Nama : Aini Sarifah

NRP : 142017066

Viral templates for gold nanoparticle synthesis

{ Joseph M. Slocik,a Rajesh R. Naik,b Morley O. Stoneb and David W. Wright*a

Received 25th August 2004, Accepted 10th November 2004 First published as an
Advance Article on the web 21st December 2004 DOI: 10.1039/b413074j

1. Pendahuluan
Alam menunjukkan banyak keragaman struktural di pengendalian biosintesis
bahan anorganik. Contohnya peptida phytochelatin kecil yang digunakan untuk
mendetoksifikasi logam berat dan protein penyimpan feritin besar yang secara
internal termineralisasi partikel oksida besi. Peptida kecil menampilkan domain
pengikatan logam yang dapat diprogram, sedangkan protein menawarkan kontrol
struktural yang sangat baik melalui perancah arsitektur yang besar. Template ini
menyediakan sistem model yang luar biasa untuk sintesis biomimetik berbagai
nanopartikel. Secara khusus, feritin dan feritin analog telah ditunjukkan untuk
mengontrol mineralisasi substrat logam atipikal di dalam kandang protein
menghasilkan nanopartikel terenkapsulasi yang mempertahankan dimensi rongga
protein.1–4 Baru-baru ini, virus telah dieksploitasi sebagai template terbatas
untuk mengarahkan sintesis partikel nano .
Sebagai templat, virus menawarkan ruang terbatas, simetri tinggi, kapsid
protein fungsional yang kuat, arsitektur struktur yang unik, motif berulang, dan
dapat menerima manipulasi biologi molekuler. Contoh umum dari templat virus
termasuk virus mosaik tembakau tipe liar (TMV) 7-9 dan virus bintik klorotik
kacang tunggak (CCMV). Young et al. telah merancang kandang virion CCMV
dengan permukaan interior anionik yang secara istimewa mengikat ion FeII dan
FeIII dengan secara genetik mengganti sembilan residu basa di N-terminus
dengan gugus asam glutamat.1 Hal ini menghasilkan hidrolisis oksidatif yang
dikendalikan secara spasial dengan ukuran nanopartikel oksida besi yang
dibatasi .Jadi dengan mengubah lingkungan elektrostatis tempat dari kationik
dalam keadaan aslinya (menstabilkan inti RNA anionik) menjadi anionik melalui
mutasi genetik, kemanjuran partikel CCMV yang direkayasa sebagai template
nanopartikel . Selain itu, kami menyajikan pendekatan yang berbeda untuk
sintesis partikel nano yang dimediasi virus yang memanfaatkan kimia permukaan
yang unik dan topologi kapsid dengan pemilihan prekursor logam

2. Bahan
a. oligonukleotida mutagenik
b. virus mosaik tembakau tipe liar (TMV)
c. Pichia pastoris
d. Natrium asetat pH 4
e. Asam askorbat
f. EDTA
g. Cesium klorida
h. natrium fosfat pH 7,5
 i. air suling
j. antibodi poliklonal
k. SubE (yeast)
l. (HRE) -SubE,
m. wild type
n. AuClP
o. prekursor AuI
p. NaBH4
q. Dietilpirokarbonat
r. AuClP (CH3) 3

3. Metode
a) template virus
 Sembilan asam amino N-terminal pertama dari SubE diganti dengan
urutan HRE menggunakan primer oligonukleotida mutagenik.
 Fusi HRE-SubE diekspresikan dan dimurnikan dari Pichia pastoris
(Invitrogen, Carlsbad)
 Sel-sel disuspensi kembali dalam buffer homogenisasi (0,2 M natrium
asetat pH 4,8, asam askorbat 10 mM, EDTA 10 mM) dan dipecah dalam
bead beater menggunakan glass bead selama 5 menit.
 Ekstrak kemudian disentrifugasi dengan kecepatan 13.000 rpm selama 20
menit. Supernatan dikumpulkan dan diputar pada 25.000 rpm selama 2
jam untuk membuat partikel virus menjadi butiran.
 Partikel virus disuspensi kembali dalam buffer A (0,1 M natrium asetat
pH 4,8, 1 mM natrium azida, 1 mM EDTA) dan kemudian dioleskan ke
39% cesium klorida (disiapkan dalam buffer A) dan disentrifugasi pada
38.000 rpm pada 4 C untuk 18 jam
 Pita virus dikumpulkan dan didialisis menjadi 10 mM dapar natrium
fosfat pH 7,5 atau air suling ganda
 Kehadiran HRESubE dalam fraksi yang dikumpulkan dikonfirmasi
dengan imunoblot menggunakan antibodi poliklonal yang diproduksi
melawan CCMV dan analisis TEM yang dimurnikan

b) Sintesis reduktif AuClP (CH3) 3 / prekursor virus

 20 mL SubE (yeast), (HRE) -SubE, dan wild type ditambahkan ke 750
mL air dan 2 mg AuClP (CH3) 3 padat secara anaerob bersama dengan
batang pengaduk mikro dalam tabung microfuge 1,5 mL.
 Virus dan prekursor AuI diaduk selama 18 jam. Setelah pengadukan,
campuran disentrifugasi selama 30 menit pada 10.000 RPM dan
supernatan dihilangkan dari AuClP (CH3) 3 padat yang tidak bereaksi.
 50 mL NaBH4 5 mM kemudian ditambahkan tetes demi tetes ke
kompleks prekursor-virus dan diinkubasi selama 4.

c) modifikasi virus
 10 mL (HRE) -SubE virus ditambahkan dengan 2 mL (DEPC)
dietilpirokarbonat (16 mM) dalam 0,5 mL 50 mM fosfat buffer pH 6.0
dan diinkubasi selama 16 jam.
 Modifikasi histidin terdeteksi secara spektrofotometri pada 240 nm.
DEPC berlebih dihilangkan dari virus yang dimodifikasi dengan
 penyaringan Centricon (NMWL 5000 / Millipore) dengan air dan
diulangi.
 Virus modifikasi yang dimurnikan dalam air diperiksa seperti di atas
dengan AuClP (CH3) 3.

4. Kesimpulan

Penambahan AuCl4 2 ke SubE (yeast), (HRE) -SubE, dan virus wildtype

menyebabkan reduksi cepat untuk membentuk nanopartikel Au0 (baik secara aerobik
maupun anaerobik). Penambahan AuCl4 2 berturut-turut menghasilkan jumlah
maksimal emas yang berkurang per partikel virus sebanyak 61.989 atom Au0.
Akibatnya, analisis sekuens CCMV mengungkapkan adanya empat residu tirosin di
dekat C-terminus dari setiap subunit yang ketika dirakit memanjang dari permukaan
virus menyajikan beberapa situs reduksi. Tirosin bertindak dalam reduksi emas
dengan mengikuti peluruhan fluoresensi tirosin saat dioksidasi dan dipadamkan
selama reduksi. Fluoresensi sepenuhnya padam dalam waktu 17 menit setelah
menambahkan AuCl4 2 dan berkorelasi dengan peningkatan pita absorbansi plasmon
dari nanopartikel Au0.
Peptida HRE dan YHRE menunjukkan kurangnya pembentukan nanopartikel
karena tidak adanya reduktor endogen, sedangkan peptida Y4HRE menunjukkan
reduksi emas kecil. Karena beberapa Au3 + perlahan-lahan direduksi oleh peptida,
sebagian besar emas mengikat di situs histidin, mencegah reduksi segera. Hal ini
menunjukkan bahwa rasio tirosin terhadap residu histidin sangat penting agar reduksi
terjadi dan memerlukan setidaknya rasio 2: 1 seperti pada sistem virus. Sebaliknya,
tirosin tripeptida berhasil memediasi pembentukan nanoclusters Au0 ketika bereaksi
pada rasio molar 1: 1.