Fasa Gerak

Fasa gerak pada HPLC adalah pelarut yang secara terus-menerus dialirkan didalam
kolom. Fasa gerak berfungsi sebagai agen pembawa molekul sample. Larutan sample
diinjeksikan kedalam fasa gerak melalui injector-port. Selama sample mengalir melewati
kolom bersama fasa gerak, komponen sample tadi bermigrasi berdasarkan interaksi non
kovalen dengan komponen kolom (fasa diam). Interaksi kimia antara fasa gerak dengan
sample dan dengan kolom menentukan tingkat migrasi dan pemisahan komponen zat
yang terkandung dalam sample. Sebagai contoh, zat dengan interaksi yang lebih kuat
dengan fasa gerak daripada fasa diam akan terelusi dari kolom lebih cepat, sehingga
memiliki waktu retensi yang singkat, dan sebaliknya. Fasa gerak dapat diganti-ganti
untuk mengakali interaksi antara sample dan fasa diam. Terdapat beberapa tipe fasa
gerak, yaitu Isocratic, gradient, and polytyptic.

Pada system elusi isokratik, sample terelusi menggunakan komposisi fasa gerak yang
konstan sepanjang waktu. Pemisahan komponen dapat digambarkan menggunakan
beberapa rumus:

(Snyder, 1983)
Semua komponen mulai bermigrasi melalui kolom pada saat yang sama. Tetapi, masing-
masing zat memiliki tingkat migrasi yang berbeda, menghasilkan tingkat elusi yang lebih
cepat atau lebih lambat. Tipe elusi ini sederhana dan tidak mahal, tetapi resolusi dari
beberapa zat masih perlu dipertanyakan dan elusi mungkin tidak dapat dilakukan pada
jumlah waktu yang rasional. (Snyder, 1983).

Pada system elusi gradien, zat yang berbeda terelusi dengan meningkatkan jumlah fasa
organic. Sampel diinjeksikan ketika fasa gerak yang lemah (kaya air) dialirkan dalam
kolom. Kekuatan fasa gerak perlahan ditingkatkan dengan penambahan fraksi organic,
dimana selanjutnya terjadi elusi zat yang diretensi. Hal ini biasanya dilakukan melalui
tahap tertentu atau menurut grafik linear. Terdapat beberapa rumusan yang dapat
enggambarkan elusi gradient.
 (Snyder, 1983)

Pada awal mula sample masuk ke system, komponen diretensi terlebih dahulu di bagian
awal kolom (inlet). Saat kapasitas solute (sample yang terelusi) atau k’ menurun, suatu
zat mulai untuk bermigrasi melalui fasa gerak. Kemudian masing-masing komponen lain
mulai bermigrasi saat harga k’-nya turun. Dibandingkan dengan elusi isokratik, resolusi
dan pemisahan dapat lebih baik dan lebar puncak akan lebih sama dari waktu ke waktu.
(Snyder, 1983)