau
hexamethyldisilane(Me3SiNHSiMe3)

f. Fase Gerak
Fase gerak pada HPLC merupakan cairan yaitu suatu pelarut yang digunakan untuk
melarutkan senyawa. Interaksi antara fase gerak dan fase diam terjadi berdasarkan
tiga tipe yaitu ikatan ionik, ukuran molekul dan interaksi polar. Pada interaksi polar
dapat terjadi dua hal yaitu :
 Fasa Normal
 Fasa yang terjadi jika fase diam lebih polar daripada fase gerak maka fase gerak lebih
hidrofob dibandingkan dengan fasa diam
 Fase Balik
Fase yang terjadi jika fase gerak lebih polar daripada fase diam, sehingga fase diam
meka fase diam lebih hidrofob dibandingkan dengan fase gerak

g. Detektor
Detektor yang digunakan pada HPLC diguanakn untuk medeteksi hasil pemisahan
sehingga dapat terbentuk kromatogram. Pada kromatogram akan ada waktu retensi
yaitu waktu yang dibutuhkan solut dari awal kolom sampai ke detektor dan terbentuk
Area Under Curve (AUC). Detektor yang digunaka pada HPLC biasanya tertulis pada
alat contohnya HPLC-UV-Vis maka pada sistem HPLC tersebut menggunakan
detektor UV-Vis. Jenis-jenis detektor yang terdapat pada HPLC adalah
a. Detektor spektrofotometrik
Detektor yang digunakan adalah UV, VIS, PDA yang merupakan detektor
absorbansi . Detektor ini mudah untuk digunakan dan memiliki stabilitas yang
baik. Mekanisme kerja detektor UV adalah ketika sinar UV dialirkan ke flow cell,
maka sampel akan menyerap sinar UV. Jaid intensitas sinar UV yang diserap oleh
fase gerak dan eluen akan berbeda. Dengan mengukur perbedaan maka jumlah
sampel yang terukur dapat ditentukan. Jika menggunakan detektor VIS maka
digunakan panjang gelombang yang lebih besar (400-700 nm). PDA mendeteksi
seluruh spektrum secara simultan dan dengan penambahan 3D (panjang
gelombang).
b. Refractive Index Detector
Prinsip kerja detektor RI adalah mengukur perubahan pada refracive index.
Detektor RI memiliki sensitivitas lebh rendah dibandingkan dengan detektor UV,
maka dari itu detektor RI jarang digunakan. Namun detektor RI memilki
keunggulan dapat mendeteksi seluruh senyawa terutama yang tidak memilki
spektrum absorbsi UV contohnya alkohol dan molekul organik. Kemudian
terdapat hubungan antara intensitas dengan konsentrasi analit.
c. Detektor spektrofluorsensi
Detektor spektrofluoresensi adalah detektor yang sensitif dan selektif. Beberapa
senyawa dapat befluoresensi yaitu pada panjang gelombang tertentu dapat
menyerap energi untuk bereksitasi kemudian mengemisikan energi tersebut dan
kembali ke keadaan ground state (fluoresensi). Intensitas fluoresensi sebanding
dengan konsentrasi dari analit. Untuk senyawa yang tidak dapat berfluoresensi
maka dapat ditambahkan derivat fluoresensi pada pre-atau post- column.
d. Detektor Mass spechtometer
Detektor ini adalah detektor yang berdasarkan berat molekul. Lebih sensitif
dibandung spektrofotometrik, spektrofluoresensi, dan detektor RI. Detektor ini
dapat digunakan untuk identifikasi struktur, kuantifikasi limit deteksi yang rendah
dari komponen elemental dan molekular. Liquid Chromatography- Mass
spechtometer (LC-MS) adalah teknik dengan menggunakan electrospray
ionisation (ESI) dengan simple dan robust interface. Apilkasinya dapat digunakan
untuk berbagai macam molekul biologi. Kemudian penggunaan tandem MS dan
isotop yang stabil membuat sensitivitas yang lebih tinggi dan akurat. Kemudian
kecepatan scanning yang cepat membuat high degree multiplexing dan banyak
senyawa dapat diukur dalam single analytical run.

Jenis detektor lain yang dapat digunakan adalah Evaporative Light Scattering
Detector(ELSD) yang memilki sensitivitas yang baik untuk analit yang non-
volatil dan dapat digunakan untuk metode gradien, Multi-Angle Light Scattering
Detector yaitu menentukan berat molekul tanpa menggunakan kurva kalibrasi dan
bernilai absolut dengan low detection limit. Lalu ada Detektor Konduktivitas yaitu
untuk komponen ionik yang akan mengalirkan energi listrik. Jadi nilai yang
diukur adalah hambatan dan linear dengan konsnetrasi ion yang terdapat pada
larutan. Kemudian Detektor Chemiluminance yang prinsinya sama dengan
Detektor pada fluoresensi perbedaannya adalah sumber cahaya ekstasi yang
digunakan berasal dari reaksi kimia dan memiliki sensitivitas lebih tinggi detektor
fluoresensi, Detektor Optical Rotation yag spesifik untuk mengukur isomer optik .
Dengan kolom memisahkan isomer optis R- dan L-, Detektor Elektrokimia yang
berdasarkan amperometri, coulometri, polarography dan konduktometri. Detektor
ini memberikan sensitivitas yang tinggi, sederhana, kenyamanan dan aplikasi yang
luas. Penggunaan pada semi-micro atau sistem tipe kapiler.
Sebelum dilakukan pengukuran dengan HPLC perlu dilakukan adanya
perhitungan nilai UKSS(Uji Kesesuaian Sitem-Sistem) sehingga data analisis
yang didapatkan handal untuk untuk dipakai dalam menyimpulkan suatu hasil
pengujian. Parameter nilai UKSS yang perlu dilakukan adalah
a. Keterberulangan penyuntikan (RSD)
Caranya adalah dengan cara penyuntikan berulang larutan analit dan
dinyatakan dalam simpangan baku relatif (SBR) yang dapat dihitung dari
persamaan berikut:

Dengan

= nilai rata-rata hasil pengukuran dan nilai hasil pengukuran individual

xi =jika digunakan baku dalam maka nilainya adalah yaitu luas

kromatogram baku pembanding dan baku dalam dan jika digunakan balu luar
maka nilai xi adalah nilai yaitu luas kromatogram baku pembanding.
Nilai yang dapat diterima adalah jika tidka lebih dari 1% untuk bahan baku
obat, tidak lebih dari 2% untuk sediaan obat dan tidak lebih dari 5% untuk
cemaran atau hasil degradasi.
b. Daya pemisahan atau Resolusi (Rs)
Daya pemisahan adalah ukuran daya pisah dari dua kromatogram yang terelusi
berdekatan dari dua komponen yang terdapat dalam larutan yang harus
terpisahkan sehingga dapat digunakan untuk analsis kuantitatif secara akurat.
Rumus untuk perhitungan daya pemisahan (Rs) adalah sebagai berikut:

Keterangan:
tR1dan tR2=waktu retensi kromatrogam pertama dan kedua
w1dan w2=lebar kromatogram pertama dan kedua yang diukur dengan cara
ekstrapolasi sisi puncak yang lurus terhadap garis alas kromatogram
Jika nilai Rs> 1,5 maka menunjukkan pemisahan yang baik.

c. Efisiensi Kolom
Efisiensi kolom adalah jumlah lempeng teoritis per meter (N) yang merupakan
ukuran ketajaman kromatrogram. Kinerja kolom yang berubah ditunjukkan dari
lebar kromatogram yang berbeda pada analisis berulang sehingga memberikan
 nilai efisiensi kolom yang berbeda. Efisiensi kolom (N) dapat dihitung dengan
persamaan berikut:
N=16(tR/w)2=L/HETP
Dengan tR= waktu retensi
L =panjang kolom
w=Lebar kromatogram
HETP =tinggi lempeng teoritis setara, jika HETP> 1000/M maka
dianggap cukup memadai untuk analisis
d. Faktor ikutan atau Kesimetrisan (Tf)
Suatu ukuran kesimetrisam suatu kromatogram dihitung dengan persaman
sebagai berikut:
Tf = W0,05/2f
Dengan
W0,05 = lebar kromatrogram pada 5 % tinggi
f =jarak maksimum kromatrogram sampai tepi kromatrogram diukur
pada titik dengan ketinggian 5% dari tinggi kromatrogram terhadap garis alas
kromatrogram
Kecermatan kromatrogram akan berkurang jika faktor ikutan bertambahn. Maka
nilai Tf yang masih dapat diterima adalah lebih kecil dari 2,0.

e. Faktor kapasitas (k’)

Kemampuan senyawa tertentu berinteraksi dengan sistem kromatografi dan
menentukan retensi dari senyawa terlarut. Faktor ini adalah perbandingan waktu
atau jumlah senyawa dalam fasa diam dan fasa gerak. Faktor kapasitas (k’) dapat
dihitung dengan persaman berikut:
k’=(tR/ tN)-1=(tR/ tN)/ tN
Keterangan:
tR=waktu retensi senyawa
tN=waktu retensi senyawa yang tidak diretensi oleh kolom

Nilai k’ yang baik harus diantara 1-10, sebab jika kurang dari 1 elusi sangat cepat
sehingga senyawa yang diretensi kolom sangat sedikit dan jika lebih dari 10 maka
waktu elusi sangat lama dan tidak berguna untuk analisis.
 f. Faktor Selektivitas (α)
Cara menghitung dengan persamaan berikut
α =K2/K1=k’2/k’1 = tR2-tn/(tR1-tn)
Keterangan:
K2/K1= koefisien partisi dari senyawa kedua yang lebih kuat direteni oleh kolom
k’2,k’1, tR2, tR1= waktu retensi senyawa kedua dan pertama
tn= waktu retensi senyawa yang tidak diretensi oleh kolom
Faktor selektivitas yang baik adalah kurang dari 2

Analisis HPLC dapat digunakan untuk analisis kuantitatif dan kualitatif. Pada
analisis kuantitatif maka digunakan AUC dari kromatogram yang dihasilkan, maka
dengan menggunakan kurva kalibrasi AUC (y) vs konsentrasi (x) dapat diketahui
konsentrasi dari larutan sampel. Selain itu untuk keperluan kuantitatif dapat
digunakan standar adisi, standar eksternal, atau standar internal. Jika menganalisis
dengan kualitatif yaitu identifikasi dapat digunakan waktu retensi yang dihasilkan dari
puncak-puncak gelombang pada kromatogram kemudian dibandingkan dengan waktu
retensi pada kromatogram standar.

Pembahasan prosedur

Prosedur yang dilakukan pertama adalah menginjeksikan larutan standar parasetamol

dan kafein ke dalam injektor untuk diketahui waktu retensi sehingga jika pada larutan
standar terdapat dua puncak gelombang dapat diketahui mana yang merupakan puncak
untuk parasetamol dan kafein dan waktu retensinya. Kemudian diukur waktu retensi dan
AUC pada 5 larutan standar dengan konsentrasi 5 ppm, 10 ppm, 15 ppm, 20 ppm, 25 ppm
dan dibuat kurva kalibrasi dan didapatkan persamaan regresi untuk kurva kalibrasi
parasetamol dan kafein. Lalu dinjeksikan sampel sebanyak tiga kali untuk didapatkan
nilai AUC dan waktu retensi. Lalu berdasarkan hubungan antara AUC vs konsentasi
didapatkan konsentrasi sampel.

Setiap akan menginjeksikan sampel syringe perlu dibilas dengan aquades dan dibilas
dengan larutan yang akan dianalisis. Kemudian larutan yang akan dianalisis harus sudah
dalam keadaan tersaring sehingga tidak terdapat gangguan partikel, kemudian tidak boleh
terdapat gelembung udara untuk mencegah gangguan pada detektor untuk mendeteksi.
Sistem HPLC yang digunakan adalah sebagai berikut
 Kolom :C-18
Detektor :UV
Panjang Gelombang :272 nm
Flow rate :0,8 mL/mom
Fase Gerak:Air distilasi : methanol (60 : 40)

Pemilihan sistem didasarkan pada analisis yang dipersyaratkan farmakope. Kolom

yang digunakan adalah bonded silica dan detektor UV karena senaywa dapat
mengabsorbsi sinar UV, dengan fase gerak adalah campuran air dan methanol yang
merupakan pelarut untuk kafein dan parasetamol . Elusi isokratik karena hanya dianalisis
2 senyawa yang memilki polaritas yang mirip.

Senyawa yang dianalisis adalah parasetamol dan kafein , parasetamol adalah suatu
analgesik yang umumnya digunakan untuk mengurangi rasa sakit kepala. Efek
parasetamol untuk mengurangi rasa sakit kepala dapat semakin tinggi dengan
penambahan kafein.

Pembahasan Hasil

Konsentrasi sampel parasetamol-kafein adalah 22,5 ppm. Sedangkan berdasarkan

hasil analisis menggunakan HPLC dengan tiga kali injeksi maka didapatkan hasil rataan
untuk parasetamol adalah 21,834 ppm dan kafein adalah 23,603 ppm. Maka galat untuk
konsentrasi parasetamol adalah 2,96 % dan galat untuk kafein adalah 4,902 %. Terjadinya
galat ini dapat disebabkan karena adanya zar pengotor, kemudian adanay gelembung gas
yang masuk ke dalam sampel sehingga mengganggu analisis pada sampel.

V. Kesimpulan
a. Peak Area dari parasetamol dan kafein standar adalah 883517 dan 2930851
b. Persamaan kurva kalibrasi dari peak area vs kosentrasi untuk parasetamol
adalah y=80917x-57497 dan untuk kafein adalah y = 38488x – 52427
c. Rata-rata konsentrasi sampel untuk parasetamol adalah 21,834 ppm, standar
deviasi 0,244 dan % koefisien variasi adalah 1,117 %. Jika rat-rata konsentrasi
sampel untuk kafein adalah 23,603 ppm, , standar deviasi 0,194 dan %
koefisien variasi adalah 0,8%.
VI. Daftar Pustaka

Anonim,
<http://www2.fiu.edu/~gardinal/class_syllabi/4130%20FALL%202010/LIQUID%20CH
ROMATOGRAPHY%20CHAPTER%2028.pdf> ,diakses tanggal 15 Oktober 2017.

Bhanot,Depak.2013. Why is Degassing of HPLC Mobile Phase Necessary ? ,

<http://lab-training.com/2013/11/18/why-is-degassing-of-hplc-mobile-phase-necessary/>,
diakses tanggal 15 Oktober 2017.

J,Austin..2015.Ultra Performance Liquid Chromatography (UPLC) - A Review.Anal

Pharm Chem. 2015; 2(6): 1056, <http://austinpublishinggroup.com/analytical-
pharmaceutical-chemistry/fulltext/ajapc-v2-id1056.php>,diakses tanggal 15 Oktober
2017.

J.Pitt,James. Principles and Applications of Liquid Chromatography-Mass

Spectrometry in Clinical Biochemistry. Clin Biochem Rev. 2009 Feb; 30(1): 19–34

P.Schellinger, Adam dan W.Carr, Peter. Isocratic and gradient elution

chromatography: A comparison in terms of speed, retention reproducibility and
quantitation. Journal of Chromatography A. Volume 1109, Issue 2, 24 March 2006,
Pages 253-266.

Rouessac,F. dan A.Rouessac.2005.Chemical Anlysis:Modern Instrumentation

Methods and Techniques. London: John Wiley&Sons.hal 45-62.

Skoog,D.A,F.J Holler, dan T.A. Nieman.1998. Principle of Instrumental Analysis 6 th

ed. Orlando:Harcourt College Pub, hal 725-766.

.
Lampiran

Kromatogram Standar Kafein

Kromatrogram sampel Parasetamol-Kafein

Kurva Sampel Parasetamol-Kafein

Kromatogram Sampel Parasetamol-Kafein