Nama : Dwi Rahmawati

NIM : 18308144010

Kelas : Biologi F 2018

UTS BIOTEKNOLOGI

Jelaskan tahapan Teknologi DNA Rekombinan (TDR) dari awal sampai akhir?

Isolasi DNA
Isolasi DNA bertujuan untuk memilih dan memisahkan DNA maupun gen yang
diinginkan. Isolasi ini biasanya dilakukan dengan cara mengekstrak kromosom dari
organisme donor maupun organisme vector. Isolasi DNA dibedakan menjadi 2, yaitu isolasi
DNA genom dan isolasi DNA plasmid.
• Isolasi DNA genom
1. Kultivasi sel dalam media yang sesuai
2. Pemecahan membran atau dinding sel yang dapat dilakukan baik secara fisik seperti
sonikasi maupun kimiawi seperti pemberian lisozim, EDTA, deterjen triton X-100
atau dengan Sodium Dodesil Sulfat (SDS).
3. Ekstraksi DNA genom melalui sentrifugasi
4. Purifikasi DNA menggunakan fenol dan kloroform 🡪 sentrifugasi 🡪 Rnase 🡪
presipitasi etanol (20ºC) 🡪 sentrifugasi 🡪 DNA murni
• Isolasi DNA Plasmid
1. Teknik sentrifugasi gradient densitas etidium bromida Cesium Klorida (CsCl), yang
berkecepatan tinggi.
2. DNA plasmid membentuk pita terpisah dengan pita DNA genom
3. Pita DNA dalam tabung terlihat melalui pendaran Etidium Bromida (EtBr) yang
disinari UV
4. DNA plasmid diambil dengan menusukkan jarum suntik pada dinding tabung dimana
pita DNA plasmid terlihat dan menyedotnya.
5. Etidium bromida yang terikat pada DNA plasmid diekstraksi dengan n-butanol, dan
CsCl dihilangkan dengan cara dialisis.
Memotong DNA
Pemotongan molekul DNA, baik genomik maupun plasmid dilakukan dengan enzim
restriksi. Ada dua macam enzim restriksi yaitu enzim restriksi tipe I dan enzim restriksi tipe
II. Enzim restriksi tipe II mempunyai sifat-sifat umum yang penting sebagai berikut:
a. Mengenali urutan tertentu sepanjang empat hingga tujuh pasang basa di dalam molekul
DNA.
b. Memotong kedua untai molekul DNA di tempat tertentu pada atau di dekat tempat
pengenalannya.
c. Menghasilkan fragmen-fragmen DNA dengan berbagai ukuran dan urutan basa.
Berdasarkan tempat hasil pemotongan, fragmen-fragmen DNA memiliki dua macam
ujung yaitu:
● Ujung lengket (sticky end) atau ujung kohesif, terjadi jika tempat pemotongan pada
kedua untai DNA terpisah sejauh beberapa pasang basa, sehingga menghasilkan
fragmen-fragmen dengan ujung 5’ yang runcing karena masing-masing untai
tunggalnya menjadi tidak sama panjang. Dua fragmen DNA dengan ujung yang
runcing akan mudah disambungkan satu sama lain.
● Ujung tumpul (blunt end), terjadi jika tempat pemotongan DNA pada posisi yang
sama. Kedua fragmen hasil pemotongannya akan mempunyai ujung 5’ yang tumpul
karena masing-masing untai tunggalnya sama panjangnya. Penyatuan dua fragmen
DNA ujung tumpul sulit dilakukan sehingga memerlukan perlakuan tambahan,
misalnya pemberian molekul linker, molekul adaptor, atau penambahan enzim
deoksinukleotidil transferase.

Menyambung DNA

Penyambungan molekul DNA. Ada tiga cara yang dapat digunakan untuk meligasi
fragmen-fragmen DNA secara in vitro. Pertama, ligasi menggunakan enzim DNA ligase dari
bakteri. Kedua, ligase menggunakan DNA ligase dari sel-sel E. coli yang telah diinfeksi
dengan bakteriofag T4 atau lazim disebut sebagai enzim T4 ligase. Ketiga yaitu pemberian
enzim deoksinukleotidil transferase untuk menyintesis untai tunggal homopolimerik 3’. Suhu
optimum bagi aktivitas DNA ligase sebenarnya 37ºC. Akan tetapi, pada suhu ini ikatan
hidrogen yang secara alami terbentuk di antara ujung-ujung lengket akan menjadi tidak stabil
dan kerusakan akibat panas akan terjadi pada tempat ikatan tersebut. Oleh karena itu, ligasi
biasanya dilakukan pada suhu antara 4 dan 15ºC dengan waktu inkubasi (reaksi) yang
diperpanjang (sering kali hingga semalam).
Pada reaksi ligasi fragmen DNA genomik dan DNA vektor, dapat terjadi peristiwa
religasi atau ligasi sendiri sehingga plasmid yang telah dilinierkan dengan enzim restriksi
akan menjadi plasmid sirkuler kembali à menurunkan efisiensi ligasi à pemberian perlakuan:
  Penggunaan DNA dengan konsentrasi tinggi (lebih dari 100Ng/ml),
 Perlakuan dengan enzim alkalin fosfatase untuk menghilangkan gugus fosfat dari
ujung 5’ pada molekul DNA yang telah terpotong,
 Pemberian molekul linker, molekul adaptor, atau penambahan enzim
deoksinukleotidil transferase untuk menyintesis untai tunggal homopolimerik 3’.

Memasukkan DNA ke dalam sel hidup (vektor)

Untuk memasukkan DNA rekombinan ke dalam sel bakteri, sel tersebut harus diberi
perlakukan agar menjadi sel kompeten, yaitu sel yang mampu menerima DNA dari luar.
Kemampuan paling tinggi untuk memasukkan DNA dari luar terjadi pada sel yang berada
dalam fase logaritmik, yaitu pada waktu pertumbuhan sel sedang cepat. Proses transfer DNA
rekombinan ke dalam sel hospes tergantung pada jenis vektor yang digunakan. Ada beberapa
cara transfer:
1. Transformasi
 Vektor: plasmid DNA.
 DNA rekombinan dapat ditransformasikan ke dalam sel inang dengan cara:
a. Induksi Kimia à heat shock dengan CaCl2 suhu 42°C selama 90 detik
b. Elektroporasi à meningkatkan permeabilitas dinding sel dengan menempatkan sel
pada medan listrik yang kuat.
c. Konjugasi à terjadi secara alamiah diantara sel bakteri melalui pili bakteri.
Ex: plasmid Ti
2. Transfeksi
 Vektor: virus bakteriofag.
 DNA rekombinan yang akan ditransfer dikemas terlebih dahulu dalam kapsid
bakteriofag, kemudian diinfeksikan kedalam sel penerima.
 Proses transfer DNA melalui transfeksi ini menyerupai proses infeksi oleh virus yang
terjadi secara alamiah.
 Replikasi dan propagasi akan meningkatkan jumlah DNA rekombinan
3. Mikroinjeksi : mentransfer DNA secara langsung kedalam sel menggunakan jarum
suntik mikro mentransfer DNA kedalam sel hewan atau sel tanaman, karena sel tersebut
berukuran relative lebih besar daripada sel bakteri. DNA rekombinan yang akan
ditransfer diinjeksikan lengsung kedalam nucleus sel penerima.
4. Mikroprojektil : untuk mentransfer DNA kedalam sel atau jaringan tanaman. Partikel
DNA ditembakkan langsung dengan suatu alat penembak khusus langsung kedalam sel
tanaman. Berbagai jenis alat penembak gen, salah satu jenisnya antara lain adalah pistol
penembak gen.

Menyeleksi klon Rekombinan

Klon-klon perlu dipilih untuk menentukan mana koloni bakteri yang membawa plasmid
rekombinan dan gena of interest. Beberapa cara untuk melakukan seleksi klon rekombinan
antara lain :

1. Seleksi berdasarkan sifat resistan terhadap antibiotik

Pada seleksi ini plasmid yang digunakan mempunyai dua gen resistan terhadap
antibiotik. Misalnya gen Ampr (gen resistan ampisilin dan gen Tetr (gen resistan
terhadap tetraciclin). Penyisipan DNA asing dilakukan di dalam gen Tet r, sehingga
bila mengandung sisipan DNA asing gen Tetr tidak akan aktif. Bakteri transforman
pertama ditumbuhkan pada media yang mengandung Ampicilin, sehingga koloni yang
tumbuh adalah koloni yang membawa plasmid. Kemudian koloni-koloni ini
dipindahkan ke media yang mengandung tetrasiklin, sehingga koloni yang
mengandung DNA sisipan (dimana gen Tetr-nya sudah tidak aktif) tidak akan tumbuh.
Maka kita akan tahu koloni mana yang mengandung DNA sisipan.
2. Seleksi dengan melibatkan gen LacZ
Pada proses ini plasmid yang digunakan mengandung gen Ampr dan gen LacZ. Gen
LacZ ini berfungsi untuk mengkode ensim β-galaktosidase yang dapat mengkatalis
pemecahan laktosa menjadi glukosa dan galaktosa. Penyisipan DNA dilakukan di
dalam gen LacZ agar apabila DNA mengandung DNA sisipan maka gen LacZ akan
inaktif. Seleksi dilakukan dengan menambahkan substrat analog laktosa berupa X-gal
yang akan dipecah oleh enzim β-galaktosidase menjadi senyawa berwarna biru (5-
bromo-4 kloro-3-indigo). Inducer pada proses ini menggunakan IPTG. Bakteri
transforman akan ditumbuhkan pada media yang mengandung Ampicilin, X-gal serta
IPTG. Sehingga koloni yang tumbuh adalah koloni yang membawa plasmid DNA.
Terdapat 2 jenis koloni, yaitu koloni putih dan biru. Koloni biru mengindikasikan
bahwa pada koloni tersebut terdapat senyawa 5-bromo-4 kloro-3-indigo yang
merupakan hasil penguraian X-gal oleh β-galaktosidase. Hal ini berarti gen LacZ
masih aktif sehingga tidak mengandung DNA sisipan. Sedangkan apabila koloni
berwarna putih merupakan koloni yang tidak menghasilkan senyawa berwarna yang
mengindikasikan gen LacZ inaktif dan mengandung DNA sisipan.