Validasi Metode Kromatografi Cair Kinerja Tinggi Fase Terbalik Untuk Penetapan Kadar Asam Askorbat Dalam Sediaan Larutan Injeksi Obat Pemutih Kulit Merek "X"

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
VALIDASI METODE KROMATOGRAFI CAIR KINERJA TINGGI FASE

TERBALIK UNTUK PENETAPAN KADAR ASAM ASKORBAT DALAM
SEDIAAN LARUTAN INJEKSI OBAT PEMUTIH KULIT MEREK “X”
SKRIPSI
Diajukan untuk Memenuhi Salah Satu Syarat
Memperoleh Gelar Sarjana Farmasi (S. Farm)
Program Studi Farmasi
Diajukan oleh:
Rosalia Lestari
NIM : 128114133
FAKULTAS FARMASI
UNIVERSITAS SANATA DHARMA
YOGYAKARTA
2016
i
ii
iii
Halaman Persembahan
Matius 11:28 “Marilah kepadaku, hai kamu yang letih lesu dan berbeban berat
Aku akan memberi kelegaan kepadamu”
Kupersembahkan untuk:
Tuhan, mama, papa,
Saudara, Sahabat, Teman, dan Almamaterku
iv
v
vi
PRAKATA
Puji dan syukur penulis haturkan ke hadirat Tuhan Yang Maha Esa karena
atas berkat dan rahmat-Nya yang telah diberikan selama proses pengerjaan skripsi
ini dari awal hingga akhir, sehingga penelitian dan penyusunan skripsi yang
berjudul “Validasi Metode Kromatografi Cair Kinerja Tinggi Fase Terbalik untuk
Penetapan Kadar Asam Askorbat dalam Sediaan Larutan Injeksi Obat Pemutih
Kulit Merek “X” dapat berjalan dengan lancar dan terselesaikan dengan baik.
Skripsi ini disusun sebagai salah satu syarat untuk meraih gelar sarjana farmasi (S.
Farm.) di Fakultas Farmasi, Universitas Sanata Dharma, Yogyakarta.
Dalam pelaksanaan penelitian hingga selesainya penyusunan skripsi ini,
penulis mendapat banyak dukungan dan bantuan dari berbagai pihak. Oleh karena
itu, penulis mengucapkan terima kasih kepada:
1. Aris Widayati, M.Si., Apt., Ph.D. selaku Dekan Fakultas Farmasi
Universitas Sanata Dharma, Yogyakarta.
2. Prof. Dr. Sudibyo, M.S., Apt. dan Florentinus Dika Octa Riswanto, M.Sc.
selaku Dosen Pembimbing yang bersedia membimbing, memberi masukan
dan jalan keluar serta saran yang sangat bermanfaat dalam menyelesaikan
penelitian ini hingga penyusunan naskah skripsi.
3. Dr. Christine Patramurti, M.Si., Apt. dan Jeffry Julianus, M.Si. selaku dosen
penguji yang telah memberikn saran dan kritik yang membangun dalam
penyusunan skripsi.
4. Jeffry Julianus, M.Si. selaku dosen pembimbing akademik atas
pendampingannya dari semester awal hingga akhir ini. Seluruh Dosen
vii
Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma Yogyakarta yang telah
mendampingi, membagi ilmu, dan pengalamannya yang sangat bermanfaat
dalam bidang farmasi.
5. Seluruh Staf laboratorium kimia Fakultas Farmasi Universitas Sanata
Dharma terutama Mas Bimo, Mas Ottok, Mas Kethul yang telah banyak
membantu dan bersedia direpotkan selama penulis menyelesaikan penelitian
skripsi.
6. Mama, papa, mbak Tiwi, kak Kumala, Wulan, dan Elen yang telah
mendoakan dan terus memberikan semangat agar cepat menyelesaikan
skripsi dan kuliah.
7. Petra Annie Anjani dan Eunike Lystia Florentien Kelana Jeversoon sebagai
teman sekelompok skripsi yang telah berjuang bersama-sama dari awal
penyusunan skripsi hingga selesai.
8. Teman-teman semua yang telah membantu, mendukung, menyemangati
penulis. Semua pihak yang tidak dapat disebutkan satu per satu yang telah
membantu penulis dalam menyelesaikan penelitian ini. Terima kasih atas
dukungannya.
Penulis menyadari bahwa masih banyak kekurangan di dalam skripsi ini. Oleh
karena itu, segala kritik dan saran yang membangun, sangat penulis harapkan.
Semoga skripsi ini dapat membantu dan bermanfaat bagi pembaca dan dapat
berguna bagi perkembangan ilmu pengetahuan.
Penulis
viii
DAFTAR ISI
HALAMAN JUDUL ............................................................................................i
HALAMAN PERSETUJUAN PEMBIMBING ................................................... ii
HALAMAN PENGESAHAN ............................................................................ iii
HALAMAN PERSEMBAHAN ..........................................................................iv
PERNYATAAN KEASLIAN KARYA ............................................................... v
LEMBAR PERNYATAAN PERSETUJUAN PUBLIKASI. ...............................vi
PRAKATA ........................................................................................................vii
DAFTAR ISI ......................................................................................................ix
DAFTAR TABEL............................................................................................ xiii
DAFTAR GAMBAR ........................................................................................ xiv
DAFTAR LAMPIRAN ................................................................................... xviii
INTISARI ......................................................................................................... xix
ABSTRACT ........................................................................................................ xx
BAB I PENDAHULUAN .................................................................................... 1
A. Latar Belakang ............................................................................................ 1
B. Tujuan Penelitian ......................................................................................... 5
BAB II PENELAAHAN PUSTAKA ................................................................... 6
A. Asam Askorbat .......................................................................................... 6
B. Spektrofotometri Ultraviolet ...................................................................... 8
ix
C. Larutan Penyangga (Bufer) ...................................................................... 10
D. Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT) .............................................. 11
E. Validasi Metode Analisis ......................................................................... 13
F. Landasan Teori........................................................................................... 16
G. Hipotesis ................................................................................................... 17
BAB III METODELOGI PENELITIAN ............................................................ 18
A. Jenis dan Rancangan Penelitian ................................................................. 18
B. Variabel Penelitian ..................................................................................... 18
1. Variabel bebas ........................................................................................ 18
2. Variabel tergantung ................................................................................ 18
3. Variabel pengacau terkendali .................................................................. 18
C. Definisi Operasional .................................................................................. 19
D. Bahan Penelitian ........................................................................................ 19
E. Alat Penelitian............................................................................................ 20
F. Tatacara Penelitian ..................................................................................... 20
1. Pembuatan asam fosfat 0,1 M ................................................................. 20
2. Pembuatan bufer fosfat 0,01 M ............................................................... 20
3. Pembuatan fase gerak ............................................................................. 20
4. Pembuatan larutan stok dan intermediate asam askorbat ......................... 21
x
5. Pembuatan larutan baku asam askorbat yang digunakan untuk
penentuan panjang gelombang maksimum .............................................. 21
6. Penentuan panjang gelombang maksimum asam askorbat dengan
spektrofotometer UV-Vis ........................................................................ 21
7. Pembuatan seri larutan baku asam askorbat ............................................. 22
8. Preparasi larutan sampel ......................................................................... 22
9. Preparasi adisi baku dalam sampel untuk penentuan akurasi dan presisi .. 22
10. Validasi metode analisis ....................................................................... 23
11. Uji kestabilan larutan baku ................................................................... 24
G. Analisis Hasil ............................................................................................ 24
1. Selektivitas ............................................................................................. 24
2. Linieritas ................................................................................................ 24
3. Akurasi ................................................................................................... 25
4. Presisi ..................................................................................................... 25
5. Rentang .................................................................................................. 25
6. Uji Kestabilan Larutan Baku ................................................................... 26
BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN............................................................. 27
A. Pembuatan Fase Gerak ............................................................................... 27
B. Pembuatan Larutan Baku Asam Askorbat................................................... 29
C. Penentuan Panjang Gelombang Pengamatan Asam Askorbat ...................... 30
xi
D. Analisis Kualitatif Berdasarkan Waktu Retensi (tR) Asam Askorbat ........... 31
E. Validasi Metode Analisis ........................................................................... 33
1. Selektivitas ............................................................................................. 33
2. Linieritas ................................................................................................. 35
3. Akurasi ................................................................................................... 36
4. Presisi ..................................................................................................... 38
5. Rentang................................................................................................... 38
F. Uji Kestabilan Larutan Baku ...................................................................... 38
BAB V KESIMPULAN DAN SARAN .............................................................. 40
A. Kesimpulan ............................................................................................... 40
B. Saran.......................................................................................................... 40
DAFTAR PUSTAKA ........................................................................................ 41
LAMPIRAN ...................................................................................................... 44
xii
DAFTAR TABEL
Tabel I. Penelitian Asam Askorbat Menggunakan Metode Kromatografi
Cair Kinerja Tinggi (KCKT) .............................................................. 4
Tabel II. Kategori metode pengujian validitas ................................................. 14
Tabel III. Parameter validasi yang dipersyaratkan ............................................ 14
Tabel IV. Kriteria persen recovery yang diperbolehkan .................................... 15
Tabel V. Kriteria persen relative standard deviation (% RSD) yang
diperbolehkan pada beberapa level analit ......................................... 16
Tabel VI. Hasil perhitungan % recovery dan % RSD baku asam askorbat ........ 37
Tabel VII. Hasil % perubahan uji kestabilan larutan baku asam askorbat ........... 39
xiii
DAFTAR GAMBAR
Gambar 1. Struktur Asam Askorbat (Moffat et al., 2011) .................................. 6
Gambar 2. Skema eksitasi elektron (Gandjar dan Rohman, 2007) ....................... 8
Gambar 3. Interaksi asam askorbat dengan fase diam oktadesilsilan ................. 28
Gambar 4. Interaksi asam askorbat dengan fase gerak metanol : bufer fosfat..... 28
Gambar 5. Spektra penentuan panjang gelombang maksimum asam askorbat ... 30
Gambar 6. Gugus kromofor dan auksokrom asam askorbat .............................. 31
Gambar 7. Kromatogram baku asam askorbat .................................................. 32
Gambar 8. Kromatogram sampel ...................................................................... 32
Gambar 9. Kromatogram asam askorbat yang terpisah ..................................... 34
Gambar 10. Asam askorbat dan produk degradasinya ......................................... 34
Gambar 11. Metil paraben. ................................................................................. 35
Gambar 12. Propil paraben ................................................................................. 35
Gambar 13. Etiket sampel .................................................................................. 46
Gambar 14. Kromatogram asam askorbat yang terpisah ..................................... 47
Gambar 15. Kromatogram baku asam askorbat 50 µg/mL Replikasi I ................. 49
Gambar 16. Kromatogram baku asam askorbat 75 µg/mL Replikasi I ................. 50
Gambar 17. Kromatogram baku asam askorbat 100 µg/mL Replikasi I ............... 50
Gambar 20. Kromatogram baku asam askorbat 50 µg/mL Replikasi II ............... 52
Gambar 21. Kromatogram baku asam askorbat 75 µg/mL Replikasi II ............... 52
Gambar 22. Kromatogram baku asam askorbat 100 µg/mL Replikasi II ............. 53
xiv
Gambar 23. Kromatogram baku asam askorbat 125 µg/mL Replikasi II .............. 53
Gambar 24. Kromatogram baku asam askorbat 150 µg/mL Replikasi II ............. 54
Gambar 25. Kromatogram baku asam askorbat 50 µg/mL Replikasi III .............. 54
Gambar 26. Kromatogram baku asam askorbat 75 µg/mL Replikasi III .............. 55
Gambar 27. Kromatogram baku asam askorbat 100 µg/mL Replikasi III ............ 55
Gambar 30. Kurva baku asam askorbat replikasi I .............................................. 57
Gambar 31. Kromatogram sampel Replikasi I .................................................... 58
Gambar 32. Kromatogram sampel Replikasi II ................................................... 58
Gambar 33. Kromatogram sampel Replikasi III ................................................. 59
Gambar 34. Kromatogram sampel adisi level konsentrasi rendah Replikasi I ...... 60
Gambar 35. Kromatogram sampel adisi level konsentrasi rendah Replikasi II..... 60
Gambar 36. Kromatogram sampel adisi level konsentrasi rendah Replikasi III ... 61
Gambar 37. Kromatogram sampel adisi level konsentrasi sedang Replikasi I ...... 61
Gambar 40. Kromatogram sampel adisi level konsentrasi tinggi Replikasi I ....... 63
Gambar 41. Kromatogram sampel adisi level konsentrasi tinggi Replikasi II ...... 63
Gambar 42. Kromatogram sampel adisi level konsentrasi tinggi Replikasi III ..... 64
Gambar 43. Kromatogram uji stabilitas larutan baku 50 µg/mL pada jam ke-0 ... 67
xv
Gambar 46. Kromatogram uji stabilitas larutan baku 50 µg/mL pada jam ke-3 .. 68
Gambar 48. Kromatogram uji stabilitas larutan baku 100 µg/mL pada jam ke-0 69
Gambar 58. Kromatogram uji stabilitas larutan baku 50 µg/mL pada jam ke-0 . 74
xvi
xvii
DAFTAR LAMPIRAN
LAMPIRAN 1. Certificate of Analysis Baku Pembanding Asam Askorbat....... 45
LAMPIRAN 2. Etiket sampel “X” .................................................................. 46
LAMPIRAN 3. Kromatogram resolusi pemisahan asam askorbat dan puncak
di sebelahnya pada sampel 47
LAMPIRAN 4. Data penimbangan kalium dihidrogen fosfat ........................... 48
LAMPIRAN 5. Data penimbangan baku asam askorbat ................................... 48
LAMPIRAN 6. Skema pembuatan larutan baku asam askorbat dan
perhitungan kadar larutan baku. .............................................. 48
LAMPIRAN 7. Kromatogram kurva baku asam askorbat ................................. 49
LAMPIRAN 8. Data Kurva baku asam askorbat .............................................. 57
LAMPIRAN 9. Kromatogram sampel .............................................................. 58
LAMPIRAN 10. Kromatogram sampel adisi...................................................... 60
LAMPIRAN 11. Data AUC sampel dan AUC sampel adisi, perhitungan %
recovery, perhitungan konsentrasi baku yang terukur,
perhitungan RSD baku asam askorbat yang terukur ................. 65
LAMPIRAN 12. Kromatogram baku asam askorbat untuk pengujian stabilitas
larutan baku ............................................................................ 67
LAMPIRAN 13. Data AUC uji stabilitas larutan baku, perhitungan %
perubahan uji stabilitas larutan baku asam askorbat ................. 90
xviii
VALIDASI METODE KROMATOGRAFI CAIR KINERJA TINGGI FASE

TERBALIK UNTUK PENETAPAN KADAR ASAM ASKORBAT DALAM
SEDIAAN LARUTAN INJEKSI OBAT PEMUTIH KULIT MEREK “X”
INTISARI
Asam askorbat dapat digunakan sebagai agen pemutih kulit. Kadar asam
askorbat dalam larutan injeksi pemutih kulit merek “X” harus memberikan efek
yang diinginkan. Untuk menjamin efikasinya, maka perlu dilakukan penetapan
kadar asam askorbat dalam sediaan obat dengan metode yang telah divalidasi.
Penelitian bersifat deskriptif non eksperimental, asam askorbat dianalisis
menggunakan sistem Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT) fase terbalik
dengan fase diam Phenomenex® C18 (250 x 4,6 mm, 5 µm) dan fase gerak
campuran metanol : 0,01 M bufer fosfat dengan penambahan larutan 0,1 M asam
fosfat hingga pH 3 (40 : 60) dengan kecepatan alir 0,9 mL/menit dan menggunakan
detektor UV-244 nm. Parameter validasi yang digunakan adalah selektivitas,
linieritas, akurasi, presisi, dan rentang.
Hasil penelitian menunjukkan parameter selektivitas terpenuhi, akurasi
dan presisi yang baik pada konsentrasi tinggi (konsentrasi asam askorbat = 120
µg/mL) dengan % recovery = 100,50–101,01% dan RSD = 0,28%. Linieritas yang
dihasilkan pada metode ini telah memenuhi syarat dengan nilai r = 0,9989 pada
konsentrasi asam askorbat 50–150 µg/mL.
Kata kunci: asam askorbat, larutan injeksi pemutih kulit merek “X”, KCKT fase terbalik,
validasi
xix
VALIDATION METHOD OF REVERSE PHASE HIGH PERFORMANCE

LIQUID CHROMATOGRAPHY FOR THE ASSAY OF ASCORBIC ACID
IN THE WHITENING SKIN INJECTION BRAND “X”
ABSTRACT
Ascorbic acid can be used as agent for skin whitening. Ascorbic acid level
inside skin whitening “X” injection should give the desired effect. To ensures the
efficacy, it’s necessary to determine the ascorbic acid level in the dosage form with
a method that has already been validated.
This research is descriptive non exprimental. Ascorbic acid is using
Reversed High Performance Liquid Chromatography (HPLC) with stationary phase
Phenomenex® C18 (250 x 4.6 mm, 5 µm) and mobile phase methanol : 0.01 M
phosphoric buffer adjusting to pH 3 with 0.1 M phosphoric acid (40 : 60), flowrate
0.9 mL/min and detection with UV at 244 nm. Validation parameter used in this
research are selectivity, linierity, acuration, precision, and range.
This results of the study showed that selectivity reversed-phase HPLC
method is reach, accuracy and precision are at high concentration (120 µg/mL) with
% recovery = 100.50–101.01% and RSD = 0.28%. The good linierity for ascorbic
acid with values (r) of 0.9989 at 50–150 µg/mL.
Key Words: ascorbic acid, skin whitening “X” injection dosage form, KCKT reverse
phase, validation
xx
BAB I
PENGANTAR
A. Latar Belakang
Asam askorbat telah dikembangkan menjadi berbagai macam produk
obat, salah satunya sebagai sediaan injeksi pemutih kulit. Produk pemutih kulit
dapat menunjang kecantikan kulit, sehingga produk ini diminati oleh banyak
konsumen. Produk tersebut digunakan untuk mencerahkan kulit, baik dengan
meratakan warna kulit maupun merawat kulit sehingga terhindar dari masalah
pigmentasi seperti bintik-bintik hitam, melasma, tanda bekas hamil dan keriput.
Beberapa agen pemutih kulit yang saat ini sering digunakan adalah arbutin,
vitamin C (asam askorbat), kojic acid, licorice extract, burner root extract,
Scutellaria extract dan mulberry (Thongchai et al., 2007). Asam askorbat
digunakan dalam produk pemutih kulit karena kemampuannya sebagai
antioksidan yang dapat mengikat radikal bebas sehingga mencegah terbentuknya
melanin pada kulit, dan asam askorbat memiliki kemampuan untuk melindungi
kulit dari bahaya radiasi UV (Arbab dan Eltahir, 2010).
Peningkatan konsumsi produk pemutih kulit saat ini membuat banyak
produsen yang memproduksi produk-produk pemutih kulit dengan harga produk
yang relatif murah dan mengandung asam askorbat yang relatif tinggi, contohnya
sediaan larutan injeksi obat pemutih kulit merek “X” mengandung asam askorbat
1000 mg per ampul. Jika jumlah asam askorbat tidak sesuai dengan yang tertera
pada label, maka konsumen akan dirugikan dari sudut efikasi. Menurut Farmakope
V (2014) sediaan obat injeksi asam askorbat mengandung asam
1
askorbat tidak kurang dari 90,0% dan tidak lebih dari 110,0% dari yang tertera pada
label. Oleh karena itu, perlu dilakukan penetapan kadar asam askorbat dalamproduk
pemutih kulit yang mengandung asam askorbat relatif tinggi untuk menjamin
efikasi produk. Produk sediaan injeksi intravena memiliki bioavailabilitas yang
tinggi dibandingkan dengan sediaan peroral (Lullmann, et al., 2000), sehingga
asam askorbat dalam sediaan intravena bekerja lebih efisien dan sediaan ini lebih
diminati oleh konsumen daripada sediaan peroral.
Analisis asam askorbat pernah diteliti sebelumnya yaitu pada
pengembangan dan validasi metode kuantifikasi asam askorbat dengan
menggunakan metode KCKT fase terbalik oleh Ullah, Shafqat, Arshad Hussain,
Javid Ali, Khaliqurrehman dan Asad Ullah (2012) dengan judul “A Simple and
Rapid HPLC Method for Analysis of Vitamin-C in Local Packed Juices of
Pakistan”, penelitian lain mengenai asam askorbat dilakukan oleh Wang, A-
Ching, Shu-Hui Cheng, Ceshing Sheu dan Chang-Chin Kwan (2011) dengan judul
“Simultaneous Determination of Five Whitening Agents by Ion-Pair Reversed-
Phase High Perfomance Liquid Chromatogrpahy”.
Pengembangan metode dilakukan melalui tiga tahapan, yaitu: optimasi
metode, validasi metode dan aplikasi metode untuk penetapan kadar asam askorbat
dalam sampel injeksi pemutih kulit (Supriyanto, 2014). Optimasi metode analisis
untuk penetapan kadar asam askorbat dalam sediaan larutan injeksi obat pemutih
kulit merek “X” telah dilakukan oleh Jeversoon (2016) dengan kondisi KCKT yang
optimal menggunakan fase gerak campuran metanol : 0,01 M bufer fosfat pH 3 (40
: 60) dengan kecepatan alir 0,9 mL/min, fase diam Phenomenex®

C18 (250 x 4,6 mm, 5 µm), dan deteksi UV-244 nm. Validasi metode merupakan
langkah yang penting untuk dilakukan dalam tahap penetapan kadar supaya dapat
memberikan hasil yang terpercaya dan dapat dipertanggungjawabkan.
1. Perumusan masalah
Apakah metode penetapan kadar asam askorbat dalam sediaan larutan
injeksi obat pemutih kulit merek “X” dengan kromatografi cair kinerja tinggi
(KCKT) fase terbalik menggunakan fase gerak campuran metanol : 0,01 M bufer
fosfat pH 3 (40 : 60) dengan kecepatan alir 0,9 mL/menit, fase diam Phenomenex®
C18 (250 x 4,6 mm, 5 µm), dan deteksi UV-244 nm memenuhi persyaratan validitas
yang meliputi selektivitas, linearitas, akurasi, presisi, dan rentang?
2. Keaslian penelitian
Pengembangan dan validasi metode kuantifikasi asam askorbat dengan
menggunakan metode KCKT fase terbalik pernah dilakukan oleh Ullah et al.
(2012), dan Wang et al. (2011) yang terangkum dalam Tabel I. Terdapat beberapa
perbedaan penelitian yang peneliti lakukan dengan penelitian sebelumnya, yaitu
pada fase gerak, jenis kolom, panjang gelombang, dan sampel yang digunakan.
Kelebihan penelitian ini adalah sampel yang digunakan merupakan sediaan injeksi
pemutih kulit yang belum pernah diteliti oleh penelitian terdahulu. Pada penelitian
ini peneliti menggunakan metode KCKT fase terbalik dengan menggunakan fase
gerak campuran metanol : 0,01 M bufer fosfat pH 3 (40 : 60) dengan kecepatan alir
0,9 mL/menit, fase diam Phenomenex® C18 (250 x 4,6 mm, 5 µm), deteksi
UV-244 nm, dan sampel asam askorbat dalam sediaan larutan injeksi obat
pemutih kulit merek “X”.
Tabel I. Penelitian Asam Askorbat Menggunakan Metode Kromatografi Cair Kinerja

Tinggi (KCKT)
Peneliti (tahun) Judul Penelitian Parameter yang digunakan
Shafqat Ullah, Hussain A Simple and Rapid HPLC Kolom Inertsil ODS-3 C18 (250 mm x
Arshad, Javid Ali, Method for Analysis of 4,6 mm), fase gerak metanol : bufer
Khaliqurrehman, and Vitamin-C in Local fosfat (20 : 80, v/v) pH 3±0,1 dengan
Asad Ullah (2012) Packed Juices of Pakistan kecepatan alir 1,0 mL/menit, dan
panjang gelombang 240 nm
A-Ching Wang, Shu-Hui Simultaneous Kolom Inertsil ODS-3V (250 mm x 4,6

Cheng, Ceshing Sheu, Determination of Five mm, 5 µm), fase gerak asetonitril :
and Chang-Chin Kwan Whitening Agents by Ion- larutan bufer campuran (50 mM natrium
(2011) Pair Reversed-Phase High fosfat monobasic dihidrat dan 2 mM n-
Perfomance Liquid heksadesiltrimetil amonium bromida)
Chromatogrpahy dengan elusi gradien komposisi
asetonitril : larutan bufer campuran (99 :
1, v/v) dari menit ke-0 hingga menit ke-
20, (70 : 30 v/v) dari menit ke-21 hingga
menit ke-40, (1 : 99 v/v) dari menit ke-
41, dengan pH 4,5 dan panjang
gelombang 270 nm
Sejauh yang telah peneliti ketahui, penelitian dengan judul Validasi
Metode Kromatografi Cair Kinerja Tinggi Fase Terbalik Untuk Penetapan
Kadar Asam Askorbat Dalam Sediaan Larutan Injeksi Obat Pemutih Kulit
Merek “X” belum pernah dilakukan sebelumnya. Dengan demikian, jika dilihat
dari permasalahan yang ada dalam penelitian ini, maka dapat dikatakan bahwa
penelitian ini merupakan karya ilmiah yang asli.

3. Manfaat Penelitian
a. Manfaat metodologis. Penelitian ini diharapkan dapat memberikan
sumbangan ilmiah tentang penggunaan metode KCKT fase terbalik yang telah
divalidasi dalam penetapan kadar asam askorbat dalam sediaan larutan injeksi obat
b. Manfaat praktis. Hasil penelitian ini diharapkan metode KCKT fase
terbalik yang telah dioptimasi dan divalidasi ini dapat dipergunakan/diaplikasikan
pada penetapan kadar asam askorbat dalam sediaan larutan injeksi obat pemutih
kulit merek “X”.
B. Tujuan Penelitian
Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui validitas metode KCKT fase
terbalik dengan sistem yang telah dioptimasi sebelumnya memenuhi persyaratan
validasi yang meliputi selektivitas, linearitas, akurasi, presisi, dan rentang,
sehingga dapat digunakan pada penetapan kadar asam askorbat dalam sediaan
larutan injeksi obat pemutih kulit merek “X”.

BAB II
PENELAAHAN PUSTAKA
A. Asam Askorbat
Asam askorbat (Gambar 1) yang secara kimia dikenal sebagai (2R)-2-
[(1S)-1,2-Dihydroxyethyl]-4,5-dihydroxyfuran-3-one merupakan senyawa
berbentuk kristal tidak berwarna atau berbentuk serbuk kristal berwarna putih atau
kuning pudar. Asam askorbat dengan rumus kimia C6H8O6 memiliki berat molekul
176,1 gram/mol, pKa = 4,2; 11,6 (pada suhu 25oC), dan log P
(oktanol/air) = 1,8. Kelarutan dalam air 1 : 3, dalam etanol 1 : 30, dalam metanol 1
: 10, dan dalam propilen glikol 1 : 20. Dapat larut dalam aseton, tidak larut dalam
benzena, kloroform, eter, petroleum eter, minyak, lemak, dan pelarut lemak (Moffat
et al., 2011). Asam askorbat sensitif terhadap cahaya dan mudah teroksidasi (Ahuja
dan Dong, 2005).
Gambar 1. Struktur Asam Askorbat (Moffat et al., 2011)
Asam askorbat dapat digunakan sebagai agen pemutih kulit (Thongchai
et al., 2007). Dosis asam askorbat adalah 0,2-3 g per hari (Moffat et al., 2011).
Asam askorbat digunakan dalam produk pemutih kulit karena kemampuannya
sebagai antioksidan yang dapat mengikat radikal bebas sehingga mencegah
terbentuknya melanin pada kulit. Selain itu, asam askorbat memiliki kemampuan
6
untuk melindungi kulit dari bahaya radiasi UV. Keuntungan inilah yang mendasari
pemakaian asam askorbat dalam produk pemutih kulit (Arbab dan Eltahir, 2010).
Sediaan injeksi pemutih kulit merek “X” memiliki kandungan yang
terdiri dari asam askorbat, metil paraben, propil paraben, natrium hidroksida, dan
aqua for injection. Metil paraben merupakan pengawet berbentuk serbuk tak
berwarna yang memiliki nilai log P 2,0 dan kelarutan 1 : 400 dalam air. Propil
paraben merupakan pengawet serbuk tak berwarna yang memiliki nilai log P 3,0
dan kelarutan 1 : 2500 dalam air (Moffat et al., 2011). Natrium hidroksida sebagai
agen untuk penyesuaian pH hingga mencapai 5,5-7,0 untuk menjamin stabilitas
sediaan injeksi asam askorbat dan pH larutan mendekati pH darah yaitu 7,4
supaya bila sediaan diinjeksikan ke tubuh tidak terasa sakit (Sulistiyaningsih,
2007).
Penelitian mengenai agen pemutih kulit juga dilakukan oleh Ullah et al.
(2012) dan Wang et al. (2011) yang terangkum dalam Tabel I. Perbedaan penelitian
yang peneliti lakukan dengan penelitian sebelumnya terletak pada fase gerak, jenis
kolom, panjang gelombang, dan sampel yang digunakan. Pada penelitian ini,
peneliti menggunakan metode KCKT fase terbalik dengan fase gerak campuran
metanol : 0,01 M bufer fosfat pH 3 (40 : 60) dengan kecepatan alir 0,9 mL/menit,
fase diam Phenomenex® C18 (250 x 4,6 mm, 5 µm), deteksi UV-244 nm, dan
sampel asam askorbat dalam sediaan larutan injeksi obat pemutih kulit merek “X”.
B. Spektrofotometri Ultraviolet
Prinsip spektrofotometri ultraviolet (UV) adalah pengukuran suatu
interaksi antara radiasi elektromagnetik dan molekul atau atom dari suatu zat kimia
pada panjang gelombang (λ) 190-380 nm (Direktorat Jenderal Pengawasan Obat
dan Makanan Republik Indonesia, 1995). Serapan atom menyebabkan paralihan
atau transisi elektronik, yaitu peningkatan energi elektron dari keadaan dasar
(ground state) ke satu atau lebih tingkat energi yang lebih tinggi (Gambar 2) atau
tereksitasi (excited state). Transisi terjadi jika energi yang dihasilkan oleh radiasi
sama dengan energi yang diperlukan untuk melakukan transisi (Watson, 2000).
Radiasi elektromagnetik pada sinar ultraviolet dan sinar tampak memiliki suatu
energi yang merambat dalam bentuk gelombang. Jarak linier antara titik pada satu
gelombang dengan titik yang berada pada gelombang terdekatnya disebut sebagai
panjang gelombang (Watson, 2000).
Gambar 2. Skema eksitasi elektron (Gandjar dan Rohman, 2007)
Molekul-molekul yang memerlukan energi yang lebih sedikit untuk
mengeksitasi elektron maka akan menyerap energi pada panjang gelombang yang
lebih panjang, sedangkan untuk molekul-molekul yang memerlukan energi yang

lebih banyak untuk mengeksitasi elektron maka akan menyerap energi pada
panjang gelombang yang lebih pendek (Fessenden and Fessenden, 1997). Jumlah
energi yang diserap oleh molekul-molekul disebut sebagai absorban. Hukum
Lambert-Beer menunjukkan bahwa absorbansi suatu senyawa dipengaruhi oleh
absorptivitas molar, tebal kuvet dan konsentrasi molekul senyawa analit (Gandjar
dan Rohman, 2007). Hukum Lambert-Beer dinyatakan dalam persamaan:
A= bc (1)
Keterangan: A = absorbansi
= absorptivitas molar (M-1. cm-1)
b = tebal kuvet (cm)
c = konsentrasi molekul dalam senyawa analit (Gandjar dan Rohman, 2007)
Nilai absorptivitas molar tergantung pada suhu, pelarut, struktur molekul,
dan panjang gelombang radiasi. Dikatakan sebagai absorptivitas molar ( ) apabila
konsentrasi molekul zat analit dalam satuan Molar (M), namun jika konsentrasi
molekul zat analit dalam satuan persen berat/volume (g/100 mL), maka
absorptivitas ditulis dengan . Nilai absorptivitas menunjukkan sensitivitas senyawa
untuk diukur menggunakan spektrofotometer UV-Vis. Semakin besar
nilai suatu senyawa, maka semakin sensitif senyawa tersebut untuk
dideteksi dan diukur menggunakan spektrofotometer UV-Vis (Gandjar dan
Rohman, 2007). Hubungan antara dengan dapat dilihat dalam persamaan:
= x (2)
Keterangan: = absorptivitas molar (M -1. cm-1)

= absorptivitas molekul dalam satuan konsentrasi (g/100 mL)
BM = bobot molekul (g/mol) (Gandjar dan Rohman, 2007)
10
Asam askorbat (antioksidan) dapat menyerap radiasi pada daerah
ultraviolet karena senyawa ini memiliki gugus kromofor dan auksokrom yang
ditunjukkan pada Gambar 6 (Ahuja dan Dong, 2005). Kromofor adalah gugus
fungsional tak jenuh yang dapat menyerap radiasi pada daerah ultraviolet dan sinar
tampak (Gandjar dan Rohman, 2007), sedangkan auksokrom adalah gugus jenuh
yang bila terikat pada kromofor dapat mengubah panjang gelombang dan intensitas
serapan maksimum (Sastrohamidjojo, 2001). Asam askorbat dalam larutan asam
pada panjang gelombang 243 nm memiliki nilai absorptivitas:
=556a. Nilai tersebut dapat menunjukkan bahwa senyawa asam askorbat
dapat dideteksi dengan spektrofotometer UV-Vis. Nilai absorptivitas molar asam
askorbat adalah 9791,15 M-1.cm-1. Nilai tersebut menunjukkan bahwa asam
askorbat akan mengalami transisi dan dapat diaplikasikan pada daerah
ultraviolet (Rohman dan Gandjar, 2007).
C. Larutan Penyangga (Bufer)
Bufer dapat mencegah perubahan pH yang disebabkan oleh penambahan
baik sedikit asam ataupun sedikit basa. Larutan bufer dapat dibuat dengan
mencampurkan asam lemah atau basa lemah dengan garamnya masing-masing.
Ketahanan bufer dipengaruhi oleh pH larutan yang dibuat karena jika pH larutan
bufer sama dengan pKa asam atau basa yang membentuknya maka bufer dapat
bekerja dengan baik (Snyder Kirkland, and Dolan, 2010).
Menurut Snyder et al. (2010) terdapat beberapa faktor yang perlu
diperhatikan dalam pemilihan bufer sebagai fase gerak pada KCKT, yaitu
11
kapasitas bufer, kelarutan komponen bufer, stabilitas bufer, dan serapan bufer pada
daerah UV pada sistem KCKT. Kemampuan suatu bufer untuk mempertahankan
pH disebut sebagai kapasitas bufer. Hal ini dipengaruhi oleh nilai pKa asam atau
basa lemah penyusun bufer, dan kapasitas bufer berada dalamrentang pH±1,0 unit
dari nilai pKa asam atau basa lemah penyusun bufer tersebut. Nilai pKa buffer fosfat
adalah 2,1 dan kapasitas buffer fosfat dalam rentangpH 1,1–3,1 (Kazakevich
and Lobrutto, 2007). Menurut Kromidas (2005) nilai UV cut-off bufer fosfat 50 mM
dengan nilai pH = 2,0-3,0 adalah pada panjang gelombang 210 nm.
D. Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT)
Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT) merupakan salah satu metode
analisis untuk pemisahan suatu campuran senyawa kimia. Pemisahan pada sistem
KCKT terjadi akibat adanya interaksi antara zat analit dengan fase diam dan fase
gerak yang kemudian akan menghasilkan perbedaan waktu migrasi dari zat analit
(Kazakevich and Lobrutto, 2007). Ada dua jenis KCKT dalam analisis, yaitu
KCKT fase normal dan KCKT fase terbalik. KCKT fase normal menggunakan fase
diam bersifat lebih polar daripada fase geraknya, sedangkan KCKT fase terbalik
menggunakan fase diam bersifat lebih non-polar daripada fase geraknya (Snyder et
al., 2010).
Salah satu keunggulan KCKT dibandingkan dengan kromatografi gas
yaitu dapat digunakan untuk menganalisis senyawa yang tidak menguap atau tidak
tahan panas tanpa peruraian (Direktorat Jenderal Pengawasan Obat dan Makanan
Republik Indonesia, 1995). Kelebihan HPLC dibandingkan metode

12
spektrofotometri yaitu pada sensitifitas dan selektivitas dalam kemampuan
pemisahannya (Ahuja dan Dong, 2005).
Instrumen KCKT terdiri atas kolom, detektor, wadah fase gerak, pompa,
injector, dan komputer atau perekam data (Ahuja dan Dong, 2005). Salah satu jenis
kolom KCKT fase terbalik yang sering digunakan adalah tipe C18 yang tersusun
oleh suatu penyangga silika gel (SiO2). Pada bagian permukaan silika terdapat
gugus-gugus hidroksil (-OH), sehingga silika gel relatif bersifat polar. Silica gel
dapat dimodifikasi dengan menutup gugus silanol dengan hidrokarbon rantai
panjang untuk menghilangkan gugus hidroksil. Kebanyakan fase diam dengan
penyusun silica memiliki rentang pH yang dapat ditoleransi pada pH 2-7
(Kazakevich and Lobrutto, 2007).
Detektor KCKT digolongkan menjadi dua golongan, yaitu golongan
detektor universal dan golongan detektor spesifik. Beberapa karakteristik detektor
adalah memiliki respon yang cepat dan reprodusibel terhadap analit, memiliki
sensitifitas tinggi, stabil dalam pengoperasiannya, dan sinyal yang dihasilkan
berbanding lurus dengan konsentrasi analit dalam sampel (Gandjar dan Rohman,
2007). Detektor UV merupakan salah satu jenis detektor spesifik yang mendeteksi
analit secara spesifik sesuai panjang gelombang yang digunakan. Detektor UV
dapat digunakan dalam sistem KCKT untuk senyawa-senyawa yang memiliki
serapan pada panjang gelombang 200-400 nm (Snyder, Kirkland, and Glajch,
1997).
Fase gerak yang digunakan harus bersih, tidak berinteraksi dengan analit,
dan tidak toksik. Fase gerak biasanya terdiri atas campuran pelarut yang dapat
13
bercampur dan berpengaruh pada daya elusi dan resolusi. Pada KCKT, daya elusi
dan resolusi ditentukan oleh polaritas seluruh pelarut, polaritas fase diam, dan
sifat komponen sampel. Komposisi fase gerak akan mempengaruhi pemisahan dan
waktu retensi analit. Sebelum digunakan, fase gerak harus disaring terlebih dahulu
untuk menghilangkan partikel-partikel kecil. Adanya gas dalam fase gerak juga
harus dihilangkan, karena gas akan mengganggu analisis, terutama mengacaukan
bagian pompa dan detektor (Rohman, 2009). Perlu diperhatikan agar nilai UV cut-
off fase gerak tidak mengganggu pembacaan hasil analit pada detektor UV. Nilai
UV cut-off metanol adalah 205 nm (Kazakevich and Lobrutto, 2007).
E. Validasi Metode Analisis
Validasi metode analisis merupakan suatu prosedur untuk membuktikan
apakah suatu metode analisis telah memenuhi persyaratan yang ditentukan,
sehingga hasil analisis dapat dipertanggungjawabkan (Unites States
Pharmacopeial Convention, 2007). Suatu metode perlu divalidasi jika metode
tersebut baru dikembangkan untuk analisis senyawa tertentu, revisi dari metode
yang sudah baku untuk menyesuaikan dengan perkembangan, metode baku
dilakukan di laboratorium yang berbeda oleh analis berbeda atau dikerjakan dengan
alat yang berbeda, untuk membandingkan kesetaraan antara dua metode (Rohman,
2009).
United States Pharmacopeia (USP, 2007) dan International Conference
on Harmonization (ICH, 2005) menyatakan bahwa tidak selalu semua parameter
untuk mengevaluasi validasi metode harus diuji. Menurut The United States
Pharmacopeia 30 dan The National Formulary 25 tahun 2007, metode analisis

14
dapat dikelompokkan menjadi empat kategori (Tabel II). Pengelompokkan kategori
tergantung pada sifat uji yang dilakukan untuk tujuan validasi metode analisis.
Tabel II. Kategori metode pengujian validitas (United States pharmacopeial Convention, 2007)
Kategori Keterangan
Penentuan kuantitatif komponen-komponen utama obat atau zat aktif (termasuk
I
pengawet) di dalam produk obat jadi
Penentuan kemurnian/adanya pengotor (impurities) atau produk-produk hasil
II
degradasi. Kategori II ini dibagi lagi menjadi uji kuantitatif dan uji batas
Penentuan karakteristik/sifat-sifat khusus kinerja produk obat jadi, seperti
III
kecepatan disolusi dan uji pelepasan obat
IV Uji identifikasi
Tujuan validasi metode pada penelitian ini adalah untuk penentuan
kuantitatif komponen-komponen utama obat atau zat aktif (termasuk pengawet) di
dalam produk obat jadi, maka dalam penelitian ini dilakukan validasi metode
analisis untuk penetapan kadar asam askorbat dalam sediaan larutan injeksi obat
pemutih kulit merek “X” termasuk dalam kategori I (Tabel III). Parameter yang
dipersyaratkan untuk validasi metode analisis ini adalah selektivitas, linieritas,
akurasi, presisi, dan rentang.
Tabel III. Parameter validasi yang dipersyaratkan untuk validasi metode analisis (United
States pharmacopeial Convention, 2007)
Kategori II
Parameter Kategori I Uji Kategori III Kategori IV
Kuantitatif
batas
Akurasi Ya Ya * * Tidak
Presisi Ya Ya Tidak Ya Tidak
Selektivitas Ya Ya Ya * Ya
Batas deteksi Tidak Tidak Ya * Tidak
Batas kuantitasi Tidak Ya Tidak * Tidak
Linieritas Ya Ya Tidak * Tidak
Rentang Ya Ya * * Tidak
*Mungkin dibutuhkan (tergantung sifat tes yang spesifik)
Selektivitas adalah kemampuan suatu metode untuk mengukur dengan
akurat respon analit di antara seluruh komponen sampel (Harmita, 2004).

15
Selektivitas dapat dibuktikan melalui pemisahan puncak-puncak berdekatan
dengan perhitungan nilai resolusi (Rs). Bila hasil perhitungan nilai Rs
menunjukkan angka 1,0 berarti puncak kromatogram analit tidak terpisah sampai
ke baseline, nilai Rs = 1,5 menunjukkan puncak analit telah terpisah sampai
baseline, dan nilai Rs > 1,5 menunjukkan puncak analit telah terpisah sempurna
satu sama lain (Gandjar dan Rohman, 2007).
Akurasi adalah kedekatan antara nilai kadar terukur (nilai rata-rata hasil
analisis) dengan nilai kadar sebenarnya yang diterima. Akurasi dapat dijadikan
sebagai penunjuk kesalahan sistematik (Rohman, 2009). Akurasi dikatakan baik
bila memiliki nilai % recovery antara 98,0-102,0% (Tabel IV) untuk kadar analit
10-100% (Gonzalez dan Herrador, 2007).
Tabel IV. Kriteria persen recovery yang diperbolehkan pada beberapa level analit (Gonzalez
dan Herrador, 2007)
Analit (%) Fraksi analit Unit Rentang recovery (%)

100 1 100% 98-102
10 10- 10% 98-102
1 10-2 1% 97-103
01 10-3 0 1% 95-105
0 01 10-4 100 ppm 90-107
0 001 10-5 10 ppm 80-110
0,0001 10-6 1 ppm 80-110
0,00001 10-7 100 ppb 80-110
0,000001 10-8 10 ppb 60-115
0,0000001 10-9 1 ppb 40-120
Presisi adalah ukuran kedekatan antara serangkaian hasil analisis yang
diperoleh dari beberapa kali pengukuran sampel. Konsep presisi diukur dengan
koefisien variasi (KV) atau standar deviasi relatif (RSD) (Rohman, 2009). Suatu
metode dikatakan memiliki keterulangan/presisi yang baik jika memiliki nilai RSD
≤ 2,0% (Tabel V) untuk kadar analit 100% (Gonzalez dan Herrador, 2007).
16
Tabel V. Kriteria persen RSD yang diperbolehkan pada beberapa level analit (Gonzalez dan
Herrador, 2007)
Analit (%) Fraksi analit Unit % RSD Horwitz % RSD AOAC

100 1 100% 2 1,3
10 10-1 10% 2,8 1,8
1 10-2 1% 4 2,7
0,1 10-3 0,1% 5,7 3,7
0,01 10-4 100 ppm 8 5,3
0,001 10-5 10 ppm 11,3 7,3
0,0001 10-6 1 ppm 16 11
0,00001 10-7 100 ppb 22,6 15
0,000001 10-8 10 ppb 32 21
0,0000001 10-9 1 ppb 45,3 30
Linieritas adalah kemampuan metode analisis memberikan respon secara
langsung dan proporsional terhadap konsentrasi analit dalam sampel. Data respon
dan konsentrasi analit yang diperoleh, dimasukkan ke dalam persamaan
matematika untuk mendapatkan linieritas antara konsentrasi dan respon analit
(USP, 2007). Persyaratan linieritas yang dapat diterima adalah jika memenuhinilai
koefisien korelasi (r) ≥ 0,998 (Kazakevich dan Lobrutto, 2007).
Rentang merupakan interval antara kadar terendah hingga kadar tertinggi
yang dapat diukur secara kuantitatif dengan menggunakan metode analisis tertentu
dan menghasilkan linieritas, akurasi dan presisi yang baik (Rohman, 2009).
F. Landasan Teori
Asam askorbat merupakan salah satu agen pemutih kulit yang dapat
diformulasikan sebagai larutan injeksi. Asam askorbat mudah terdegradasi oleh
oksigen, paparan cahaya, peningkatan suhu, dan katalis logam. Jumlah asam
askorbat dalam produk injeksi pemutih kulit perlu untuk dipastikan kesesuaiannya
dengan klaim label supaya konsumen tidak dirugikan. Tujuan penelitian ini adalah
17
untuk memvalidasi metode KCKT fase terbalik yang dapat dipergunakan dalam
penetapan kadar asam askorbat dalam sediaan larutan injeksi obat pemutih kulit
merek “X”.
Asam askorbat dapat dipisahkan dari matriks sampel larutan injeksi obat
pemutih kulit berdasarkan perbedaan kepolarannya dan interaksi antara analit, fase
gerak, dan fase diam dalam sistem KCKT. Asam askorbat memiliki gugus
kromofor dan auksokrom pada strukturnya, dalam larutan asam pada panjang
gelombang 243 nm dengan detektor UV memiliki nilai =556a dan nilai
=9791,15 M-1.cm-1, sehingga sistem KCKT fase terbalik dengan detektor UV
dapat diaplikasikan untuk analisis kadar asam askorbat dalam larutan injeksi obat
Validasi metode perlu dilakukan untuk menjamin bahwa hasil aplikasi
menggunakan metode yang telah dioptimasi, dapat dipercaya dan
dipertanggungjawabkan. Validasi metode analisis yang peneliti lakukan termasuk
dalam kategori 1, sehingga parameter validasi yang diuji meliputi akurasi, presisi,
selektivitas, linieritas dan rentang.
G. Hipotesis
Validasi metode KCKT fase terbalik dengan fase diam Phenomenex®
C18 (250 x 4,6 mm, 5 µm) dan fase gerak metanol : 0,01 M bufer fosfat dengan
penambahan larutan 0,1 M asam fosfat hingga pH 3 (40 : 60), pada penetapan
kadar asam askorbat dalam larutan injeksi obat pemutih kulit merek “X” dapat
memenuhi persyaratan parameter-parameter validasi yaitu selektivitas, linieritas,
akurasi, presisi, dan rentang.

BAB III
METODELOGI PENELITIAN
A. Jenis dan Rancangan Penelitian
Jenis dan rancangan penelitian ini adalah deskriptif non eksperimental,
karena pada penelitian ini tidak dilakukan manipulasi pada subjek uji dan hanya
menggambarkan keadaan yang ada.
B. Variabel Penelitian
1. Variabel bebas
Variabel bebas pada penelitian ini adalah sistem KCKT yang telah
dioptimasi yang meliputi komposisi fase gerak dan kecepatan alir fase gerak yang
telah dioptimasi.
2. Variabel tergantung
Variabel tergantung pada penelitian ini adalah parameter validasi metode
analisis yang meliputi selektivitas, linieritas, akurasi, presisi, dan rentang.
3. Variabel pengacau terkendali
Kemurnian pelarut yang digunakan, untuk mengatasinya digunakan
pelarut dengan kemurnian tinggi, yaitu pelarut pro analysis. Kemurnian baku asam
askorbat yang digunakan, untuk mengatasinya digunakan baku yang telah terjamin
kualitasnya seperti tercantum pada Certificate of Analysis (CoA).
18
19
C. Definisi Operasional
1. Sistem KCKT yang digunakan terdiri dari fase diam berupa kolom
Phenomenex® (250 x 4,6 mm, ukuran partikel 5 µm) dan fase gerak campuran
metanol : 0,01 M bufer fosfat dengan penambahan larutan 0,1 M asam fosfat
hingga pH 3 (40 : 60).
2. Baku asam askorbat yang divalidasi adalah baku yang tercantum pada
Certificate of Analysis (CoA).
3. Penelitian yang dilakukan termasuk dalam validasi metode katergori I, yaitu
metode yang digunakan untuk analisis kualitatif dan kuantitatif komponenutama
dalam suatu matriks. Validasi yang dilakukan meliputi pengukuran terhadap
parameter validasi yaitu selektivitas, linieritas, akurasi, presisi, dan rentang.
D. Bahan Penelitian
Bahan yang digunakan dalam penelitian ini adalah reference standard
asam askorbat (Supelco) dengan kemurnian 98,7% yang tertera pada CoA di
Lampiran 1, metanol grade HPLC (E.Merck), asam fosfat 85% (E.Merck),
kalium dihidrogen fosfat p.a (E.Merck), akua demineralisata (PT. Brataco),
penyaring Whatman 0,45µm, dan produk pemutih kulit merek “X” yang
diperoleh dari online shop “Y”.

20
E. Alat Penelitian
Alat yang digunakan dalam penelitian ini adalah seperangkat alat KCKT
dengan detektor ultraviolet, Shimadzu LC-2010C, kolom C18 merek
Phenomenex® (250 x 4,6 mm, 5 µm), seperangkat komputer (merek Dell
B6RDZ1S Connexant system RD01-D850 A03-0382 JP France S.A.S, printer HP
Deskjet D2566 HP-024-000 625730), UV-Vis Spechtrophotometer SP-3000 plus
merek OPTIMA dengan detektor silicon photo diode, milipore, ultrasonikator
Refsch, Tipe : T460 (Schwing 1 PXE, FTZ-Nr. C-066/83, HF-Frequ:35 kHz),
timbangan analitik SCALTEC (max 60/210 g, min 0,001 g), alat vakum GAST,
dan seperangkat alat gelas yang lazim digunakan di laboratorium analisis.
F. Tatacara Penelitian
1. Pembuatan asam fosfat 0,1 M
Larutan H3PO4 85% diambil sebanyak 0,3 mL, kemudian diencerkan
dengan akua demineralisata 25,0 mL sehingga konsentrasi H3PO4 menjadi 0,1 M.
2. Pembuatan bufer fosfat 0,01 M
Dilarutkan 0,68 g KH2PO4 dalam 500 mL akua demineralisata, kemudian
pH diatur dengan penambahan asam fosfat 0,1 M hingga mencapai pH 3.
3. Pembuatan fase gerak
Fase gerak dibuat dengan mencampur antara metanol dan 0,1 M bufer
fosfat pH 3,0 (40 : 60). Campuran fase gerak tersebut disaring dengan penyaring
Whatman 0,45 µm yang dibantu dengan pompa vakum kemudian didegassing
selama 15 menit menggunakan ultrasonicator.

21
4. Pembuatan larutan stok dan intermediate asam askorbat
a. Pembuatan larutan stok asam askorbat. Ditimbang saksama 20,0 mg asam
askorbat, dilarutkan dalam metanol : bufer fosfat pH 3 (40 : 60) hingga 10,0
mL sehingga kadar lebih kurang 2000 µg/mL.
b. Pembuatan larutan baku intermediate asam askorbat. Sebanyak 1,25 mL
larutan stok diambil dan diencerkan dengan metanol : bufer fosfat pH 3 (40
: 60) hingga 25,0 mL sehingga diperoleh konsentrasi larutan intermediate 100
µg/mL.
5. Pembuatan larutan baku asam askorbat yang digunakan untuk
penentuan panjang gelombang maksimum
Dibuat larutan seri dengan 3 konsentrasi berbeda yaitu 40; 50; dan 60
µg/mL dengan mengencerkan 4,0; 5,0; dan 6,0 mL larutan intermediate
menggunakan metanol : bufer fosfat pH 3 (40 : 60) hingga 10,0 mL.
6. Penentuan panjang gelombang maksimum asam askorbat dengan
spektrofotometer UV-Vis
Masing-masing konsentrasi larutan seri baku asam askorbat 40; 50; dan 60
µg/mL dengan pelarut campuran metanol : bufer fosfat pH 3 (40 : 60), discan antara
panjang gelombang 200-400 nm dengan spektrofotometer UV-Vis. Spektrum yang
dihasilkan akan menunjukkan panjang gelombang maksimumyang akan digunakan
untuk deteksi pada sistem KCKT.

22
7. Pembuatan seri larutan baku asam askorbat
Diambil sejumlah 250; 375; 500; 625 dan 750 µL larutan stok asam
askorbat (2000 µg/mL), kemudian dimasukkan ke dalam labu takar 10,0 mL dan
ditambahkan metanol : bufer fosfat pH 3 (40 : 60) hingga tanda batas, sehingga
didapatkan konsentrasi sebesar 50; 75; 100; 125 dan 150 µg/mL. Larutan disaring
dengan millipore dan didegassing dengan ultrasonicator selama 15 menit,
kemudian diinjek ke sistem KCKT fase terbalik hasil optimasi Jeversoon (2016).
8. Preparasi larutan sampel
Sediaan larutan injeksi obat pemutih kulit merek “X” yang mengandung
200 mg/mL asam askorbat, diambil sebanyak 50 µL dan dimasukkan ke dalam labu
takar 10 mL, diencerkan dengan metanol : bufer fosfat pH 3 (40 : 60) sampai tanda
batas sehingga diperoleh konsentrasi asam askorbat 1000 µg/mL sebagai larutan
stok sampel, kemudian diambil sebanyak 1,4 mL dan dimasukkan ke dalam labu
takar 10 mL, diencerkan dengan metanol : bufer fosfat pH 3 (40 : 60) sampai tanda
batas sehingga diperoleh konsentrasi asam askorbat 140 µg/mL. Larutan sampel
disaring dengan menggunakan milipore dan didegassing dengan ultrasonicator
selama 15 menit.
9. Preparasi adisi baku dalam sampel untuk penentuan akurasi dan presisi
Diambil sejumlah 1,0; 3,0 dan 5,0 mL larutan intermediate asam askorbat
100 µg/mL, kemudian dimasukkan ke dalam labu takar 10,0 mL dan ditambahkan
1,4 mL stok sampel asam askorbat 200 µg/mL ke dalam masing-masing labu takar
dan diencerkan dengan metanol : bufer fosfat pH 3 (40 : 60) hingga batas tanda.
Larutan disaring dengan millipore dan didegassing dengan ultrasonicator selama

23
15 menit, kemudian diinjek ke sistem KCKT fase terbalik hasil optimasi
Jeversoon (2016).
10. Validasi metode analisis
a. Penentuan selektivitas. Sejumlah 20,0 µL larutan sampel yang telah
disaring dengan millipore dan didegassing dengan ultrasonicator selama
15 menit, diinjek ke sistem KCKT fase terbalik hasil optimasi Jeversoon
(2016). Dihitung nilai Rs dari puncak yang diperoleh.
b. Penentuan linieritas. Sejumlah 20 µL larutan baku asam askorbat dengan
konsentrasi 50; 75; 100; 125 dan 150 µg/mL yang telah disaring dengan
millipore dan didegassing dengan ultrasonicator selama 15 menit,
diinjek ke sistem KCKT fase terbalik hasil optimasi Jeversoon (2016).
Replikasi dilakukan sebanyak tiga kali dan dihitung nilai r (koefisien
korelasi).
c. Penentuan akurasi dan presisi adisi baku dalam sampel. Sejumlah 20 µL
larutan sampel dan larutan sampel yang telah ditambahkan larutan baku
asam askorbat (sampel adisi) dengan konsentrasi asam askorbat sebesar
80; 100; dan 120 µg/mL yang telah disaring dengan millipore dan
didegassing dengan ultrasonicator selama 15 menit, diinjek ke sistem
KCKT fase terbalik hasil optimasi Jeversoon (2016). Replikasi dilakukan
sebanyak tiga kali dan dihitung nilai % recovery dan koefisien variasi.
d. Penentuan rentang. Rentang konsentrasi sampel uji yang memenuhi
persyaratan linieritas, akurasi, dan presisi.

24
11. Uji kestabilan larutan baku
Larutan baku asam askorbat dengan konsentrasi 50; 100 dan 150 µg/mL
yang telah disaring dengan millipore dan didegassing dengan ultrasonicator
selama 15 menit, diinjek ke sistem KCKT fase terbalik hasil optimasi Jeversoon
(2016) dalam jam yang berbeda untuk dilihat seberapa besar perubahan
konsentrasi yang dihasilkan dari masing-masing larutan baku. Konsentrasi diukur
dalam pengukuran selama 4 jam. Dihitung nilai persen perubahan yang diperoleh.
G. Analisis Hasil
1. Selektivitas
Selektivitas ditentukan dari kemampuan metode KCKT fase terbalik yang
telah dioptimasi untuk memisahkan asam askorbat dalam larutan injeksi pemutih
kulit. Selektivitas ditentukan dengan parameter resolusi (Rs) dengan
rumus:
(2)
Keterangan: Rs = resolusi
tR1 = waktu retensi puncak analit pertama
tR2 = waktu retensi puncak analit kedua
W1 = lebar dasar puncak pertama
W2 = lebar dasar puncak kedua
Nilai Rs > 1,5 menunjukkan puncak analit telah tepisah sempurna satu
sama lain (Gandjar dan Rohman, 2007).
2. Linieritas
Linieritas dinyatakan dengan koefisien korelasi (r). Konsentrasi larutan
baku asam askorbat yang diperoleh diplotkan terhadap luas puncak pada
25
kromatogram sehingga diperoleh nilai r dari persamaan y = bx + a. Persyaratan
linieritas yang dapat diterima adalah jika memenuhi nilai r ≥ 0,998 (Kazakevich
and Lobrutto, 2007).
3. Akurasi
Akurasi metode dinyatakan dengan nilai % recovery adisi baku yang
dihitung dengan rumus:
(3)
Keterangan: Xn = Konsentrasi larutan n setelah adisi

Xo = Konsentrasi tanpa adisi (blanko)
X’ = Konsentrasi adisi (perhitungan manual)
Akurasi dikatakan baik bila memiliki nilai % recovery antara
98,0-102,0% untuk kadar analit 10-100% (Gonzalez dan Herrador, 2007).
4. Presisi
Presisi dihitung sebagai standar deviasi relatif (RSD) atau koefisien
variasi (RSD), dengan rumus perhitungan:
(4)
Keterangan: RSD = standar deviasi relatif
SD = standar deviasi
Suatu metode dikatakan memiliki keterulangan/presisi yang baik jika
memiliki nilai RSD ≤ 2,0% untuk kadar analit 100% (Gonzalez dan Herrador,
2007).
5. Rentang
Rentang konsentrasi sampel uji yang memenuhi persyaratan linieritas,
akurasi, dan presisi (USP, 2007).

26
6. Uji Kestabilan Larutan Baku
Uji kestabilan larutan baku asam askorbat dihitung dari nilai persen
perubahan, dengan rumus perhitungan:
% perubahan = | | x 100% (5)
Keterangan: Xn = konsentrasi akhir
Xo = konsentrasi awal
Suatu larutan baku dikatakan stabil apabila persen perubahan yang
dihasilkan tidak lebih dari 2% (Ahuja dan Dong, 2005).

BAB IV
HASIL DAN PEMBAHASAN
A. Pembuatan Fase Gerak
Fase gerak yang digunakan dalam sistem KCKT fase terbalik adalah
campuran metanol dan 0,01 M bufer fosfat pH 3 dengan perbandingan 40 : 60 dan
kecepatan alir 0,9 mL/menit. Campuran metanol dan bufer fosfat bersifat polar
sedangkan kolom Phenomenex® C18 yang digunakan sebagai fase diam bersifat
lebih nonpolar, sehingga metode KCKT ini merupakan metode KCKT fase terbalik.
Sistem elusi fase gerak yang digunakan dalam penelitian adalah isokratik karena
pada sistem ini tidak dilakukan perubahan perbandingan selama proses elusi.
Prinsip kerja KCKT adalah memisahkan solut karena adanya perbedaan kecepatan
elusi saat melewati kolom KCKT. Pemisahan ini terjadi karena adanya interaksi
antara analit, fase diam, dan fase gerak (Rohman, 2009). Interaksi yang terjadi
diantara fase diam dan asam askorbat adalah interaksi gaya London, yang
ditunjukkan pada Gambar 3. Interaksi gaya London ini merupakan gaya tarikan
lemah yang disebabkan oleh dipol induksi sesaat pada suatu atom yang terjadi
karena pergerakan elektron dalam suatu orbital (Levita dan Mustarichie, 2012).
Interaksi asam askorbat dan fase gerak (metanol dan bufer fosfat) merupakan
interaksi hidrogen yang ditunjukkan pada Gambar 4. Interaksi hidrogen merupakan
interaksi dipol-dipol yang terbentuk antara suatu hidrogen yang terikat pada gugus
yang memiliki atom elektronegatif dengan suatu atom elektronegatif lain yang
memiliki pasangan elektron bebas.
27
28
Interaksi gaya London

Gambar 3. Interaksi asam askorbat dengan fase diam oktadesilsilan
Gambar 4. Interaksi asam askorbat dengan fase gerak metanol : bufer fosfat
Larutan bufer fosfat terdiri dari KH2PO4, aqua demineralisata, dan asam
fosfat. Aqua demineralisata digunakan sebagai pelarut karena air ini bebas ion
atau mineral karena ion seperti ion tembaga dan besi, ion hidroksida dan kuinon
dapat menyebabkan kecepatan degradasi asam askorbat menjadi asam
dehidroaskorbat meningkat (Wechtersbach and Cigic, 2007). Metanol dan bufer
fosfat digunakan sebagai fase gerak karena dapat melarutkan asam askorbat dengan
baik, tidak berinteraksi dengan analit, tidak toksik, dan memiliki nilai UV cut-off
jauh dari panjang gelombang asam askorbat, metanol memiliki nilai UV cut-off 205
nm (Rohman dan Gandjar), sedangkan nilai UV cut-off bufer fosfat dibawah 200
nm (Supelco, 2001). Penggunaan bufer fosfat sebagai fase gerak agar

29
pH dalam kolom dapat relatif stabil sehingga waktu retensi yang dihasilkan oleh
senyawa asam askorbat menjadi reprodusibel selama tiga menit.
Fase gerak disaring terlebih dahulu menggunakan kertas saring Whatman
dengan bantuan pompa vakum untuk menghilangkan partikel-partikel kecil yang
dapat menyumbat kolom, kemudian fase gerak didegassing dengan ultrasonicator
untuk menghilangkan gelembung-gelembung udara yang dapat menggangu
pengukuran. Larutan metanol dan bufer fosfat masing-masing ditempatkan didalam
chamber fase gerak dengan kapasitas 500 mL.
B. Pembuatan Larutan Baku Asam Askorbat
Baku asam askorbat yang digunakan merupakan reference standard
Supelco dengan kemurnian 98,7%. Larutan baku asam askorbat dibuat dengan cara
melarutkan baku asam askorbat dalam metanol : 0,01 M bufer fosfat pH 3(40 : 60)
yang berperan pula sebagai fase gerak dalam metode KCKT fase terbalik ini. Fase
gerak yang digunakan bersifat polar karena sebagian besar terdiri dari metanol dan
air, sehingga dapat melarutkan asam askorbat yang bersifat polar pula, selain itu
metanol dan 0,01 M bufer fosfat memenuhi syarat sebagai pelarut, yaitu murni,
dapat melarutkan asam askorbat dengan baik, tidak berinteraksidengan analit, dan
tidak toksik. Komposisi pelarut dan fase gerak yang digunakan sama, sehingga
dapat bercampur dan tidak membutuhkan waktu yang lama untuk membentuk
puncak yang stabil.
Larutan baku asam askorbat dibuat dalam volume 10 mL untuk
menghemat pelarut yang digunakan. Konsentrasi larutan stok asam askorbat yang
dibuat adalah sebesar 2000 µg/mL, larutan intermediate 100 µg/mL, larutan seri
30
baku 50; 75; 100; 125 dan 150 µg/mL. Larutan seri baku digunakan dalam
pembuatan kurva baku asam askorbat. Sebelum larutan seri baku dimasukkan ke
dalam vial dan diinjek ke sistem KCKT, larutan tersebut disaring terlebih dahulu
menggunakan millipore untuk menghilangkan partikel-partikel kecil yang dapat
menyumbat kolom, dan didegassing untuk menghilangkan gelembung-gelembung
udara yang dapat menggangu pengukuran.
C. Penentuan Panjang Gelombang Pengamatan Asam Askorbat
Pengukuran panjang gelombang maksimum dilakukan pada tiga
konsentrasi yang berbeda, yaitu 40; 50 dan 60 µg/mL menggunakan pelarut
campuran metanol : 0,01 M bufer fosfat pH 3 (40 : 60). Penggunaan tiga level
konsentrasi bertujuan untuk membuktikan bahwa perubahan konsentrasi sampai
batas tertentu tidak menyebabkan perubahan panjang gelombang maksimum dan
dapat menunjukkan semakin besar konsentrasi yang diukur maka puncak spektra
yang dihasilkan semakin tinggi (berbanding lurus). Spektra asam askorbat dapat
dilihat pada Gambar 5.
Gambar 5. Spektra penentuan panjang gelombang maksimum asam askorbat dalam pelarut
campuran metanol : bufer fosfat (40 : 60) pH 3
31
Gambar 6. Gugus kromofor dan auksokrom asam askorbat
Pada Gambar 5 terjadi kenaikkan tinggi spektra seiring dengan kenaikkan
konsentrasi. Panjang gelombang maksimum asam askorbat menurut Moffat et al.
(2011) adalah 243 nm, sedangkan pada pengukuran didapatkan panjang gelombang
maksimum adalah 244 nm. Asam askorbat dapat memberikan serapan di daerah
UV karena senyawa ini memiliki gugus kromofor dan auksokrom seperti pada
Gambar 6. Menurut Farmakope Indonesia edisi V (2014), pergeseran panjang
gelombang yang digunakan dalam rentang 1 nm dari panjang gelombang teoritis
yaitu di daerah 242-244 nm, sehingga panjang gelombang 244 nm dapat digunakan
dalam pengukuran menggunakan KCKT fase terbalik.
D. Analisis Kualitatif Berdasarkan Waktu Retensi (tR) Asam Askorbat
Sampel injeksi obat pemutih kulit merek “X” memiliki beberapa
kandungan senyawa yang tertera pada label produk, yaitu: asam askorbat, natrium
hidroksida, metil paraben, propil paraben, dan aqua pro injection. Tes identifikasi
dalam sistem KCKT ini menggunakan nilai waktu retensi dari senyawa asam
askorbat yang terdapat dalam baku asam askorbat. Tes ini bertujuan untuk
membuktikan adanya asam askorbat dalam sampel injeksi obat pemutih kulit
merek “X”. Di dalam sampel, asam askorbat dapat diketahui dari nilai waktu
retensi yang mirip dengan nilai waktu retensi asam askorbat pada baku. Waktu
32
retensi asam askorbat yang diperoleh merupakan waktu analit untuk melewati fase
diam dengan bantuan fase gerak.
Gambar 7. Kromatogram baku asam askorbat

Fase diam : Phenomenex® C18 dimensi 250 x 4,6 mm, 5 µm
Fase gerak : metanol : 0,01 M bufer fosfat pH 3 (40 : 60)
Kecepatan alir : 0,9 mL/min
Volume injeksi : 20 µL
Detektor : UV-244 nm
Gambar 8. Kromatogram sampel

Parameter KCKT= Gambar 7
Sistem KCKT pada penelitian ini menggunakan sistem KCKT terbalik
sehingga asam askorbat yang bersifat polar memiliki waktu retensi yang singkat
karena sistem KCKT yang digunakan merupakan sistem KCKT fase terbalik. Pada
Gambar 7 terlihat bahwa baku asam askorbat memiliki waktu retensi selama
33
3,033 menit, dan pada Gambar 8 (kromatogram sampel) terdapat puncak pada
3,033 menit pula. Hal ini menunjukkan bahwa di dalam sampel injeksi pemutih
kulit merek “X” terdapat asam askorbat, sesuai yang tertera pada label produk
tersebut.
E. Validasi Metode Analisis
Validasi metode analisis perlu dilakukan untuk menjamin bahwa hasil
aplikasi metode yang telah dioptimasi dapat dipercaya dan
dipertanggungjawabkan. Validasi metode analisis yang peneliti lakukan termasuk
dalam kategori 1, sehingga parameter validasi yang diuji meliputi selektivitas,
linieritas, akurasi, presisi, dan rentang.
1. Selektivitas
Selektivitas adalah kemampuan suatu metode untuk mengukur dengan
akurat respon analit di antara seluruh komponen sampel (Harmita, 2004). Menurut
Gandjar dan Rohman (2007), puncak analit telah terpisah sempurna satu sama lain
jika nilai Rs > 1,5.
Hasil penelitian dengan menggunakan metode KCKT fase terbalik dengan
fase diam Phenomenex® C18 dan fase gerak metanol : 0,01 M bufer fosfat dengan
penambahan larutan 0,1 M asam fosfat hingga pH 3 (40 : 60) pada panjang
gelombang 244 nm didapatkan nilai Rs hasil pemisahan asam askorbat terhadap
puncak di sebelahnya dalam sampel pada waktu retensi 3,095 menit sebesar 11,443
(Gambar 9) yang menunjukkan bahwa analit terpisah sempurna dengan puncak di
sebelahnya.
34
Gambar 9. Kromatogram asam askorbat yang terpisah dengan puncak di sebelahnya

Parameter KCKT = Gambar 7
Kelemahan pada penelitian ini yaitu tidak dilakukan penginjekan larutan
plasebo dan pembanding asam dehidroaskorbat (degradan utama dari asam
askorbat). Menurut Deutsch dalam Nováková, Solichová, and Solich (2008),
larutan asam dehidroaskorbat memberikan nilai absorbansi kecil pada panjang
gelombang di atas 220 nm, senyawa asam dehidroaskorbat (Gambar 10) memiliki
kepolaran yang mirip dengan asam askorbat. Asam dehidroaskorbat memiliki
gugus kromofor yang lebih pendek daripada asam askorbat, sehingga senyawa ini
memiliki nilai panjang gelombang yang lebih pendek pula daripada nilai panjang
gelombang asam askorbat. Panjang gelombang yang digunakan pada penelitian ini
pada 244 nm dengan konsentrasi asam askorbat yang tinggi, sehingga berdasarkan
teori dapat disimpulkan bahwa asam dehidroaskorbat tidak memberikan gangguan
yang bermakna pada puncak asam askorbat.
Gambar 10. Asam askorbat dan produk degradasinya (Nováková et al., 2008)
35
Di dalam sampel terdapat metil paraben, propil paraben, dan NaOH. Jika
plasebo diinjekkan dalam sistem KCKT fase terbalik pada panjang gelombang
244 nm ini, maka NaOH tidak terdeteksi, puncak metil paraben dan propil paraben
memiliki waktu retensi yang lebih lama daripada puncak asam askorbat. Hal
tersebut disebabkan karena NaOH tidak memiliki kromofor, adanya perbedaan
kepolaran antara asam askorbat, metil paraben, dan propil paraben. Metil paraben
(Gambar 11) dan propil paraben (Gambar 12) yang masing-masing memiliki nilai
log P 2,0 dan 3,0, memiliki index lipofilisitas yang besar dibandingkan dengan
asam askorbat yang memiliki nilai log P -1,8. Berdasarkan teori tersebut, peneliti
dapat menyatakan bahwa puncak asam askorbat terpisah dari puncak matrik
sampel.
Gambar 11. Metil paraben (Moffat et al., 2011) Gambar 12. Propil paraben (Moffat et al., 2011)
2. Linieritas
Linieritas dalam suatu prosedur analisis menunjukkan korelasi yang
proporsional antara respon detektor yang terukur dan konsentrasi analit. Penentuan
linieritas menggunakan persamaan regresi linier pada kurva baku. Pada penelitian
ini, pembuatan kurva baku menggunakan lima seri konsentrasi (ICH, 2005) baku
asam askorbat yang terdiri dari konsentrasi 50; 75; 100; 125 dan 150 µg/mL.
Koefisien korelasi (r) dapat menunjukkan linieritas kurva baku. Nilai r
semakin mendekati satu menunjukkan linieritas yang semakin baik, sehingga

36
dapat digunakan untuk perhitungan kadar analit dalam sampel. Terdapat
pertimbangan lain yang harus diperhatikan dalam pemilihan kurva baku, yaitu nilai
intersept (A) dan slope (B). Nilai A dari persamaan y = Bx+A merupakan baseline
error yang seharusnya pada konsentrasi nol respon yang dihasilkan juga nol, tetapi
jika pada konsentrasi nol terdapat respon maka hal ini dapat mengacaukan data
yang ada, sedangkan nilai B yang diharapkan adalah yang semakin besar atau
mendekati sudut 45o. Pada pemilihan kurva baku digunakan persamaan kurva baku
replikasi I karena nilai A replikasi I yang paling kecil di antara nilai A dari ketiga
replikasi. Kurva baku pada penelitian ini dengan nilai r =0,9989 telah memenuhi
syarat linieritas kurva baku menurut Kazakevich dan Lobrutto (2007).
Persamaan kurva baku yang digunakan adalah y = 70202x – 296485
dengan rentang konsentrasi dari 50 µg/mL sampai dengan 150 µg/mL.
3. Akurasi
Akurasi prosedur analisis menunjukkan kedekatan hasil analisis analit
dengan nilai konsentrasi analit sebenarnya yang diterima. Parameter akurasi dapat
dinyatakan dalam % recovery. Jika asam askorbat yang tertera pada label kemasan
merupakan zat aktif dari sediaan injeksi tersebut dan kadar asam askorbat yang
tertera pada label kemasan berada dalam rentang kadar analit 10-100%, maka
metode ini dapat dikatakan akurat jika memiliki % recovery sebesar 98,0-102,0%.
Pada penelitian ini, % recovery diperoleh dengan menggunakan metode standar
adisi atau metode penambahan baku. Pengukuran dilakukan dengan menambahkan
tiga level konsentrasi baku yang kadarnya diketahui, ke dalam

37
sejumlah sampel yang kadarnya tidak diketahui secara pasti sehingga diukur
sebagai sampel adisi, dilakukan pula pengukuran pada sampel tanpa baku, sehingga
dari kedua pengukuran tersebut didapatkan konsetrasi baku yang terukur dalam
sampel adisi tersebut. Hal ini mengikuti aturan dari ICH bahwa akurasi sebaiknya
dilakukan pada tiga level konsentrasi (80, 100, dan 120%) dan setiap level
konsentrasi dilakukan pengulangan sebanyak tiga kali, sehingga dapat diperoleh
sembilan data % recovery. Selisih antara konsentrasi sampel adisi dan sampel
(tanpa adisi), dibandingkan dengan konsentrasi baku secara teoritis untuk
mendapatkan % recovery. Level konsentrasi rendah, tengah, dan tinggi yang
digunakan pada penelitian ini berturut-turut adalah 80; 100; dan 120 µg/mL.
Tabel VI. Hasil perhitungan % recovery dan RSD baku asam askorbat yang terukur
Konsentrasi asam askorbat (µg/mL) RSD baku

Level % Recovery
Replikasi Sampel Sampel adisi Baku yang terukur
konsentrasi (%)
yang terukur yang terukur yang terukur (%)
I 70,99 82,32 11,32 114,73
Rendah II 72,46 83,47 11,01 7,94 111,51
III 77,00 86,73 9,72 98,49
I 70,99 99,84 28,84 97,41
Sedang II 72,46 99,97 27,51 5,05 92,89
III 77,00 107,43 30,42 102,75
I 70,99 120,83 49,83 100,97
Tinggi II 72,46 122,05 49,59 0,28 100,50
III 77,00 126,85 49,85 101,01
Dalam penelitian ini, nilai % recovery pada konsentrasi rendah adalah
98,49-114,73%, pada konsentrasi sedang adalah 92,89-102,75%, pada konsentrasi
tinggi adalah 100,50-101,01% (dapat dilihat pada Tabel VI). Pada level konsetrasi
rendah, konsentrasi yang digunakan lebih kecil daripada level konsentrasi tinggi,
sehingga perubahan sedikit saja memberikan nilai % recovery dalam rentang yang
lebih luas daripada % recovery level konsentrasi tinggi. Parameter akurasi

38
terpenuhi pada level konsentrasi tinggi, sehingga disarankan untuk melakukan
pengukuran di atas level konsentrasi tinggi (120 µg/mL).
4. Presisi
Menurut Horwitz dalam Gonzalez dan Herrador (2007), suatu metode
memiliki presisi yang baik jika nilai RSD ≤ 2,0% untuk kadar analit 100%. Dalam
penelitian ini, nilai RSD baku asam askorbat dalam sampel adisi yang diperoleh
pada level konsentrasi rendah = 7,94%, level konsentrasi sedang = 5,05%, level
konsentrasi tinggi = 0,28%. Pada level konsentrasi rendah, konsentrasi yang
digunakan lebih kecil daripada level konsentrasi tinggi, sehingga perubahan sedikit
saja memberikan nilai RSD lebih besar daripada nilai RSD level konsentrasi tinggi.
Parameter presisi terpenuhi pada level konsentrasi tinggi.
5. Rentang
Parameter rentang pada penelitian ini tidak terpenuhi karena hanya satu
level konsentrasi yang memenuhi parameter akurasi, presisi, dan linieritas, yaitu
pada level konsetrasi tinggi (120 µg/mL).
F. Uji Kestabilan Larutan Baku
Uji kestabilan larutan baku merupakan hal penting dalam melakukan
analisis untuk kuantifikasi suatu senyawa, terutama untuk senyawa-senyawa yang
labil seperti asam askorbat. Pengujian kestabilan larutan baku asam askorbat
minimal dilakukan dalam rentang waktu dari saat pembuatan larutan baku asam
askorbat hingga berakhir semua pengukuran larutan baku asam askorbat tersebut.
Pada penelitian ini, peneliti melakukan pengukuran larutan baku asam askorbat
39
kurang lebih selama 2 jam, sehingga jika larutan baku tetap stabil selama 2 jam
maka pengukuran asam askorbat selama 2 jam ini dapat digunakan secara pasti
dalam kuantifikasi. Menurut Ahuja dan Dong (2005), larutan baku dapat dikatakan
stabil jika persen perubahan yang terjadi kurang dari 2% selama waktu yang
diperlukan untuk pengukuran yang menggunakan larutan baku.
Pada penelitian ini dilakukan pengujian stabilitas larutan baku pada
konsentrasi 50; 100 dan 150 µg/mL selama 4 jam. Pada Tabel VII menunjukkan
besarnya perubahan yang terjadi pada uji kestabilan larutan baku asam askorbat.
Berdasarkan data pada Tabel VII dapat dilihat bahwa persen perubahan yang terjadi
pada 50; 100 dan 150 µg/mL kurang dari 2%, maka larutan baku asam askorbat
yang diukur selama 4 jam merupakan larutan baku yang stabil dan dapat digunakan
untuk kuantifikasi baik dalam validasi metode analisis maupun pengukuran kadar
asam askorbat dalam sampel.
Tabel VII. Hasil % perubahan uji kestabilan larutan baku asam askorbat konsentrasi
50; 100; dan 150 µg/mL
Kadar Persen perubahan (%) jam

Kadar terukur (µg/mL) pada jam ke-
Teoritis Replikasi ke-
(µg/mL) 0 1 2 3 4 1 2 3 4
I 58,91 58,87 58,86 58,86 58,84 0,064 0,087 0,089 0,119
50 II 54,27 54,27 54,25 54,20 54,18 0,000 0,040 0,135 0,167
III 50,54 50,53 50,53 50,52 50,52 0,028 0,029 0,048 0,050
I 101,09 101,08 101,07 101,05 100,93 0,009 0,022 0,033 0,158
100 II 99,55 99,48 99,48 99,46 99,30 0,068 0,075 0,094 0,248
III 103,14 103,10 103,09 103,07 103,07 0,031 0,048 0,064 0,067
I 148,86 148,83 148,79 148,78 148,74 0,022 0,50 0,053 0,085
150 II 138,74 138,67 138,63 138,56 138,52 0,051 0,075 0,129 0,157
III 143,91 143,91 143,87 143,86 143,82 0,000 0,024 0,033 0,061
BAB V
KESIMPULAN DAN SARAN
A. Kesimpulan
Metode KCKT fase terbalik dengan fase diam Phenomenex® C18 (250 x
4,6 mm, 5 µm) dan fase gerak metanol : 0,01 M bufer fosfat dengan penambahan
larutan 0,1 M asam fosfat hingga pH 3 (40 : 60), pada penetapan kadar asam
askorbat dalam larutan injeksi obat pemutih kulit merek“X” memenuhi
persyaratan parameter selektivitas, linieritas pada konsentrasi 50-150 µg/mL
dengan nilai (r) sebesar 0,9989, akurasi dan presisi pada level konsentrasi tinggi
(120 µg/mL).
B. Saran
1. Perlu ditambahkan plasebo sampel dan baku pembanding asam
dehidroaskorbat pada 6analisis asam askorbat dalam sampel injeksi obat
2. Perlu dilakukan validasi pengukuran menggunakan standar adisi pada
level konsentrasi lebih tinggi daripada 120 µg/mL untuk memperoleh
daerah atau rentang yang memenuhi syarat akurasi dan presisi.
3. Penelitian analisis asam askorbat dapat menggunakan kolom kiral-Pirkle
untuk memisahkan L-asam askorbat dan D-asam askorbat.
40
41
DAFTAR PUSTAKA
Ahuja, S., and Dong, M.W., 2005, Handbook of Pharmaceutical Analysis by

HPLC, vol. 6, Elsevier Inc., USA, pp. 49, 58-62, 138, 384, 210- 211.
Arbab, A.H.H., and Eltahir, M.M., 2010, Review on Skin Whitening Agents,
Khartoum Pharmacy Journal, Vol. 13 (1), pp. 5-7.
Direktorat jenderal Pengawasan Obat dan Makanan Republik Indonesia, 1995,
Farmakope Indonesia, Edisi IV, Departemen Kesehatan Republik
Indonesia, Jakarta, hal. 1009, 1061.
Direktorat jenderal Pengawasan Obat dan Makanan Republik Indonesia, 2014,
Farmakope Indonesia, Edisi V, Departemen Kesehatan Republik
Indonesia, Jakarta, hal. 142, 143, 931, 1323.
Fessenden, R.J., and Fessenden, J.S., 1997, Kimia Organik, Edisi III, Jilid 1,
diterjemahkan oleh Aloysius Handayana Pudjaatmaka, Penerbit
Erlangga, Jakarta, hal. 436.
Gandjar, I.G., dan Rohman, A., 2007, Kimia Analisis Farmasi, cetakan I, Pustaka
Pelajar, Yogyakarta, hal. 220-225, 228-243, 339.
Gonzalez, A.G., and Herrador, M.A., 2007, A Practical Guide to Analytical
Method Validation, Including Measurement Uncertainty and Accuracy
Profiles, Trends in Analytical Chemistry, Department of Analytical
Chemistry, Vol. 26, No. 3, pp. 227-238.
Harmita, 2004, Petunjuk Pelaksanaan Validasi Metode dan Cara Perhitungannya,
Majalah Ilmu Kefarmasian, Vol. 1, No. 3, hal. 117-134.
Jeversoon, E.L.F.K., 2016, Optimasi Komposisi dan Kecepatan Alir Fase Gerak
Metode Kromatografi Cair Kinerja Tinggi Fase Terbalik untuk
Penetapan Kadar Asam Askorbat dalam Sediaan Larutan Injeksi Obat
Pemutih Kulit Merek “X”, Skripsi, Universitas Sanata Dharma
Yogyakarta, Yogyakarta.
Kazakevich, Y., and Lobrutto, R., 2007, More Practical Problem Solving in
HPLC, Wiley-VCH Verlag GmbH & Co. KGaA Weinheim, Germany, p.
34.
Kromidas, S., 2005, More Practical Problem Solving in HPLC, Wiley-VCH
Verlag GmbH, Jerman, p. 34.
Levita, J., dan Mustarichie, R., 2012, Pemodelan Molekul dalam Kimia Medisinal,
Graha Ilmu, Yogyakarta, hal. 22-25.
Lullmann, H., Mohr, K., Ziegler, A., Bieger, D., 2000, Color Atlas of
Pharmacology, Edisi II, Thieme Stuttgrat, New York, p. 18.
42
Moffat, A.C., Osselton, M.D., and Widdop, B., 2011, Clarke’s Analysis of Drugs
and Poisons in Pharmaceuticals, Body Fluids and Postmortem Material,
4th Edition, Pharmaceutical Press, USA, pp. 923, 1670, 1976.
Nováková, L., Solichová, D., and Solich, P., 2008, HPLC Methods for
Simultaneous Determination Ascorbic Acid and Dehydroascorbic Acids,
Trends in Analytical Chemistry, 27 (10), pp. 950, 956.
Rohman, A., 2009, Kromatografi untuk Analisis Obat, Graha Ilmu, Yogyakarta,
hal. 111-116, 217, 223-226, 232, 380.
Sastrohamidjojo, H., 2001, Spektroskopi, cetakan II, Liberty, Yogyakarta, hal. 9.
Snyder, L.R., Kirkland, J.J., and Glajch, J.L., 1997, Practical HPLC Method
Development, 2nd edition, John Wiley & Sons, Inc., New York, pp. 296-
300.
Snyder, L.R., Kirkland, J.J., and Dolan, J.W., 2010, Introduction to Modern
Liquid Chromatography, 3 rd edition, John Wiley & Sons, Inc., New
York, p. 311.
Sulistiyaningsih, R., 2007, Pengujian Potensi Sediaan Injeksi Kering Amoksisilin
dalam Aqua pro Injeksi pada Variasi Suhu Penyimpanan dan Konsentrasi,
Fakultas Farmasi Universitas Padjajaran, Bandung, hal. 4.
Supelco, 2001, Buffered Mobile Phases in Reversed-Phase Liquid
Chromatography, Sigma-Aldrich Co., http://www.lcresources.com,
diakses tanggal 10 Maret 2016.
Suprianto, 2014, Pengembangan Metode Penetapan Kadar Campuran Pemanis,
Pengawet, dan Pewarna Secara Simultan dalam Sirup Esens dengan
Menggunakan Kromatografi Cair Kinerja Tinggi, Tesis, Universitas
Sumatera Utara, Sumatera Utara.
Thongchai, W., Liawruangrath, B., and Saisunee L., 2007, High Perfomance
Liquid Chromatograpic Determination of Arbutin in Skin-Whitening
Creams and Medicinal Plant Extracts, J.Cosmet. Sci., Vol. 58, pp. 35-44.
Ullah, A., Hussain, A., Ali, J., Khaliqurrehman, and Ullah, A., 2012, A Simple and
Rapid HPLC Method for Analysis of Vitamin C in Local Packed Juices of
Pakistan, Middle-East Journal of Scientific Research, Vol. 12 (8), pp.
1085-1091.
United States Pharmacopeial Convention, 2007, United States Pharmacopeia,
Edisi 30, United States Pharmacopeial Convention, Inc., Rockville.
43
Wang, A., Cheng, S., Sheu, C., and Kwan, C., 2011, Simultaneous Determination
of Five Whitening Agents by Ion-Pair Reversed-Phase High Performance
Liquid Chromatography, Int. Journal of Applied Science and
Engineering, Vol. 9 (4), pp. 287-299.
Watson, D.G., 2000, Pharmaceutical Analysis: A Textbook for Pharmacy Students
and Pharmaceutical Chemists, Churchill Livingstone, London, pp. 76- 80.
Wechtersbach, L., and Cigic, B., 2007, Reduction of Dehydroascorbic Acid at Low
pH, Journal of Biochemical and Biophysical Methods, Vol. 70, pp. 767-
772.
44
LAMPIRAN
45
LAMPIRAN 1. Certificate of Analysis (CoA) Baku Pembanding Asam Askorbat

46
LAMPIRAN 2. Etiket sampel “X”
Gambar 13. Etiket sampel

47
LAMPIRAN 3. Kromatogram resolusi pemisahan asam askorbat dan puncak di sebelahnya

pada sampel
Gambar 14. Kromatogram asam askorbat yang terpisah dari puncak di sebelahnya
Rs = 11,443

48
LAMPIRAN 4. Data penimbangan kalium dihidrogen fosfat

Berat (g) 15-01-2016 16-01-2016 08-02-2016 09-02-2016 10-02-2016
Wadah 0,25400 0,25866 0,24792 0,24001 0,23990
Wadah+zat 0,93418 0,93813 0,92840 0,92013 0,92028
Zat 0,68018 0,67947 0,68048 0,68012 0,68038
LAMPIRAN 5. Data penimbangan baku asam askorbat

1. Baku dalam Pembuatan Kurva Baku
Berat (g) Replikasi 1 Replikasi 2 Replikasi 3
Wadah 0,12001 0,11444 0,11980
Wadah+zat 0,14003 0,13444 0,13982
Zat 0,02002 0,02000 0,02002
2. Baku dalam Sampel Adisi

Wadah 0,11202 0,12488 0,12246
Wadah+zat 0,13202 0,14488 0,14246
Zat 0,02000 0,02000 0,02000
3. Baku dalam Pengujian Stabilitas Larutan Baku

Wadah 0,13436 0,12245 0,11844
Wadah+zat 0,15437 0,14244 0,13843
Zat 0,02001 0,01999 0,01999
LAMPIRAN 6. Skema pembuatan larutan baku asam askorbat dan perhitungan kadar
larutan baku
1. Skema pembuatan larutan baku asam askorbat
Timbang seksama sebanyak 20,0 mg asam askorbat.
Larutkan dalam metanol : bufer fosfat pH 3 (40 : 60) dalam labu 10,0 mL hingga batas tanda,
sehingga mendapat stok dengan konsentrasi 2000 µg/mL.
Ambil larutan stok masing-masing sebanyak 250; 375; 500; 625 dan 750 µL ke dalam labu
10,0 mL, tambahkan dengan metanol : bufer fosfat pH 3 (40 : 60) hingga batas tanda sehingga
diperoleh konsentrasi seri larutan baku 50; 75; 100; 125 dan 150 µg/mL.
2. Perhitungan kadar larutan baku asam askorbat

Sebagai contoh pada perhitungan konsentrasi pada kurva baku replikasi 1 berat zat = 0,02002
g, maka konsentrasi larutan stok adalah 20,02 mg/10,0 mL = 2,002 mg/mL. Baku pembanding
yang digunakan memiliki kemurnian sebesar 98,7% konsentrasi stok asam askorbat yang
sebenarnya adalah 2,002 mg/mL x 98,7% = 1,976 mg/mL atau 197,60 µg/mL. Konsentrasi seri
baku:
C1 x V1 = C2 x V2
197,60 µg/mL x 0,25 mL = C2 x 10,0 mL
C2 = 49,40 µg/mL
49
Seri baku V1 (mL) C2 (µg/mL)

1 0,250 49,40
2 0,375 74,10
3 0,500 98,80
4 0,625 123,50
5 0.750 148,20
LAMPIRAN 7. Kromatogram kurva baku asam askorbat

1. Replikasi I
Gambar 15. Kromatogram baku asam askorbat 50 µg/mL Replikasi I

50


51


52
2. Replikasi II
Gambar 20. Kromatogram baku asam askorbat 50 µg/mL Replikasi II


53


54

3. Replikasi III
Gambar 25. Kromatogram baku asam askorbat 50 µg/mL Replikasi III

55

56
57
LAMPIRAN 8. Data Kurva baku asam askorbat

Replikasi I Replikasi II Replikasi III
C (µg/mL) AUC (mAU) C (µg/mL) AUC (mAU) C (µg/mL) AUC (mAU)
49,40 3160706 49,35 2381747 49,40 2980232
74,10 4878178 74,03 4256354 74,10 4611913
98,80 6595833 98,70 6234766 98,80 6713632
123,50 8585494 123,38 7847710 123,50 8626599
148,20 9976942 148,05 10021626 148,20 10469801
A = -296485 A = -1400005 A = -917094
B = 70202 B = 76479 B = 76898
r = 0,9989 r = 0,9992 r = 0,9993
Keterangan: C = konsentrasi baku asam askorbat (µg/mL)
AUC = Area Under Curve (mAU)
Persamaan kurva baku yang digunakan adalah kurva baku replikasi I, yaitu:
y = 70202x - 296485
12000000
y = 70202x - 296485
10000000
Area Under Curve (mAU)
R² = 0,9979
8000000
6000000
Series1
4000000 Linear (Series1)
2000000
50 100 150 200

Konsentrasi (µg/mL)
Gambar 30. Kurva baku asam askorbat replikasi I

58
LAMPIRAN 9. Kromatogram sampel

1. Replikasi I
Gambar 31. Kromatogram sampel Replikasi I

2. Replikasi II
Gambar 32. Kromatogram sampel Replikasi II

59
3. Replikasi III
Gambar 33. Kromatogram sampel Replikasi III

60
LAMPIRAN 10. Kromatogram sampel adisi

1. Sampel adisi level konsentrasi rendah
Gambar 34. Kromatogram sampel adisi level konsentrasi rendah Replikasi I

Gambar 35. Kromatogram sampel adisi level konsentrasi rendah Replikasi II

61
Gambar 36. Kromatogram sampel adisi level konsentrasi rendah Replikasi III
2. Sampel adisi level konsentrasi sedang
Gambar 37. Kromatogram sampel adisi level konsentrasi sedang Replikasi I

62


63
3. Sampel adisi level konsentrasi tinggi
Gambar 40. Kromatogram sampel adisi level konsentrasi tinggi Replikasi I

Gambar 41. Kromatogram sampel adisi level konsentrasi tinggi Replikasi II

64
Gambar 42. Kromatogram sampel adisi level konsentrasi tinggi Replikasi III
65
LAMPIRAN 11. Data AUC sampel dan AUC sampel adisi, perhitungan % recovery,
perhitungan konsentrasi baku yang terukur, perhitungan RSD baku asam askorbat yang
terukur
1. Nilai AUC sampel dan sampel adisi yang terukur
Level Konsentrasi AUC (mAU)

Replikasi
Sampel Sampel adisi
I 4687498 5482436
Rendah II 4790335 5563003
III 5109401 5791819
I 4687498 6712301
Sedang II 4790335 6721307
III 5109401 7245216
I 4687498 8185720
Tinggi II 4790335 8271998
III 5109401 8608726
2. Perhitungan % recovery
Pada konsentrasi rendah replikasi I, AUC sampel = 4687498 dan AUC sampel adisi =
5482436. Konsentrasi sampel dan sampel adisi dihitung menggunakan persamaan kurva baku y
= 70202x – 296485.
Konsentrasi sampel  4687498 = 70202x – 296485
70202 x = 4983983
x = 70,99 µg/mL
Konsentrasi sampel adisi5482436 = 70202x – 296485
70202 x = 5778921
x = 82,32 µg/mL
Konsentrasi baku asam askorbat teoritis = 9,87 µg/mL
% recovery = x 100%
= x 100%
= 114,73%
3. Perhitungan baku asam askorbat yang terukur
Baku asam askorbat yang terukur = konsentrasi sampel adisi – konsentrasi sampel
= 82,32 – 70,99 µg/mL
= 11,32 µg/mL
66
4. Perhitungan RSD asam askorbat yang terukur
Pada konsentrasi rendah rata-rata konsentrasi baku yang terukur = 10,68 µg/mL dan nilai SD =
0,84876, maka nilai % RSD = x 100%
= 7,94%
Konsentrasi asam askorbat

(µg/mL) RSD baku %
Level
Replikasi Baku yang terukur Recovery
konsentrasi Sampel
Sampel yang (%) (%)
adisi
terukur
I 70,99 82,32 11,32 114,73
Rendah II 72,46 83,47 11,00 7,94 111,51
III 77,00 86,73 9,72 98,49
I 70,99 99,84 28,84 97,41
Sedang II 72,46 99,97 27,51 5,05 92,89
III 77,00 107,43 30,42 102,75
I 70,99 120,83 49,83 100,97
Tinggi II 72,46 122,05 49,59 0,28 100,50
III 77,00 126,85 49,85 101,01
67
LAMPIRAN 12. Kromatogram baku asam askorbat untuk pengujian stabilitas larutan baku
asam askorbat replikasi 1, 2, dan 3 pada konsentrasi 50; 100; dan 150 µg/mL
1. Replikasi 1
Gambar 43. Kromatogram uji stabilitas larutan baku 50 µg/mL pada jam ke-0
68

69

70
71


72
73

74

2. Replikasi 2
75


76


77


78


79


80


81


82
3. Replikasi 3


83


84

85

86


87


88


89

90
LAMPIRAN 13. Data AUC uji stabilitas larutan baku, perhitungan % perubahan uji
stabilitas larutan baku asam askorbat
1. Nilai AUC uji stabilitas larutan baku asam askorbat
Kadar AUC (mAU) pada jam ke-

Teoritis Replikasi
0 1 2 3 4
(µg/mL)
I 3839183 3836529 3835568 3835508 3834241
50 II 3513473 3513472 3511963 3508324 3507098
III 3251718 3250717 3250706 3250011 3249954
I 6800041 6799386 6798513 6797668 6788846
100 II 6692055 6687328 6686833 6685483 6674689
III 6943852 6941624 6940396 6939192 6938992
I 10153895 10151630 10148625 10148385 10144997
150 II 9443199 9438254 9435896 9430618 9427940
III 9806002 9805988 9803546 9802681 9799889
2. Perhitungan % perubahan uji stabilitas larutan baku asam askorbat
Pada kadar teoritis 50 µg/mL replikasi I, AUC larutan baku pada jam ke-0 = 3839183 dan AUC
larutan baku pada jam ke-1 = 3836529. Konsentrasi larutan baku pada jam ke-0 dan pada jam ke-
1 dihitung menggunakan persamaan kurva baku y = 70202x – 296485.
Konsentrasi larutan baku pada jam ke-0  3839183 = 70202x – 296485
70202 x = 4135668
x = 58,91 µg/mL
Konsentrasi larutan baku pada jam ke-1  3836529 = 70202x – 296485
70202 x = 4133014
x = 58,87 µg/mL
% perubahan jam ke-1 = | |x 100%
=| | x 100%
= 0,068%
91
Kadar Persen perubahan (%) jam

Kadar terukur (µg/mL) pada jam ke-
Teoritis Replikasi ke-
(µg/mL) 0 1 2 3 4 1 2 3 4
I 58,91 58,87 58,86 58,86 58,840 0,068 0,087 0,089 0,119
50 II 54,27 54,27 54,25 54,20 54,181 0,000 0,040 0,135 0,167
III 50,54 50,53 50,53 50,52 50,517 0,028 0,029 0,048 0,050
I 101,09 101,08 101,07 101,05 100,928 0,009 0,022 0,033 0,158
100 II 99,55 99,48 99,48 99,46 99,302 0,068 0,075 0,094 0,248
III 103,14 103,10 103,09 103,07 103,067 0,031 0,048 0,064 0,067
I 148,86 148,83 148,79 148,78 148,735 0,022 0,50 0,053 0,085
150 II 138,74 138,67 138,63 138,56 138,521 0,051 0,075 0,129 0,157
III 143,91 143,91 143,87 143,86 143,819 0,000 0,024 0,033 0,061
92
Biografi Penulis
Penulis skripsi berjudul Validasi Metode Kromatografi
Cair Kinerja Tinggi Fase Terbalik untuk Penetapan
Kadar Asam Askorbat dalam Sediaan Larutan Injeksi
Obat Pemutih Kulit Merek “X” memiliki nama lengkap
Rosalia Lestari. Penulis lahir di Sintang pada tanggal 1
Desember 1994 sebagai anak ketiga dari empat
bersaudara pasangan Gatot Wibowo dan Magdalena Limah. Pendidikan formal
yang telah ditempuh penulis adalah TK Panca Setya Sintang (1998-2000), SD
Panca Setya 1 Sintang (2000-2006), SMP Negeri 1 Sintang (2006-2009), SMA
Stella Duce 1 Yogyakarta (2009-2012), kemudian tahun 2012 penulis melanjutkan
kuliah di Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma Yogyakarta. Selama kuliah
penulis pernah menjadi asisten dosen mata kuliah Mikrobiologi (2014, 2015, dan
2016), praktikum Kimia Analisis (2015), praktikum Kimia Organik (2015), dan
praktikum Pharmaceutical Analysis (2015). Selain itu penulis juga pernah
mengikuti kegiatan dan organisasi antara lain: Herbal Garden Team (2014-2015),
makrab HGT (2014), pernah mengikuti beberapa seminar yaitu seminar Motivasi
dan Inspirasi untuk Meningkatkan Leadership Competence (2014), Seminar
Motivasi Bong Candra (2013), dan Seminar Menjawab Permasalahan di Indonesia
dengan Kurikulum Baru (2014).

Validasi Metode Kromatografi Cair Kinerja Tinggi Fase Terbalik Untuk Penetapan Kadar Asam Askorbat Dalam Sediaan Larutan Injeksi Obat Pemutih Kulit Merek "X"

Diunggah oleh

Informasi Dokumen

Judul Asli

Hak Cipta

Format Tersedia

Bagikan dokumen Ini

Bagikan atau Tanam Dokumen

Opsi Berbagi

Apakah menurut Anda dokumen ini bermanfaat?

Apakah konten ini tidak pantas?

Hak Cipta:

Format Tersedia

Validasi Metode Kromatografi Cair Kinerja Tinggi Fase Terbalik Untuk Penetapan Kadar Asam Askorbat Dalam Sediaan Larutan Injeksi Obat Pemutih Kulit Merek "X"

Diunggah oleh

Hak Cipta:

Format Tersedia

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

VALIDASI METODE KROMATOGRAFI CAIR KINERJA TINGGI FASE

Diajukan untuk Memenuhi Salah Satu Syarat

Memperoleh Gelar Sarjana Farmasi (S. Farm)

Program Studi Farmasi

Aku akan memberi kelegaan kepadamu”

Tuhan, mama, papa,

Saudara, Sahabat, Teman, dan Almamaterku

Farm.) di Fakultas Farmasi, Universitas Sanata Dharma, Yogyakarta.

Dalam pelaksanaan penelitian hingga selesainya penyusunan skripsi ini,

itu, penulis mengucapkan terima kasih kepada:

1. Aris Widayati, M.Si., Apt., Ph.D. selaku Dekan Fakultas Farmasi

Universitas Sanata Dharma, Yogyakarta.

selaku Dosen Pembimbing yang bersedia membimbing, memberi masukan

penelitian ini hingga penyusunan naskah skripsi.

4. Jeffry Julianus, M.Si. selaku dosen pembimbing akademik atas

pendampingannya dari semester awal hingga akhir ini. Seluruh Dosen

Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma Yogyakarta yang telah

mendampingi, membagi ilmu, dan pengalamannya yang sangat bermanfaat

dalam bidang farmasi.

5. Seluruh Staf laboratorium kimia Fakultas Farmasi Universitas Sanata

membantu dan bersedia direpotkan selama penulis menyelesaikan penelitian

mendoakan dan terus memberikan semangat agar cepat menyelesaikan

skripsi dan kuliah.

teman sekelompok skripsi yang telah berjuang bersama-sama dari awal

penyusunan skripsi hingga selesai.

8. Teman-teman semua yang telah membantu, mendukung, menyemangati

membantu penulis dalam menyelesaikan penelitian ini. Terima kasih atas

berguna bagi perkembangan ilmu pengetahuan.

HALAMAN JUDUL ............................................................................................i

HALAMAN PERSETUJUAN PEMBIMBING ................................................... ii

HALAMAN PENGESAHAN ............................................................................ iii

HALAMAN PERSEMBAHAN ..........................................................................iv

PERNYATAAN KEASLIAN KARYA ............................................................... v

LEMBAR PERNYATAAN PERSETUJUAN PUBLIKASI. ...............................vi

DAFTAR ISI ......................................................................................................ix

DAFTAR TABEL............................................................................................ xiii

DAFTAR GAMBAR ........................................................................................ xiv

DAFTAR LAMPIRAN ................................................................................... xviii

INTISARI ......................................................................................................... xix

BAB I PENDAHULUAN .................................................................................... 1

A. Latar Belakang ............................................................................................ 1

B. Tujuan Penelitian ......................................................................................... 5

BAB II PENELAAHAN PUSTAKA ................................................................... 6

A. Asam Askorbat .......................................................................................... 6

B. Spektrofotometri Ultraviolet ...................................................................... 8

C. Larutan Penyangga (Bufer) ...................................................................... 10

D. Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT) .............................................. 11

E. Validasi Metode Analisis ......................................................................... 13

BAB III METODELOGI PENELITIAN ............................................................ 18

A. Jenis dan Rancangan Penelitian ................................................................. 18

B. Variabel Penelitian ..................................................................................... 18

1. Variabel bebas ........................................................................................ 18

2. Variabel tergantung ................................................................................ 18

3. Variabel pengacau terkendali .................................................................. 18

C. Definisi Operasional .................................................................................. 19

D. Bahan Penelitian ........................................................................................ 19

F. Tatacara Penelitian ..................................................................................... 20

1. Pembuatan asam fosfat 0,1 M ................................................................. 20

2. Pembuatan bufer fosfat 0,01 M ............................................................... 20

3. Pembuatan fase gerak ............................................................................. 20

4. Pembuatan larutan stok dan intermediate asam askorbat ......................... 21

5. Pembuatan larutan baku asam askorbat yang digunakan untuk