MEDIA, STERILISASI,

ISOLASI, PEREMAJAAN
DAN PENYIMPANAN
MIKROBA
 MEDIA
• Untuk pertumbuhan dan perkembangan mikroba,
diperlukan substrat yang disebut media.
• Media sebelum dipergunakan harus dalam
keadaan steril, artinya tidak ditumbuhi oleh
mikroba lain yang tidak diharapkan.
• Susunan bahan, baik berbentuk bahan alami
(seperti kecambah kacang hijau/tauge, kentang,
daging, telur, wortel dan sebagainya) ataupun
bahan buatan (berbentuk senyawa kimia baik
organik ataupun anorganik) dpt dipergunakan
untuk pertumbuhan dan perkembangan mikroba
 Persyaratan media

• Harus terkandung semua unsur hara yang

diperlukan untuk pertumbuhan dan
perkembangan mikroba.
• Media harus mempunyai tekanan osmosa,
tegangan permukaan, dan pH yang sesuai dengan
kebutuhan mikroba.
• Media harus dalam keadaan steril, artinya
sebelum ditanami mikroba yang diinginkan,
media tidak ditumbuhi oleh mikroba lain yang
tidak diharapkan.
 Bentuk Media

Media padat
media semi padat atau semi cair
media cair
 Susunan Media
1. Kandungan air
2. Kandungan nitrogen, baik berasal dan protein,
asam amino dan senyawa lain yang
mengandung nitrogen
3. Kandungan sumber energi/unsur C, baik yang
berasal dan karbohidrat, lemak, protein
senyawa-senyawa lain
4. Ion-ion baik sebagai unsur makro ataupun
unsur mikro
5. Faktor pertumbuhan, umumnya vitamin dan
asam amino
 ISOLASI MIKROBA

Isolasi mikroba bertujuan

untuk memperoleh mikroba
tertentu sehingga akan
diperoleh biakan
murni/spesies tunggal.
 Biakan Murni

• Untuk diagnosis bakteriologis sebaiknya

biakan bakteri berada dalam keadaan murni
atau tidak tercampur dengan bakteri-bakteri
lain.
• Biakan murni diperlukan untuk mempelajari
ciri-ciri koloni, sifat-sifat biokimia, morfologi,
reaksi pengecatan (pewarnaan), reaksi
imunologi, dan kerentanan bakteri terhadap
zat antibakteri
 Pada umunya biakan murni dapat diperoleh dengan
cara-cara sebagai berikut:

• Cara Penggarisan
Cara penggarisan dilakukan pada medium
pembiakan pada bentuk lempeng/cawan petri. Bila
dilakukan dengan baik cara ini yang paling praktis.
tujuannya untuk membuat garis sebanyak mungkin
pada permukaan lempeng medium pembiakan
menggunakan jarum ose, bahan pemeriksaan yang
terlepas pada garis-garis tersebut semakin lama
semakin sedikit. Sehingga pada garis-garis terakhir
koloni-koloni bakteri yang berbentuk akan terpisah
agak jauh.
• Sebelum dilakukan penanaman harus
diperhatikan agar permukaan lempeng
medium pembiakan itu kering, bila masih
terdapat tetes air, perlu dikeringkan dahulu
dengan cara menyandarkan pinggan cawan
petri terbalik pada tepi tutupnya.
 Cara Tuang

• Isolasi bakteri dengan cara tuang ini umumnya

dilakukan untuk menentukan perkiraan
jumlah bakteri hidup dalam suatu cairan,
misalnya air, susu.
• Hasilnya dinyatakan dalam jumlah koloni, yang
berarti jumlah bakteri hidup dalam tiap
mililiter cairan yang diperiksa.
 Cara pengerjaannya adalah sebagai berikut:

• Dari suspensi bahan pemeriksaan dibuat pengenceran.

• Dari tiap pengenceran diambil satu mililiter dan
diletakkan ke dalam pinggan petri steril.
• Ke dalam tiap pinggan petri tersebut dituang medium
pembiakan yang telah dicairkan dan didinginkan
sampai suhu kira-kira 40 – 45oC.
• Dengan perlahan-lahan pinggan petri itu digoyang
dengan gerakan memutar tanpa diangkat dari
permukaan meja, sehingga bahan pemeriksaan
tercampur rata dalam medium pembiakan kemudian
didiamkan sampai beku.
• Inkubasi dilakukan pada suhu yang sesuai selama
18 - 20 jam, kemudian koloni-koloni dihitung.
• Ketelitian dalam hal menghitung bakteri terdapat
pada lempeng-lempeng yang mengandung
jumlah antara 30 - 300 koloni.
• Bila telah diperoleh koloni-koloni yang terpisah
dapat dibuat biakan murni dengan cara
memindahkan koloni itu ke dalam medium
pembiakan miring (slant) untuk diperbanyak atau
disimpan untuk keperluan lain.
 Caranya sebagai berikut:
Dari satu koloni yang terpisah diambil seperempat bagian
untuk dibuat preparat pengecatan. Hal ini perlu untuk
mengetahui morfologi dan reaksi pengecatan, dan
kemurnian koloni.
• Bila preparat menunjukkan bahwa koloni itu murni
terdiri dari satu jenis dan sesuai dengan yang
diperlukan, maka dari sisa koloni diambil lagi sebagian
untuk persediaan atau untuk kelanjutkan pemeriksaan.
• Sisa selanjutnya dipakai untuk periksaan sifat-sifat
biokimia, seperti penamaan dalam deretan gula, gerak
dan sebagainya. Bila dalam hal ini diperoleh hasil yang
meragukan, pemeriksaan ini dapat diulang dengan
menggunakan biakan murni dari pertumbuhan dalam
medium miring.
 Sterilisasi
• Sterilisasi dalam mikrobiologi berarti
membebaskan tiap benda atau substansi dari
semua kehidupan dalam bentuk apapun.
• Untuk tujuan mikrobiologi dalam usaha
mendapatkan keadaan steril, mikroorganisme
dapat dimatikan setempat (in situ) oleh panas
(kalor), gas-gas seperti formaldehide, etilen
oksida oleh bermacam-macam larutan kimia,
oleh sinar ultra violet atau sinar gamma.
• Mikroorganisme juga dapat disingkirkan secara
mekanik oleh sentrifugasi kecepatan tinggi atau
oleh filtrasi.
 Tujuan utama mematikan atau menghambat
pertumbuhan mikroorganisme adalah :

• Untuk mencegah infeksi pada manusia, hewan, dan

tumbuhan
• Untuk mencegah kerusakan pangan dan komoditas lainnya
• Untuk mencegah kontaminasi terhadap mikroorganisme
yang digunakan dalam industri, hasilnya tergantung pada
kemurnian penggunaan biakan murni
• Untuk mencegah kontaminasi bahan-bahan yang dipakai
dalam pengerjaan biakan murni dilaboratorium (diagnosis,
penelitian, industri), sehingga pengamatan tentang
pertumbuhan satu organisme pada medium pembiakan
khusus atau pada hewan percobaan membingungkan
karena adanya organisme lain yang tumbuh
 Cara yang digunakan untuk mematikan dan
menghambat pertumbuhan mikroorganisme adalah :

• Destruksi oleh : (a) panas (alat pendidih, tanur), (b) zat-

zat kimia (disinfektan), (c) radiasi (sinar-x, ultraviiolet),
(d) cara mekanis (bantingan oleh vibrasi ultrasonik)
• Penyingkiran oleh : (a) penyaringan, dan (b)
sentrifugasi kecepatan tinggi
• Penghambatan oleh : (a) suhu rendah (pendinginan, es
kering), (b) pengeringan, (c) kombinasi (a) dan (b)
(misalnya liofilisasi), (d) tekanan osmosis (sirop,
asinan), dan (e) bahan kimia yang terdiri dari
bebearapa bahan kimia seperti eosin dan metilenbiru,
kristal violet, serta obat khemoterapeutik seperti
sulfonamida dan antibiotik
 Cara sterilisasi yang umum dilakukan adalah:

• Sterilisasi secara fisik, misalnya dengan pemanasan,

penggunaan sinar bergelombang pendek seperti sinar
X, sinar gamma, sinar ultra violet dan sebagainya.
• Sterilisasi secara kimia, misalnya dengan penggunaan
desinfektan, larutan alkohol, larutan formalin, larutan
AMC (campuran asam khlorida dengan garam Hg) dan
sebagainya.
• Sterilisasi secara mekanik, misalnya dengan cara
penggunaan saringan/filter.
• Sterilisasi secara fisik dapat dilakukan selama senyawa
kimia yang akan disterilkan tidak akan berubah atau
terurai akibat temperatur tinggi atau tekanan tinggi.
• Bahan ataupun peralatan yang dipergunakan di
dalam bidang mikrobiologi, harus dalam keadaan
steril. Artinya pada bahan atau peralatan tersebut
tidak didapatkan mikroba lain yang tidak
diharapkan, baik yang akan
mengganggu/merusak media ataupun
mengganggu kehidupan dan proses yang sedang
berlangsung.
• Dengan udara panas diperlukan alat yang
dinamakan “bejana/ruang panas” (oven) dengan
temperatur antara 170-180C. Waktu yang
dipergunakan adalah 2 jam. Cara ini umum
dipergunakan untuk mensterilkan peralatan gelas
(tabung, labu, botol dan sebagainya).
• Beberapa larutan garam seperti NaCl (9%), KCI
(11%) dan KNO (10%) dapat dipergunakan
untuk membunuh mikroba karena tekanan
osmotiknya. Sedangkan asam kuat atau basa
kuat dapat pula dipergunakan karena bersifat
menghidrolisis sel.
• Larutan KMnO4 (1%) dan HCL (1,1%) merupakan
senyawa yang kuat karena dapat mengoksidasi
substrat. Sedangkan yang paling banyak
digunakan adalah larutan HgCl2 (0,1%). Hanya
sayangnya senyawa ini sangat beracun dan
bersifat korosif serta dapat merusak jaringan
inang dan mengendapkan protein. Juga larutan
garam Cu (dari CuSO4) merupakan senyawa yang
paling banyak dipergunakan sebagai algisida
(pembasmi alge).
• Khlor dan senyawa khlor lainnya banyak
dipergunakan sebagai desinfektan terutama pada
tempat penyimpanan air
• Larutan formalin atau formaldehida
merupakan senyawa yang mudah larut dalam
air tetapi sangat efektif dengan kadar antara
4-20%.
• Larutan alkohol dengan kadar antara 50-75%
banyak juga dipergunakan karena cepat
menyebabkan koagulasi (penggumpalan)
protein mikroba.
 Peremajan dan Penyimpanan Mikroba

• Peremajaan mikroba bertujuan untuk

memperoleh biakan yang baru sehingga
diharapkan dapat berkembang biak dengan
baik. Hasil dari peremajaan mikroba adalah
mikroba yang masih muda sehingga dapat
digunakan dengan baik sesuai dengan
fungsinya.
• Penyimpanan mikroba bertujuan untuk
memperoleh biakan/kultur mikroba kapanpun
kita inginkan. Mikroba yang dapat diremakan
untuk tujuan penyimpanan adalah
isolat/biakan mikroba yang harus mampu
mempertahankan sifat yang diharapkan
darinya untuk waktu yang lama.
 Beberapa metode penyimpanan mikroba adalah :
1. Penyimpanan pada suhu rendah
• Agar miring – pendingin (4 oC), freezer (-20 oC),
• Spora jamur dalam air (5 oC)
• Nitrogen cair (-150 sampai -196 oC)
2. Penyimpanan dalam bentuk kering
Tanah + biakan dikeringkan. Digunakan untuk jamur
3. Lyophilization\freeze drying. Pembekuan biakan
diikuti dengan pengeringan menggunakan
vacuum mengakibatkan pengembunan air sel
 Mutu biakan yang disimpan harus terpelihara
dengan baik supaya diperoleh biakan yang tetap
stabil, beberapa hal yang harus diperhatikan
adalah :
• Setiap batch harus diuji secara rutin
• Metode apapun yang digunakan untuk
penyimpanan, mutu simpanan harus selalu diikuti
• Pengujian dilakukan untuk meyakinkan bahwa
galur yang diperbanyak memiliki sifat tumbuh,
morfologi, dan kemampuan menghasilkan produk
yang sama
Beberapa cara preservasi kultur adalah

a. Penyimpanan pada agar miring

• Kultur ditumbuhkan pada agar miring
• Disimpan pada refrigerator 5oC atau freezer -
20oC
• Subkultur setiap 6 bulan atau sampai dengan
1 tahun bila kultur ditutup dengan mineral oil
• Mudah terkontaminasi
Penyimpanan spora di dalam
air
• Spora jamur dalam air steril
• Disimpan pada suhu 5oC
• Sangat terbatas
pemakaiannya
c. Penyimpanan dengan nitrogen cair
• penyimpanan pada suhu sangat rendah (-150o
sampai -196oC) dengan refrigerator nitrogen cair
• Kultur ditumbuhkan hingga fase stasioner,
kemudian disuspensikan pada agensia
cryoprotective (misal gliserol 10%), disimpan
dalam ampul tertutup, kemudian dibekukan
• Hasil yang baik : proses pembekuan suspensi
lambat, proses pencairan cepat
• Kematian sel banyak terjadi pada proses
pembekuan
d. Pengkulturan pada tanah atau pasir
• Kultur ditumbuhkan pada tanah atau pasir
steril lembab, kemudian dibiarkan pada suhu
ruang hingga kering, kultur kemudian
disimpan pada suhu ruang atau di refrigerator
• Biasanya dilakukan untuk spora kultur fungi,
• Pengeringan bisa dengan desikator
menggunakan silika gel atau CaCl
e. Penyimpanan pada media sporulasi
• kultur disporulasikan pd media / substrat
seperti sekam, sereal, biji-bijian
• pengeringan pada desikator
• penyimpanan pada suhu 5C
 Penyimpanan liofilisasi atau freeze-
drying.
• Merupakan metode penyimpanan kultur yang
paling banyak dilakukan oleh industri, kultur
dapat bertahan hingga lama sekali. Dilakukan
dengan cara :
1. Kultur ditumbuhkan hingga fase stasioner,
disuspensikan dengan agensia pelindung (susu,
Na glutamat, medium cair, serum, whey,
campuran tanah dan pasir)
2. Kultur sel vegetatif atau spora dalam ampul
dibekukan, kemudian dikeringkan secara vakum
3. Penyimpanan pada refrigerator