General

Tumbuhkan isolat dari tube

gliserol pada media LB broth,
inkubasi 24 jam 37C

Isolasi DNA dg kit

Favorprep (FK Unram

Mengukur A260/280 dengan nanodrop (r. isolasi

covid)

Simpan di -80

PCR blaSHV, blaTEM, RAPD-PCR 1247,1274,

blaCTX-M dilakukan 1283 dilakukan masing-
masing-masing masing

Prosedur Isolasi DNA dari Koloni (FavorPrep Tissue Genomic DNA Extraction Mini Kit)
Perhatikan!
Tambahkan 1.1 ml sterile ddH2O ke tabung Proteinase K untuk membuat 10 mg/ml stock
solution. Vortex dan pastikan sudah terlarut semuanya. Begitu sudah terlarut simpan pada suhu
4 °C.
Tambahkan ethanol (96- 100 %) pada W1 Buffer dan Wash Buffer ketika saat pertamakali
buka
Panaskan dry bath atau water bath sebelum memulai isolasi DNA satu 60 °C untuk Langkah no.
4 dan 70 °C untuk langkah 7.
Lakukan pemanasan buffer elusi sampai suhu 70 °C untuk langkah 13.
Semua sentrifugasi dilakukan pada kecepatan penuh (~ 18,000 x g) in a microcentrifuge

Langkah Isolasi DNA

1. Vorteks 5-10 detik media pertumbuhan LB broth, ambil 1 ml masukan dalam tabung
microcentrifuge.
2. Ambil sel dengan sentrifugasi 18,000 x g selama 2 menit dan buang supernatant
seluruhnya.
3. Tambahkan 200 µl FATG1 Buffer campur dengan pippete tip
4. Tambahkan 20 µl proteinase K (10mg/ml) ke sampel, vortex
5. Inkubasi pada suhu 60°C selama 1 jam. Vortek sesekali selama inkubasi (dapat diinkubasi
overnight untuk lisis sempurna
6. Tambahkan 200 µl FATG2 Buffer ke sampel, vortex dan inkubasi 70°C selama 10 menit
7. Tambahkan 200 µl ethanol (96-100%), vortex
8. Spin secara singkat untuk menurunkan air pada tepi tabung
 9. Tuang campuran sampel ke FATG Mini Column yang sudah terpasang collection tube.
Sentrifugasi 18.000xg selama 1 menit, tempatkan FATG mini column pada collection tube yang
baru
10. Tambahkan 400 µl buffer W1 (yang sudah ditambah ethanol) ke Mini column, sentrifugasi
(18.000x g) selama 1 menit lalu buang cairan di collection tube
11. Tambahkan 750 µl wash buffer(yang sudah ditambah ethanol) ke FATG Mini column,
sentrifugasi (18.000xg) selama 1 menit lalu buang cairan collection tube
12. Ulang sentrifugasi selama 3 menit untuk mengeringkan column
13. Tambahkan 50-100 µl preheated Elution buffer atau ddH2O (pH 7.5-9.0) ke tepat ke tengah
membrane FATG mini column. Tegakkan tabung selama 3 menit untuk inkubasi
14. Sentrifugasi (18.000xg) selama 2 menit untuk mendapatkan DNA
15. Simpan dalam suhu -80

PCR blaESBL genes (SHV, TEM and CTX-M)

Reaksi PCR ini merupakan PCR monoplex, dikerjakan untuk masing-masing primer

Yang dikerjakan 34 sampel ditambah dengan ATCC 25922 sebagai control negative ESBL

Master mix ExcelTaq™ 5X PCR Master Dye Mix

Template 20 ng
Forward primer (masing2
1.25mM
SHV,TEM, CTX-M)
Reverse primer (masing2
1.25mM
SHV,TEM, CTX-M)
5X PCR Master Dye Mix 10 µl
ddH2O to 50 µl
Total volume 50 µl

PCR gen blaSHV

94°C 5 menit
94°C 30 detik 32 siklus
54°C 30 detik
72°C 1 menit
72°C 10 menit
PCR gen blaTEM

94°C 5 menit
95°C 30 detik 32 siklus
54°C 1 menit
72°C 2 menit
72°C 5 menit
PCR gen blaCTX-M
 94°C 5 menit
95°C 30 detik 32 siklus
54°C 1 menit
72°C 2 menit
72°C 5 menit

Gel analisis

Dirunning: dalam 1 gel setiap primer (TEM, SHV atau CTX-M) dengan sampel (34 sampel, ATCC25922
dan ladder)  ada 3 set gel

100bp ladder, Gel agarose 1%, 25µg ethidium bromide dalam buffer tris EDTA

No Primer blaESBL Tidak diklaster Jumlah gel

1 TEM (34 sampel, marker, ATCC) 1-2 gel
2 SHV (34 sampel, marker, ATCC) 1-2 gel
3 CTX-M (34 sampel, marker, ATCC) 1-2 gel

PCR-RAPD

Master mix ExcelTaq™ 5X PCR Master Dye Mix (Primer 1247 dan 1283)

Template 2.5µL
primer 2µM
5X PCR Master Dye Mix 10 µl
ddH2O to 25 µl
Total volume 25 µl

Reaksi PCR 1247

95°C 15 menit
94°C 1 menit 35 siklus
38°C 1 menit
72°C 2 menit
72°C 10 menit

Reaksi PCR 1283

95°C 15 menit
94°C 1 menit 35 siklus
36°C 1 menit
72°C 2 menit
72°C 10 menit

Master mix ExcelTaq™ 5X PCR Master Dye Mix (Primer 1274)

 Template 3µL
primer 1274 1.6µM (1 µl)
5X PCR Master Dye Mix 10 µl
ddH2O to 25 µl
Total volume 25 µl

Reaksi PCR 1247

94°C 30 detik 2 siklus

42°C 7 detik
72°C 70 detik
94°C 1 detik 38 siklus
42°C 7 detik
72°C 70 detik
72°C 5 menit

Gel analysis

Gel agarose 1.5%, 80V selama 75 menit. Gel diwarnai dengan 0.5µg/ml ethidium bromide selama 15
menit menggunakan geldoc (Salehi, 2008)

Gel agarose 2% (Nielsen, 2014)

Analisis gen dilakukan pada masing-masing primer dan masing-masing cluster sampel seperti pada table
dibawah

No Primer RAPD Klaster ayam Klaster peternak Klaster non peternak Jumlah gel
1 1247 (21 sampel, (7 peternak, (6 peternak, marker, 2-3 gel
marker, ATCC) marker, ATCC) ATCC)
2 1283 (21 sampel, (7 peternak, (6 peternak, marker, 2-3 gel
marker, ATCC) marker, ATCC) ATCC)
3 1247 (21 sampel, (7 peternak, (6 peternak, marker, 2-3 gel
marker, ATCC) marker, ATCC) ATCC)

PCR 16S rRNA (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3163913/)

The universal primers (Forward primer 5'- AGAGTTTGATCCTGGCTCAG -3' and reverse primer 5'-
CTTGTGCGGGCCCCCGTCAATTC-3')

Master mix ExcelTaq™ 5X PCR Master Dye Mix

Template 10 ng
Forward primer (16S rRNA) 10 p mol

Reverse primer (16S rRNA) 10 p mol

5X PCR Master Dye Mix 10 µl
 ddH2O to 50 µl

Total volume 50 µl
94°C 3 menit
94°C 30 detik 30 siklus
55°C 30 detik
72°C 1 menit
72°C 10 menit

Gel analisis

100bp ladder, Gel agarose 1%, dengan ethidium bromide 8V/cm

No Primer blaESBL Tidak diklaster Jumlah gel

1 TEM (34 sampel, marker, ATCC) 1-2 gel
 Peternak Non Peternak Ayam
17 ESBL-Ec 11 ESBL-Ec 70 ESBL-C

Pemeriksaan molekuler pada 1 isolat yang mewakili kelompok isolat

dengan pola antibiogram yang sama, yang berasal dari satu klaster
sampel (Peternak, non peternak atau ayam)

Peternak Non Peternak Ayam

7 ESBL-Ec 6 ESBL-Ec 21 ESBL-C

Ekstraksi DNA

PCR 16SrRNA

Duplo
34 DNA 34 DNA

PCR blaESBL kesesuaian PCR-RAPD (3 primer: 1274,

dengan blaSHV, blaTEM dan 1247, 1283) analisis gel
blaCTX-M dirunning perklaster sampel