ACARA II

PEMBUATAN MEDIA DAN STERILISASI

I. TUJUAN
1. Mengetahui cara sterilisasi alat yang digunakan untuk mengisolasi mikroorganisme
2. Mengetahui cara membuat medium buatan untuk menumbuhkan jamur

II. TINJAUAN PUSTAKA

Pada waktu menghadapi penyakit menular, untuk membuktikan parasit itu
betul-betul penyebab penyakit yang bersangkutan perlu diikuti dasar-dasar yang
dibuat oleh Robert Koch, seorang ahli bakteriologi bangsa Jerman cara pembuktian
itu lazim disebut “Postulat Koch” yaitu (Semangun,1996) :
1. Jasad harus selalu menyertai gejala yang tampak.
2. Jasad harus dapat dipisahkan (diisolasi) dan dibiakkan sebagai biakan murni,
bebas dari jasad lain.
3. Biakan murni ini bila dipakai untuk menulari tumbuhan sehat yang rentan
harus mengakibatkan terjadinya gejala seperti yang terlihat pertama kali.
4. Dari tumbuhan yang ditulari ini jasad harus dapat dipisahkan kembali
(reisolasi) dan ini harus sama dengan jasad yang dipakai untuk mengadakan
penularan.
Tetapi postulat ini tidak selalu dapat diikuti dengan sempurna untuk parasit obligat
yang tidak dapat dipisahkan, hubungan yang tetap (konstan) antara organisme dan
gejala sudah cukup digunakan sebagai bukti. Untuk penyakit fisiologis pembuktian
dilkakukan dengan meniru keadaan di luar dan dengan ini harus diperoleh gejala
seperti semula.
Mikroba dapat tumbuh lebih baik pada media yang memenuhi persyaratan
untuk pertumbuhannya. Beberapa syarat media pertumbuhan mikroba antara lain
kandungan nutrisi dalam media, pH, suhu dan tidak tercemar (tidak terpolusi) oleh
toksin dan lain-lain. Apabila suatu sel mikroba (misalnya bakteri) ditumbuhkan dalam
suatu medium yang memenuhi syarat untuk tumbuh, maka mikroba itu akan
mengadakan multiplinasi secara aseksual dengan cara pembelahan sel menjadi dua
sel vegetatif yang serupa dan selanjutnya proses itu berlangsung terus menerus
selama nutrisi, energi, dan persyaratan lingkungan lain masih memenuhi persyaratan
tumbuh (Nurwantoro dan Djarijah, 1997).
Pematian mikroorganisme mendasari metode kerja mikrobiologi dan
pengawetan. Pembebasan suatu bahan dari mikroorganisme hidup atau stadium
istirahatnya disebut sterilisasi. Pembedaan antara sterilisasi dengan pasteurisasi
sangat diperlukan, karena keduanya memiliki pengertian yang berbeda.
Mikroorganisme memiliki kerentanan yang berbeda terhadap bahan-bahan yang
digunakan untuk mematikannya. Terdapat perbedaan jenis tergantung dari kadar air
dan pH lingkungan, dan dari umur sel atau spora. Kecepatan pemusnahan atau
pematian yang eksponensial tidak hanya tergantung dari jenis organisme saja tetapi
juga dari berbagai kondisi lingkungan (Anonim,2001).
Sterilisasi atau pasteurisasi dapat dilakukan dengan menggunakan pemanasan
lembab, pemanasan kering, filtrasi, penyinaran atau bahan kimia (Schlegel and
Schmidt, 1989) :
1. Pemanasan lembab
Sel-sel vegetatif bakteri dan fungi sudah dimatikan pada suhu 60 °C dalam waktu 5-
10 menit. Spora ragi fungi baru mati di atas 80 °C dan spora bakteri di atas 100 °C
(15 menit). Masa sterilisasi dengan pemanasan lembab utnuk mematikan spora
bakteri yang mewakili jenis bakteri yang amat tahan terhadap pemanasan berbeda-
beda. Perlu diperhatikan bahwa semakin tinggi kontaminasi jadi makin banyak
jumlah spora yang termos resisten, diperlukan pemanasan yang semakin lama.
2. Pemanasan kering
Spora bakteri oleh pemanasan kering baru dimatikan pada suhu yang lebih tinggi
dan memerlukan waktu perlakuan yang lebih lama dibanding dengan pemanasan
lembab. Peralatan kaca, serbuk, minyak, dan sebagainya yang tahan terhadap
 pemanasan, disucihamakan dalam sterilisator kering selama 2 jam pada suhu 160
°C. Untuk bahan dengan kapasitas panas yang lebih tinggi atau dengan sifat-sifat
isolasi termik, lama pemanasan harus disesuaikan.
3. Filtrasi
Bahan-bahan termo labil yang terdapat dalam larutan dapat disterilkan paling
mudah dengan filtrasi. Silinder porselin, yaitu lilin chamberland telah digunakan
dalam laboratorium pasteu. Saat ini banyak digunakan saringan berkefeld dalam
laboratorium dan untuk mensterilkan air minum. Yang cocok untuk keperluan ini
adalah lempeng-lempeng asbes (dalam seitz filter), filter kaca masir dan filter
membran. Beberapa filter dibuat dengan penampang pori berbagai ukuran sehingga
mikroorganisme dengan bentuk dan ukuran yang berbeda-beda dapat dipisahkan.
4. Penyinaran
Diantara jenis sinar yang digunakan untuk mensucikan, sinar UV-lah yang amat
berarti. Cahaya dari kebanyakan lampu UV kaya akan sinar dengan panjang
gelombang sekitar 260 nm, yaitu sinar terpilih untuk terabsorpsi asam-asam nukleat
dan jika pengaruhnya berlangsung lama dapat mengakibatkan kematian bakteri.
Dengan perlakuan ini bakteri dan spora fungi yang jauh kurang peka terhadap
penyinaran memerlukan waktu yang lebih lama untuk dimatikan.
5. Bahan-bahan kimia
Untuk mensterilkan bahan makanan, obat, alat-alat dan piranti dan juga pekerjaan
dalam laboratorium, masih dipakai oksiran zat ini mematikan sel vegetatif maupun
spora tetapi bekerja hanya jika ada air (kadar air 5- 15 %). Zat ini juga digunakan
sebagai gas (2-50 % etilen oksida) dalam campuran dengan nitrogen atau CO2 (2-50
%).
 III. ALAT DAN BAHAN
Alat yang diperlukan dalam acara praktikum “Pembuatan Media dan
Sterilisasi” adalah timbangan; alat-alat gelas yaitu gelas beker, gelas piala, gelas ukur,
pipet ukur, labu ukur, cawan petri, dan tabung reaksi; alat-alat isolasi seperti entaks,
lampu spiritus, jarum ent, jarum preparat, jarum ose, skalpel dan pinset; dan alat
sterilisasi yaitu autoclave.
Dan bahan yang digunakan adalah potongan kentang 100 g, dextrose 10 g,
agar-agar 10 g, dan air suling untuk menambah larutan menjadi 500 ml.

IV. CARA KERJA

Dibuat medium buatan yaitu media agar kentang (Potato Dextrose Agar/PDA)
dimana potongan kentang yang telah disiapkan direbus dalam air sampai mendidih
selama 1 jam, kemudian ekstrak kentang dipisahkan dan volume dijadikan 1000 ml
dengan penambahan aquades, ditambah dextrose dan agar-agar lalu dilarutkan di atas
waterbath. Sesudah larutan ekstraknya disaring dengan kain perban diisikan ke dalam
tabung reaksi yang telah disterilkan di dalam autoclave dengan volume 10 ml untuk
agar tegak dan 5 ml untuk agar miring dan disterilkan di dalam autoclave pada suhu
120 °C atau tekanan 1 atm selama 15-20 menit.

V. HASIL PENGAMATAN

A. Pengenalan Alat
1. Timbangan

Fungsi : Untuk menimbang berat bahan.

Mekanisme kerja : Timbangan dibuat
seimbang terlebih dahulu kemudian bahan
yang akan ditimbang ditaruh di cawan
 timbangan kemudian penyeimbang digeser
ke kanan dari berat yang teringan diatur
hingga jarum lurus dengan garis
keseimbangan pada timbangan.

2. Gelas Beker

Fungsi : Untuk tempat larutan selain itu

dapat digunakan sebagai tempat untuk
pengenceran, tempat titrasi, dan dapat juga
untuk memanaskan larutan zat-zat kimia.
Mekanisme kerja : Larutan dimasukkan ke
dalam gelas beker kemudian dilakukan
pengenceran ataupun titrasi dan apabila
perlu dipanaskan.

3. Erlenmeyer

Fungsi : Sebagai tempat larutan yang akan

direaksikan dan dapat juga dibakar karena
tahan panas.
Mekanisme kerja : Bahan yang akan
direaksikan dimasukkan ke dalam
erlenmeyer
4. Gelas Ukur
Fungsi : Untuk mengukur volume larutan
dalam bentuk cair.
Mekanisme kerja :Larutan yang akan diukur
dimasukkan ke dalam gelas ukur kemudian
kita lihat volumenya dengan angka yang
telah tertera di gelas ukur tersebut dan pada
saat melihat angka kita tempatkan gelas
ukur pada tempat yang datar.

5. Pipet Ukur
Fungsi : Untuk mengukur banyaknya cairan
yang akan diambil dalam ukuran yang kecil.
Mekanisme kerja : Ujung pipet kita
masukkan kedalam larutan kemudian
diputar gerigi ke atas sambil diamati berapa
volume larutan yang diinginkan, setelah itu
larutan dimasukkan ke tempat lain dengan
jalan memutar gerigi ke bawah.

6. Labu Ukur

Fungsi : Untuk menambahkan larutan x ml

sesuai dengan yang dibutuhkan.
Mekanisme kerja : Masukkan larutan
kemudian tambahkan larutan (air) lainnya
hingga sampai batas garis.
7. Cawan Petri

Fungsi : Digunakan untuk meletakkan

media agar kentang.
Mekanisme kerja : Bahan yang akan kita uji
kita masukkan kedalam cawan petri
kemudian kita tutup.

8. Tabung reaksi

Fungsi : Sebagai tempat mereaksikan

larutan dan tabung reaksi dapat dibakar bila
diperlukan karena tahan panas.
Mekanisme kerja : Larutan yang akan
direaksikan dimasukkan kedalamnya.

9. Entaks

Fungsi : Sebagai tempat melakukan isolasi

Mekanisme kerja : Kita nyalakan lampu UV
kemudian masukkan bahan-bahan yang akan
diisolasi kemudian dilakukan pengisolasian.

10. Lampu Spiritus

Fungsi : Untuk pemanas atau sterilisasi

dengan pemanasan.
 Mekanisme kerja : Tutup lampu dibuka lalu
lampu spiritus dinyalakan menggunakan
korek api.

11. Jarum Ent

Fungsi : Untuk mengambil biakan dalam

bentuk hifa atau benang untuk diisolasi.
Mekanisme kerja : Kita sterilisasikan dahulu
dengan jalan dicelupkan dalam alkohol 95%
kemudian dibakar hingga membara diatas
lampu spiritus tunggu hingga dingin
kemudian goreskan jarum pada permukaan
media yang telah ditumbuhi jamur atau
bakteri.

12. Jarum Preparat

Fungsi : Untuk merobek bahan agar massa

bakteri keluar.
Mekanisme kerja : Kita sterilisasikan dahulu
dengan jalan dicelupkan dalam alkohol 95%
kemudian dibakar hingga membara diatas
lampu bunsen tunggu hingga dingin
kemudian kita robek-robek bahan yang akan
kita uji.
13. Jarum Ose

Fungsi : Untuk mengambil biakan dalam

bentuk larutan (cair) untuk diisolasi.
Mekanisme kerja : Kita sterilisasikan dahulu
dengan jalan dicelupkan dalam alkohol 95%
kemudian dibakar hingga membara diatas
lampu bunsen tunggu hingga dingin
kemudian masukkan jarum ose kedalam
larutan suspensi bakteri kemudian kita
goreskan ke media dengan bentuk S
menyambung.

14. Skalpel

Fungsi : Untuk memotong bahan.

Mekanisme kerja : Kita sterilkan dahulu
dengan jalan dicelupkan dalam alkohol 95%
kemudian bahan kita potong-potong diatas
tempat yang telah steril pula.

15. Pinset

Fungsi : Untuk mengambil bahan dalam

ukuran kecil dengan jalan menjepit.
Mekanisme kerja : Kita sterilisasikan dahulu
dengan jalan dicelupkan dalam alkohol
95%. Bahan yang akan diambil dijepit
dengan pinset.
 16. Autoclave

Fungsi : Untuk sterilisasi alat-alat gelas.

Mekanisme kerja : Air diperiksa apakah
kehabisan atau tidak kemudian bahan yang
akan disterilkan dimasukkan kedalamnya
kemudian pipa bagian dalam dari autoclave
dimasukkan ketempatnya lalu ditutup, lalu
sekrup dikencangkan semua kemudian katup
dibiarkan terbuka satu kemudian api
dinyalakan dan tunggu hingga uap keluar
lalu katup ditutup semua, tunggu hingga
tekanan naik (terdengar bunyi) satu katup
dibuka lagi dan tunggu hingga tekanan nol
kemudian buka dan angkat bahan yang telah
steril.

B. Pembuatan media dan sterilisasi

Perlakuan Kontaminan/tidak
a. Elenmeyer Terdapat miselium dengan bagian
tengahnya berwarna abu-abu dan bagian
tepi berwarna putih. Kontaminasi ini bisa
disebabkan karena kurang aseptiknya
alat.
b. Agar Tegak 1. Tidak, berwarna bening.
2. Tidak, berwarna bening.
3. Tidak, berwarna bening.
c. Agar Miring 1. Tidak, berwarna bening.
 2. Tidak, berwarna bening.
3. Tidak, berwarna bening.

VI. PEMBAHASAN

Menjaga alat, bahan ataupun lingkungan tetap steril sangat diutamakan dalam
proses isolasi maupun inokulasi, sebab jika tidak maka bakteri yang tidak diinginkan
pertumbuhannya dapat juga tumbuh atau bahkan fase pertumbuhannya lebih cepat
dari pada mikroorganisme yang kita kehendaki keberadaannya. Oleh karena itulah
orang mulai menerapkan sterilisasi atau pasteurisasi dalam menumbuhkan
mikroorganisme dalam medium buatan.
Selain itu syarat tumbuh yang baik adalah tersedianya nutrisi yang cukup bagi
mikroorganisme. Sejumlah besar mikroorganisme seperti Pseudomonads dapat hidup
dalam tanah maupun air, dan juga E. coli tumbuh subur dalam larutan biak. Selain
susunan ini banyak organisme masih memerlukan unsur-unsur lain seperti vitamin
pelengkap atau senyawa tambahan lain.
Potato Dextrose Agar (PDA) merupakan media biak untuk jamur. Selain itu
media yang digunakan untuk menumbuhkan bakteri adalah media Nutrient Agar
(NA). Dalam pembuatan PDA kita menggunakan kentang sebagai ekstrak karena
kentang mengandung karbohidrat yang unsur-unsurnya dapat digunakan sebagai
donor C, H dan O untuk makanan biakan. Digunakan dextrose adalah sebagai donor
C karena pada dasarnya dextrose adalah glukosa, sedangkan agar adalah sebagai
pemadat untuk bahan / media dengan komponen-komponen organik dan
kelebihannya adalah dapat dipengaruhi oleh sejumlah kecil bakteri saja.
Media agar dibuat dalam 2 bentuk yaitu agar tegak dan agar miring. Agar
tegak dibuat pada stadium awal pertumbuhan bakteri atau jamur, karena
permukaannya yang sempit maka jamur atau bakteri yang akan dibiakkan tidak bisa
diletakkan pada agar tegak ini terus-menerus. Hal ini dikarenakan bila ditumbuhkan
dalam waktu yang lama maka akan tumbuh bakteri atau jamur yang lain. Sedangkan
pada agar miring digunakan setelah ditumbuhkannya bakteri atau jamur pada agar
tegak. Dengan agar tegak ini permukaan media menjadi lebih luas dan akan
mencukupi nutrisi bagi pertumbuhan jamur atau bakteri yang dibiakkan.
Pada pembuatan PDA agar tegak dan agak miring berhasil (tidak terjadi
kontaminasi), PDA-nya berwarna bening dan tidak ada hifa jamur yang tumbuh di
permukaannya. Ini dikarenakan pada proses pembuatannya alat-alat yang digunakan
steril (aseptik) dan pada saat proses sterilisasi tidak ada spora dari jamur maupun
bakteri yang masuk dan tumbuh di dalam PDA tersebut.
Sedangkan pada pembuatan PDA erlenmeyer terjadi kontaminasi yang
ditunjukkan dengan berubahnya warna agar yang semula bening menjadi keruh dan
adanya jamur yang tumbuh di permukaan PDA dimana jamur ini di bagian tengah
berwarna abu-abu dan di bagian tepinya berwarna putih, pertumbuhan jamur dalam
PDA ini sangat cepat ditandai dengan banyaknya hifa yang tumbuh. Kontaminasi ini
terjadi karena masuknya spora jamur ke dalam PDA yang disebabkan karena kurang
aseptiknya alat yang digunakan dimana spora jamur atau bakteri ukurannya sangat
kecil, menyebar dimana-mana, jumlahnya sangat banyak dan tidak tampak oleh mata
jika tidak menggunakan alat bantu (mikroskop).

VII. KESIMPULAN
1. Sterilisasi adalah usaha untuk membebaskan alat atau bahan dari
mikroorganisme.sehingga alat atau bahan tersebut dalam keadaan steril.
2. Sterilisasi dapat dilakukan dengan berbagai macam cara antara lain:
a. Secara fisik: suhu tinggi, sinar, getaran, an lain-lain
b. Penggunaan zat-zat kimia: alkohol, formalin, sublimat, dan lain-lain.
c. Secara mekanik: penyaringan.
3. Sterilisasi alat-alat gelas dapat dilakukan dengan menggunakan autoclave dan
oven panas sebagai sterilisator.
4. Medium buatan yang digunakan untuk menumbuhkan atau memelihara jamur
dapat berupa media agar kentang (Potato Dextrose Agar).
5. Media buatan yang dibuat khusus untuk menghindari kontaminasi jamur dari
bakteri adalah media nasi.
6. Terjadinya kontaminasi pada media agar kentang bisa disebabkan karena
kurang aseptiknya alat yang dapat menyebabkan spora bakteri atau jamur
dapat masuk ke dalam media tersebut.

DAFTAR PUSTAKA
Anonim. 2001. Petunjuk Praktikum Mikrobiologi Pertanian. Jurusan Mikrobiologi
Tanah Fakultas Pertanian Universitas Gadjah Mada. Yogyakarta

Nurwantoro, A. S. dan Djarijah. 1997. Mikrobiologi Pangan Hewan dan Nabati.

Kanisius. Yogyakarta

Schlegel, H. G. dan Karin Schmidt. 1989. Mikrobiologi Umum. Gadjah Mada

University Press. Yogyakarta

Semangun, H. 1996. Pengantar Ilmu Penyakit Tumbuhan. Gadjah Mada University

Press. Yogyakarta