A.

PENDAHULUAN

Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT) dikenal juga dengan istilah High Performance
Liquid Chromatography (HPLC). KCKT merupakan perangkat peralatan yang penting dalam
perkembangan dunia analisis bahan baku maupun bahan pencemar. Fungsi utama KCKT
pada dasarnya adalah kemampuannya dalam memisahkan berbagai komponen penyusun
dalam suatu sampel. Kinerja tinggi dari kromatografi awalnya ditentukan oleh ketinggian
tekanannya, namun perkembangan teknologi telah menghasilkan produk kromatografi cair
berkinerja tinggi dengan tekanan yang tidak terlalu tinggi.

KCKT merupakan teknik pemisahan yang masih menjadi idola didunia analisis saat ini.
KCKT digunakan secara luas dalam pemisahan dan pemurnian berbagai sampel dalam
berbagai bidang seperti farmasi, lingkungan, industri makanan dan minuman, industri
polimer dan berbagai bahan baku. KCKT lebih banyak digunakan untuk keperluan
identifikasi (analisis kualitatif), kecuali jika KCKT ini dihubungkan dengan sebuah
spektrometri massa (Mass Spectrometer) atau MS, maka penggunaannya akan lebih
memungkinkan dalam analisis kuantitatif.

Secara umum KCKT digunakan dalam kondisi-kondisi berikut:

1. Pemisahan berbagai senyawa organik maupun anorganik, ataupun spesimen biologis

2. Analisis ketidakmurnian (impurities)
3. Analisis senyawa-senyawa yang tak mudah menguap (non-volatil)
4. Penentuan molekul-molekul netral, ionik maupun zwitter ion
5. Isolasi dan pemurnian senyawa
6. Pemisahan senyawa-senyawa dengan struktur kimia yang mirip
7. Pemisahan senyawa-senyawa dalam jumlah kecil (trace elements)

Kromatografi Cair Tenaga Tinggi (KCKT) atau biasa juga disebut dengan High
Performance Liquid Chromatography (HPLC) merupakan metode yang tidak destruktif dan
dapat digunakan baik untuk analisis kualitatif dan kuantitatif. KCKT paling sering digunakan
untuk :

1. Menetapkan kadar senyawa-senyawa tertentu seperti asam-asam amino, asam- asam

nukleat, dan protein-protein dalam cairan fisiologis;
2. Menetukan kadar senyawa-senyawa aktif obat, produk hasil samping proses sintesis,
atau produk-produk degradasi dalam sediaan farmasi.

Komatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT) merupakan teknik pemisahan senyawa dengan
cara melewatkan senyawa melalui fase diam (stationary phase) dengan menggunakan fase
gerak (mobile phase) mengaliri semua ini. Senyawa dalam kolom akan keluar dari kolom atas
dasar kepolaran yang berbeda, sehingga akan mempengaruhi kekuatan interaksi senyawa
dengan fase diam dan fase gerak.

Dari kromatogram dapat diidentifikasi waktu retensi (tR) dan luas area/tinggi puncak.
Kedua hal ini berguna untuk :
 1. Analisis kualitatif digunakan informasi tR,
2. Analisis kuantitatif digunakan informasi luas
3. Area/tinggi puncak kromatogram

Pada HPLC terdapat kolom terbuka yaitu :

1. Low pressure (tekanan rendah)

2. High pressure (tekanan tinggi 76 bar biasanya memakai satuan kpa/kilo paskal).

Pada HPLC terdapat oven untuk pemanas karena pada partikel kecil, cairan ditekan
terjadi gesekan maka digunakan pendingin dan tekanan tinggi (cairan ditekan menggunakan
pompa kemudian didorong, jika ditarik cairan masuk). Tekanan harus 76 bar, antara fase
diam dan fase gerak terjadi gesekan sehingga temperatur meningkat maka harus diturunkan
(dengan pendingin liebig/ ion exchange) karena ikatannya bisa lepas dan bisa juga terjadi
bleeding.

Temperatur pada HPLC digunakan untuk menjaga temperatur dalam kolom konstan
sehingga KD tetap.

B. PRINSIP DASAR

Kerja HPLC pada prinsipnya adalah pemisahan analit-analit berdasarkan kepolarannya,

alatnya terdiri dari kolom (sebagai fasa diam) dan larutan tertentu sebagai fasa geraknya.
Yang paling membedakan HPLC dengan kromatografi lainnya adalah pada HPLC digunakan
tekanan tinggi untuk mendorong fasa gerak. Campuran analit akan terpisah berdasarkan
kepolarannya, dan kecepatannya untuk sampai ke detektor (waktu retensinya) akan berbeda,
hal ini akan teramati pada spektrum yang puncak-puncaknya terpisah.

Urutan skala polaritas : golongan fluorocarbon < golongan hidrokarbon < senyawa
terhalogenasi < golongan eter < golongan ester < golongan keton < golongan alkohol <
golongan asam.

C. MANFAAT KCKT

Kromatografi Cair Kinerja Tinggi sering kali digunakan untuk beberapa kepentingan,
seperti :

1. Pemisahan sejumlah senyawa organik, anorganik, maupun senyawa biologis

2. Analisis ketidakmurnian (impurities)
3. Analisis senyawa tidak mudah menguap (non volatile)
4. Penentuan molekul-moleku netral, ionik, maupun zwitter ion
5. Isolasi dan pemurnian senyawa
6. Pemisahan senyawa-senyawa yg strukturnya hampir sama
7. Pemisahan senyawa-senyawa dlm jml sekelumit (trace elements)
8. Menetapkan kadar senyawa-senyawa tertentu
 Banyak analisa yang mengutamakan penggunaan KCKT dalam proses kerja mereka, hal
ini dikarenakan KCKT mempunyai beberapa kelebihan dibanding metode Kromatografi
lainnya, diantaranya :

1. Cepat : Waktu analisis umumnya kurang dari 1 jam. Banyak analisis yang dapat
diselesaikari sekitar 15-30 menit. Untuk analisis yang tidak rumit (uncomplicated),
waktu analisi kurang dari 5 menit bisa dicapai
2. Selektif : Berbeda dengan KG, Kromatografi Cair mempunyai dua rasa dimana
interaksi selektif dapat terjadi. Pada KG, gas yang mengalir sedikit berinteraksi
dengan zat padat; pemisahan terutama dicapai hanya dengan rasa diam. Kemampuan
zat padat berinteraksi secara selektif dengan rasa diam dan rasa gerak pada KCKT
memberikan parameter tambahan untuk mencapai pemisahan yang diinginkan.
3. Peka : Detektor absorbsi UV yang biasa digunakan dalam KCKT dapat mendeteksi
kadar dalam jumlah nanogram (10-9 gram) dari bermacam- macam zat. Detektor-
detektor Fluoresensi dan Elektrokimia dapat mendeteksi jumlah sampai picogram (10-
12 gram). Detektor-detektor seperti Spektrofotometer Massa, Indeks Refraksi,
Radiometri, dll dapat juga digunakan dalam KCKT.
4. Kolom dapat dipakai lagi : Berbeda dengan kolom kromatografi klasik, kolom KCKT
dapat digunakan kembali (reusable) . Banyak analisis yang bisa dilakukan dengan
kolom yang sama sebelum dari jenis sampel yang diinjeksi, kebersihan dari solven
dan jenis solven yang digunakan.
5. Ideal untuk molekul besar dan ion : zat – zat yang tidak bisa dianalisis dengan KG
karena volatilitas rendah , biasanya diderivatisasi untuk menganalisis psesies ionik.
KCKT dengan tipe eksklusi dan penukar ion ideal sekali untuk mengalissis zat – zat
tersebut.
6. Mudah memperoleh kembali sampel : Umumnya setektor yang digunakan dalam
KCKT tidak menyebabkan destruktif (kerusakan) pada komponen sampel yang
diperiksa, oleh karena itu komponen sampel tersebut dapat dengan mudah
sikumpulkan setelah melewati detector. Solvennya dapat dihilangkan dengan
menguapkan ksecuali untuk kromatografi penukar ion memerlukan prosedur khusus.

Namun, terdapat pula beberapa kekurangan KCKT yang membuatnya tidak efisien untuk
digunakan, yaitu :

1. Sulit untuk mengidentifikasi senyawa, kecuali jika HPLC dihubungkan dengan

spektrometer massa
2. Jika sampel yang digunakan sangat kompleks, maka resolusi (pemisahan) yang baik
sulit diperoleh
3. Mahal
4. Sampel yang digunakan jumlahnya sedikit
5. Perlu tenaga ahli untuk mengoperasikan

D. RESOLUSI
Merupakan tingkat pemisahan komponen dalam suatu campuran dengan metode
kromatografi direfleksikan dalam kromatogram yang dihasilkan Untuk hasil pemisahan yang
baik, puncak-puncak dalam kromatogram harus terpisah secara sempurna dari puncak lainnya
dengan sedikit tumpang tindih (overlap) atau tidak tumpang tindih.

Resolusi adalah ukuran dari pemisahan efektif puncak analit yang berdekatan.

Resolusi dua puncak dibantu oleh faktor termodinamika, yang menimbulkan partisi dan
pemisahan (yaitu-K), dan itu adalah balas oleh kinetika, yang dapat menimbulkan dispersi
tambahan puncaknya, membuat puncak yang dinyatakan baik jika dipisahkan antar dua
puncaknya.

E. INSTRUMENT KCKT

Komponen utama dalam KCKT adalah juga komponen dalam kromatografi lainnya yaitu
wadah/kemasan fase gerak, fase gerak, pompa KCKT, kolom, fase diam, detektor, dan
perangkat komponen pendukung lainnya.

1. Wadah Fase Gerak

Wadah fase gerak dalam KCKT harus terbuat dari bahan yang bersih dan inert. Wadah ini
dapat menampung sekurang-kurangnya 1-2 liter fase gerak, dan terlebih dahulu harus
dibebasgaskan. Kehadiran gas dalam wadah fase gerak ini akan menimbulkan gelembung gas
pada pompa dan detektor yang akan sangat mengacaukan hasil analisis.

2. Fase Gerak

Fase gerak dalam KCKT harus berupa pelarut, buffer, ataupun reagen dengan tingkat
kemurnian yang sangat tinggi, yaitu suatu cairan yang berderajat KCKT (HPLC grade).
Adanya pengotor dalam fase gerak akan menyebabkan gangguan pada sistem kromatografi.
Partikel-partikel kecil yang terdapat dalam fase gerak yang kurang murni dapat
mengakibatkan kekosongan kolom KCKT.

Fase gerak atau dikenal juga dengan istilah eluen umumnya merupakan campuran
pelarut yang berperan dalam daya elusi dan resolusi analisis. Daya elusi dan resolusi KCKT
ditentukan oleh polaritas keseluruhan pelarut, polaritas fase diam, dan sifat-sifat komponen
dalam sampel.

Secara umum ada 2 tipe fase gerak:

a. Fase gerak/eluen isokratik, yaitu eluen dengan komposisi pelarut yang tidak berubah
selama percobaan kromatografi
b. Fase gerak/eluen gradien, yaitu fase gerak dengan komposisi pelarut yang berubah
selama masa kromatografi

Ada begitu banyak pilihan fase gerak yang dapat kita gunakan (pelarut/larutan) serta
kemungkinan gradiennya akan menghasilkan kesempatan untuk mengoptimalkan pemisahan-
pemisahan campuran kompleks dari segi resolusi maupun waktu. Secara normal elusi
isokratik akan lebih mudah dikerjakan daripada elusi gradien.

Seringkali campuran pelarut merupakan fase gerak yang lebih baik daripada cairan
murni, namun pekerjaan optimasi berbagai komposisi pelarut untuk fase gerak secara coba-
coba tentu tidak mudah dilakukan.

Berdasarkan kepolaran fase gerak dibandingkan fase diamnya, fase gerak dibedakan
menjadi:

a. Fase normal, yaitu fase diam lebih polar dari fase gerak. Kemampuan elusinya akan
meningkat seiring peningkatan polaritas fase gerak.
b. Fase terbalik, yaitu bila fase diam kurang polar dibanding fase geraknya. Kemampuan
elusi akan menurun seiring peningkatan kepolaran fase geraknya.
c. Deret eluotrofik yang merupakan deretan nama-nama pelarut yang disusun
berdasarkan kepolarannya, akan sangat membantu kita dalam pemilihan fase gerak.

Dalam KCKT dengan fase terbalik, fase gerak yang paling sering digunakan adalah
campuran larutan buffer-metabol atau campuran air-asetonitril. Sedangkan dalam fase normal
sering digunakan adalah campuran pelarut-pelarut hidrokarbon dengan pelarut terklorinasi
atau menggunakan pelarut jenis-jenis alkohol.
 3. Pompa

Pompa KCKT harus terbuat dari bahan yag inert terhadap fase gerak. Bahan pompa dapat
terbuat dari: gelas, baja tahan karat, teflon maupun batu nilam. Pompa yang digunakan
sebaiknya mampu memberikan tekanan hingga 5000 psi dan mamp mengalirkan fase gerak
dengan kecepatan 3 ml/menit. Untuk keperluan preparatif, pompa yang digunakan harus
mampu mengalirkan fase gerak dengan kecepatan hingga 20 ml/menit. Ada 2 tipe pompa:

a. Pompa dengan tekanan konstan

b. Pompa dengan aliran fase gerak yang konstan. Pompa tipe ini lebih umum
digunakan.

4. Kolom

Ada 2 jenis kolom pada KCKT, yaitu kolom konvensional dan kolom mikrobor. Untuk
mengetahui perbedaan kolom konvensional dan kolom mikrobor klik disini.

Dalam beberapa hal kolom mikrobor lebih menguntungkan, diantaranya:

a. Kolom mikrobor mengkonsumsi fase gerak hanya 80% dari konsumsi kolom
konvensional. Hal ini disebabkan karena kolom mikrobor mempunyai kecepatan alir
yang lebih lambat (10-100 ul/menit)
b. Aliran fase gerak pada mikrobor yang lebih lambat membuat kolom mikrobor lebih
ideal untuk digabungkan dengan spektrometer massa
c. Sensitivitas kolom mikrobor lebih tinggi karena pelarut yang lebih pekat, sehingga
cocok digunakan dalam analisis sampel berskala kecil, seperti sampel klinis.

Perbedaan kolom konvensional dan mikrobor akan dijelaskan disini :

1. Fase Diam

Kebanyakn fase diam berupa silika yang dimodifikasi secara kimiawi, silika yang tak
dimodifikasi atau polimer-polimer stiren dan divinil benzena.

2. Detektor

Detektor KCKT dikelompokkan menjadi dua golongan yaitu detektor yang bersifat
universal, yaitu detektor yang dapat mendeteksi zat secara umum, tidak bersifat spesifik, dan
tidak bersifat selektif. Contoh detektor yang bersifat universal adalah detektor indeks bias dan
spektrometri massa. Dan jenis detektor lainnya adalah detektor spesifik yang hanya akan
mendeteksi analit secara spesifik dan selektif, seperti detektor UV-Vis, fluoresensi dan
elektrokimia.

Detektor yang ideal akan mempunyai karakteristik berikut:

1. Mempunyai respon terhadap analit yang cepat dan reproduksible

 2. Mempunyai sensitivitas yang tinggi, yakni mampu mendeteksi analit pada kadar yang
sangat kecil
3. Stabil dalam pengoperasiannya
4. Mempunyai sel volume yang kecil sehingga mampu meminimalkan pelebaran pita.
Untuk kolom konvensional 8 ul atau lebih kecil dan 1 ul atau lebih kecil pada kolom
mikrobar.
5. Signal yang dihasilkan berbanding lurus dengan konsentrasi analit pada kisaran yang
luas
6. Tidak peka terhadap perubahan suhu dan kecepatan alir fase gerak

Detektor merupakan bagian integral dari peralatan analitik kromatografi cair ini. Ada
beberapa jenis detektor yang digunakan, dengan pemilihan yang umumnya didasarkan pada
persyaratan sensitivitas, jenis senyawa yang ada dalam sampel, dan faktor-faktor lain seperti
biaya. Detektor yang paling umum didasarkan pada indeks bias dari eluat kolom, karena
hampir semua zat terlarut akan menghasilkan larutan dengan indeks bias yang berbeda
dengan indeks bias pelarut murni. Detektor ini mampu menginderai perbedaan tersebut dan
menghasilkan sinyal-sinyal listrik yang proporsional yang kemudian diperkuat dan direkam
untuk menghasilkan kromatogram. Batasan utamanya adalah sensitivitas; batasan
pendeteksian akan bervariasi sesuai dengan keadaan, yang umumnya sekitar satu mikrogram
zat terlarut.

a. Detektor Spektrofotometri

Deteksi spektrofotometri umumnya hanya dalam daerah ultraviolet. Idealnya,

spektrofometri yang nyata dengan pemilihan panjang gelombang yang sempurna akan
memberikan fleksibilitas yang maksimal untuk mendeteksi berbagai macam zat terlarut
dengan sensitivitas yang sangat baik.

b. Detektor fluorometri

Merupakan detektor yang didasarkan atas fluoresens.

c. Detektor elektrokimia

Lazimnya, larutan efluen dari dalam kolom memasuki sebuah sel dimana larutan tersebut
mengalir diatas permukaan sebuah elektroda yang diberi potensial pada satu harga, dimana
komponen-komponen sampel mengalami reaksi transfer elektron.

5. Perangkat Pendukung Lainnya

Perangkat pendukung lain yang digunakan dalam KCKT dapat berupa komputer,
integrator dan rekorder.
 Dilihat dari jenis fase diam dan fase gerak, KCKT (kolomnya) dibedakan menjadi:

a. Kromatografi fase normal.

Kromatografi dengan kolom konvensional dimana
Fase diam : normal (bersifat polar), misalnya Silika gel
Fase gerak : bersifat non polar
b. Kromatografi fase terbalik
Fase diam : sifatnya non polar, misalnya Silika gel direaksikan dengan klorosilan
Fase gerak : bersifat polar
Keuntungan kromatografi fase terbalik :
- Senyawa yang polar akan lebih baik pemisahannya
- Senyawa ionic dapat dipisahkan
- Air dapat digunakan sebagi pelarut

F. ANALISIS HPLC

HPLC adalah alat yang sangat bermanfaat dalam analisis. Prinsip dasar dari HPLC
adalah memisahkan setiap komponen dalam sample untuk selanjutnya diidentifikasi
(kualitatif) dan dihitung berapa konsentrasi dari masing-masing komponen tersebut
(kuantitatif). Sebetulnya hanya ada dua hal utama yang menjadi krusial point dalam metode
HPLC. Yang pertama adalah proses separasi/pemisahan dan yang kedua adalah proses
identifikasi. Dua hal ini mejadi faktor yang sangat penting dalam keberhasilan proses analisa.

Aplikasi analisis HPLC adalah untuk penentuan kualitatif dan penentuan kuantitatif.

Penentuan Kualitatif
 HPLC digunakan untuk analisa kualitatif didasarkan pada waktu retensi untuk
identifikasi. Identifikasi dapat diandalkan apabila waktu retensi sampel dibandingkan dengan
larutan standar.

Penentuan Kuantitatif

Beberapa hal yang harus diperhatikan agar HPLC dapat dipergunakan untuk penentuan
secara kuantitatif adalah:

a. Parameter percobaan sama antara standar dan sampel

b. Penentuan berdasarkan waktu retensi sampel dan standar yang sama

Penentuan kadar dilakukan berdasarkan hubungan (korelasi) dengan menggunakan

larutan standar seri pada waktu retensi tertentu.

a. Berdasarkan area kromatogram

b. Berdasarkan tinggi puncak kromatogram

Hasil analisa HPLC diperoleh dalam bentuk signal kromatogram. Dalam

kromatogram akan terdapat peak-peak yang menggambarkan banyaknya jenis komponen
dalam sample.

Sample yang mengandung banyak komponen didalamnya akan mempunyai

kromatogram dengan banyak peak. Bahkan tak jarang antar peak saling bertumpuk (overlap).
Hal ini akan menyulitkan dalam identifikasi dan perhitungan konsentrasi. Oleh karena itu
biasanya untuk sample jenis ini dilakukan tahapan preparasi sample yang lebih rumit agar
sample yang siap diinjeksikan ke HPLC sudah cukup bersih dari impuritis. Sample farmasi
biasanya jauh lebih mudah karena sedikit mengandung komponen selain zat aktif. Sample ini
umumnya hanya melalui proses pelarutan saja.

Contoh kromatogram dengan banyak peak

 Kesulitan biasanya dihadapi ketika akan mengidentifikasi suatu kromatogram yang
terdiri atas banyak peak. Untuk mengetahui peak mana yang merupakan milik analat (zat
target analisa) kromatogram dibandingkan dengan kromatogram standard. Cara yang paling
umum untuk mengidentifikasi adalah dengan melihat Retention time (RT). Peak yang
mempunyai RT yang sama dengan standard umumnya akan langsung di vonis sebagai peak
milik analat. Memang senyawa/zat yang sama akan mempunyai RT yang juga sama, dengan
catatan sample dan standard dijalankan dengan kondisi dan sistem HPLC yang sama. Namun
bukan berarti RT yang sama pasti merupakan zat/senyawa yang sama. Disinilah para analis
biasanya terkecoh.

Jadi, melihat RT sebetulnya belumlah cukup untuk mengidentifikasi suatu zat. Hal
lain yang perlu dilihat adalah spektrum 3D dari signal kromatogram. Zat yang sama akan
mempunyai spektrum 3D yang juga sama. Sehingga jika spektrum 3D antara dua zat berbeda,
maka kedua zat tersebut juga dipastikan adalah zat yang berlainan, meskipun memiliki RT
yang sama.

G. APLIKASI HPLC

Beberapa aplikasi HPLC dalam kehidupan :

a. HPLC dengan prinsip kromatografi banyak digunakan pada industri farmasi dan
pestisida.
b. Zat- zat dengan kepolaran berbeda yaitu antara sedikit polar sampai polar dapat
dipisahkan dengan HPLC berdasarkan partisi cair-cair.
c. Asam-asam nukleat dapat dipisahkan dengan kolom penukar ion yang
dikombinasikan dengan kolom butiran berlapis zat berpori.
d. Morfin, heroin dan semacamnya telah dapat dipisahkan dengan rezin Zipax-SAX.
e. Dapat memisahkan vitamin-vitamin yang larut dalam air.
f. Digunakan untuk menentukan berat molekul polimer dan masalah-masalah biokimia.
g.  Kromatografi cairan kinerja tinggi (KCKT/HPLC) digunakan untuk memisahkan
golongan-golongan takatsiri, misalnya terpenoid tiggi, segala jenis senyawa fenol,
alkaloid, lipid dan gula.
h. HPLC cocok digunakan untuk memisahkan minyak atsiri. Minyak atsiri terdiri atas
campuran yang sangat rumit menjadi golongan-golongan senyawa atau memisahkan
golongan senyawa menjadi komponen-komponennya.

1. Analisis Anion Nitrat (NO3-)

Nitrat sebagai hasil proses alami atau industri akan bisa memasuki bahan alam atau
bahan industri seperti air yang sangat dibutuhkan manusia atau untuk kebutuhan industri.
Kandungan dalam jumlah tertentu akan sangat mempengaruhi kualitas air tersebut. Untuk itu
diperlukan suatu metode analisis yang teruji untuk mengukur kandungan nitrtat tersebut.
Dengan menggunakan HPLC sebagai instrumen analisis dan dengan pengembangan metode
dapat diketahui validitas penggunaan HPLC untuk analisis anion nitrat. Dari beberapa model
pemutakhiran HPLC diketahui metode analisis HPLC dengan kolom IC Pak Anion serta
eluen campuran Na-Borat glukonat : Butanol : Asetonitril (1:1:10) dan detektor
Konduktivitas dapat menganalisis ion nitrat dalam air tangki reaktor, dengan batas deteksi
3,661 ppm dan sensitivitas 0,01 ppm serta uji recovery 110,41+ 1,59%.

Validasi HPLC Untuk Analisis Anion Nitrat (NO3-)

2. Analisis Vitamin C

Metode HPLC juga dapat digunakan sebagai dasar dari analisis vitamin C, yakni dalam
menentukan susunan kimianya.Susunan kimia vitamin C ditemukan pada tahun 1933 oleh
ilmuwan Inggris dan Swiss. Isolasi asam askorbat mula-mula ditemukan oleh King dari USA
dan Szent-Gyorgy dari Hungaria. Vitamin ini mempunyai dua bentuk, yaitu bentuk oksidasi
(bentuk dehydro) dan bentuk reduksi. Kedua bentuk ini mempunyai aktivitas biologi. Dalam
makanan bentuk reduksi yang terbanyak. Banyak dehydro dapat terus teroksidasi menjadi
diketogulonic acid yang inaktif.

3. Analisis Ekstrak Etanol Rimpang Tanaman Zingiberaceae

Rimpang tanaman Zingiberaceae pada umumnya mengandung metabolit sekunder

golongan minyak atsiri sebagai zat kandungan yang menguap dan golongan lain berupa zat
yang tidak menguap dan bahkan pada beberapa Curcuma spp. dan Kaempferia spp. terdapat
komponen utama yang terkristalkan dari ekstrak total yang diuapkan pelarutnya (etanol,
heksan) sebagai komponen utama. Banyaknya komponen kandungan dalam rimpang dengan
berbagai polaritas menuntut penggunaan metoda analisis kromatografi instrumental dengan
selektifitas (resolusi) yang tinggi, kromatografi cari kinerja tinggi (HPLC) untuk komponen
yang termolabil, seperti dilakukan untuk stabilitas kandungan gingerol dari rimpang Jahe dan
andrografolid dari Sambiloto.

Untuk mendapatkan metoda HPLC dengan resolusi tinggi dibutuhkan cara eluasi
gradient, dengan program menurun polaritasnya, yaitu mulai dari 10% metanol sampai
metanol 100% dan pada umumnya ditambahkan asam fosfat sebagai cara untuk menekan
ionisasi senyawa metabolit sekunder tanaman yang umumnya bersifat asam, seperti prinsip
pasangan ion.

Sampel analisis HPLC dibuat dari simplisia rimpang bentuk serbuk dimaserasi-perkolasi
dengan pelarut bahan sampai diperoleh perkolat 10 kali berat bahan. Perkolat diuapkan
dengan rotavapor sampai diperoleh kepekatan 1 ml ekstrak = 1 gram serbuk simplisia,
diperoleh suatu ekstrak total. Sebelum ekstrak dianalisis HPLC, dilarutkan kembali dalam
metanol ( 10X), kemudian dilakukan filtrasi melalui " Sepak " (SPE C18 1 X 1 cm) untuk
selanjutnya diinjeksikan sejumlah 20 ul ke HPLC.

Kondisi HPLC dalam penelitian adalah sbb.: Eluasi dilakukan gradien pada kondisi
awal Solvent-A (As-fosfat 0,1 N dalam aquabidestillata) : Solvent B
(Metanol pro HPLC) = 90 10; kemudian program gradien linear selamn 35 menit menuju
100% Metanol, dilanjutkan 15 menit Metanol 100%, dilanjutkan program pencucian kolom
dengan 40% MetOH selama 10menit, dan diakhiri kembali kekondisi awal (10% MetOH)
dalam waktu 5 menit. Kromatogram direkam selama total waktu 60 menit. Setiap kali injeksi
bahan uji (ekstrak) memerlukan waktu 75 menit, kemudian dapat langsung diinjeksikan
bahan uji berikutnya. Analisis HPLC dilakukan pada setiap sampel ekstrak dengan kondisi
eluasi dan deteksi pada panjang gelombang 254 nm 365 nm. Analisis data : Sidik jari HPLC
masing-masing ekstrak dianalisis dan dibedakan berdasarkan jumlah puncak komponen dan
waktu retensinya untuk dicari karakterisasinya jika ada dalam campuran atau dalam produk.

Dari hasil pengamatan kromatogram, dapat disimpulkan bawah pada ekstrak

C.domestica, C.xanthorrhiza dan C.zedoaria, jumlah puncak pada 254nm sama dengan
jumlah puncak yang muncul pada 365nm juga dan jumlah puncak pada 365nm lebih besar
dari pada jumlah puncak 254nm, sehingga untuk membuat sidik jari kromatogram HPLC
terbaik digunakan deteksi pada 365nm. Pada ekstrak Alpinia galanga, Z.cassumunar,
Z.zerumbet dan K.galanga, jumlah puncak pada 365nm sama dengan jumlah puncak yang
muncul pada 254nm juga dan jumlah puncak pada 254nm lebih besar dari pada jumlah
puncak 365nm, sehingga untuk membuat sidik jari kromatogram HPLC terbaik digunakan
deteksi pada 254nm. C heyneana, C aeroginosa, Z offinalis, K pandurata, K angustifolia dan
K rotunda jumlah puncak yang muncul sama pada 254nm dan 365nm lebih kecil dari jumlah
puncak pada 254nm dan pada 365nm, sehirigga untuk pembuatan sidik jari kromatogram
HPLC harus digunakan kombinasi deteksi pada 254nm clan 365nm.

4. Pengukuran Tingkat Kematangan Buah Manggis

 Mutu buah-buahan segar saat ini umumnva masih dievalusi secara manual yang
menggunakan tanda-tanda visual seperti warna kulit. Hasil evaluasi visual yang hanya
menilai sifat fisik bagian luar ini tidak selalu mencerminkan tingkat kematangan dan
kerusakan bagian dalam buah. Bila ingin menentukan mutu bagian dalam buah harus
digunakan cara kimia basah (HPLC) yang bersifat merusak. Dalam menanggulangi masalah
ini perlu dilakukan suatu penelitian mengenai teknologi tertentu yang dapat dimanfaatkan
untuk menentukan mutu bagian dalam buah-buahan secara tidak merusak.

Hasil penelitian tugas akhir yang telah dilakukan menunjukkan bahwa metode
ultrasonik dapat dipakai untuk menentukan tingkat kematangan buah manggis secara tidak
merusak. Berdasarkan basil kalibrasi 80 buah manggis, kecepatan gelombang ultrasonik yang
merambat melalui buah manggis untuk tiap tingkat kematangan mempunvai nilai yang
berbeda-beda. Buah manggis yang masih mentah mempunyai kecepatan gelombang
ultrasonik rata-rata 337.4 m/s, untuk buah setengah matang 369.1 m/s, buah matang 397.4
mis, serta untuk buah Iewat matang mempunyai nilai kecepatan rata-rata 449.6 mis. Nilai
kecepatan rata-rata gelombang ultrasonik yang merambat pada tiap tingkat kematangan buah
digunakan untuk membuat suatu persamaan empiris. Persamaan ini menghubungkan tingkat
kematangan terhadap kecepatan gelombang ultrasonik untuk memperkirakan tingkat
kematangan berdasarkan ultrasonik. diperoleh Tk = 0.0268 V 7.9258.

Persamaan empiris yang diperoleh diuji dengan pengukuran kecepatan pada berbagai
kondisi buah dengan warna visual yang beraneka ragam. Berdasarkan basil uji coba 100 buah
manggis diperoleh perbedaan perkiraan kematangan antara ultrasonik dan warna kulit.
Perbedaan tersebut mencapai 21%, hal ini menunjukkan bahwa warna kulit belum tentu
mencerminkan tingkat kematangan dan kerusakan bagian dalam buah.

5. Pendugaan Kandungan Senyawa Bioaktif Atau Senyawa Penciri Beberapa

Tanaman Obat

Secara kualitatif dan kuantitatif suatu senyawa aktif dapat diketahui antara lain
melalui metode HPLC (High Performance Liquid Chromatography) dan FTIR (Fourier
Trasfrorm Infrared). Penentuan kandungan senyawa aktif atau senyawa penciri dilakukan
melalui proses yang panjang meliputi penghancuran bahan, pelarutan, dan pengukuran
dengan HPLC dan FTIR. Proses ini memerlukan waktu dan biaya yang relatif mahal. Untuk
itu sangat diperlukan metode yang handal tetapi relatif mudah untuk dioperasikan. Alternatif
cara penentuan lain yang menyatakan hubungan antara kandungan senyawa aktif atau penciri
hasil pengukuran HPLC dengan data hasil pengukuran FTIR (absorban).

Ketersediaan model ini akan menghemat waktu dan biaya. Pada tahun pertama
dilakukan penentuan metode ekstraksi terbaik untuk senyawa aktif Gingerol dan Kurkumin
yang berasal dari hasil pengamatan contoh petani jahe dan temulawak daerah Kulonproggo
dan Karanganyar. Pada tahun pertama penyusunan model kalibrasi menggunakan dua sumber
yaitu data simulasi dan data pengamatan petani jahe dan temulawak daerah Kulonprogo dan
Karanganyar. Pendekatan terbaik untuk kalibrasi yang diperoleh pada tahun pertama
digunakan untuk penyusunan model kalibrasi data persentase transmitan Gingerol dan
Kurkumin tanaman hasil percobaan pada tahun kedua. Model kalibrasi yang diperoleh pada
tahun kedua merupakan model terbaik berdasarkan data simulasi, data hasil pengamatan
(Karanganyar dan Kulonprogo) serta data hasil percobaan. Pada tahun ketiga dilakukan
validasi model kalibrasi yang diperoleh apda tahun sebelumnya dengan cara menerapkannya
pada data konsentrasi dan persentase transmitan Gingerol dan Kurkumin yang berasal dari
hasil pengamatan jahe dan temulawak yang diambil dari contoh Bogor, Cianjur, Kuningan,
Majalengka dan Sukabumi.

DAFTAR PUSTAKA

Shafaati and B.J.Clark.J Pharm. Biomed. 1996 Anal.14,1547-1554

Christian G.D., 2003, Analytical Chemistry, Sixth, John Wiley & Sons Inc,New York

Mulja.Muhammad, Suharman,1995, Analisis Instrumental, Airlangga University Press,

Surabaya

Sastrohamidjojo,Harjono, 2005, Kromatografi, Universitas Gadjah Mada, Yogyakarta

Skoog,DA,Holler,FJ,and West DM,1994, Analytical Chemistry, Six Edition,Hardcourt Grace

College,Florida

Underwood,A.L, 1996, Analisis Kimia Kuantitatif, 554, Penerbit Erlangga, Jakarta

Watson, D.G.,1999,Pharmaceutical Analysis, Churchill Livingstone,Edinburg