LAPORAN PRAKTIKUM ANALISIS FARMASI DASAR

KROMATOGRAFI II
(KROMATOGRAFI KOLOM DAN KAPILARITAS)

Responser : Widya Dwi Aryati, M.Si., Apt.

Disusun oleh :
1. Agnes Tanubrata (NPM 1706034092)
2. Al Lifia Rahmatul Ummah (NPM 1706034621)
3. Fajar Rahman (NPM 1706034483)
4. Natasha Illona (NPM 1706034754)
5. Surya Geraldi (NPM 1706034501)

LABORATORIUM KIMIA FARMASI-MEDISINAL DAN

BIOANALISIS
PRODI SARJANA FARMASI
FAKULTAS FARMASI UNIVERSITAS INDONESIA
2018

i
 DAFTAR ISI

HALAMAN JUDUL ................................................................................................ i

DAFTAR ISI ............................................................................................................ ii
BAB I PENDAHULUAN ........................................................................................ 1
1.1. Latar Belakang ...................................................................................... 1
1.2. Tujuan Praktikum .................................................................................. 1
BAB II TINJAUAN PUSTAKA .............................................................................. 2
2.1. Kromatografi Kolom .............................................................................. 2
2.2. Adsorben dan Pelarut Kromatografi Kolom .......................................... 2
2.3. Penggunaan Kromatografi Kolom ......................................................... 4
2.4. Klasifikasi Kromatografi Kolom............................................................ 4
2.4.1 Adsorpsi ..................................................................................... 5
2.4.2 Partisi.......................................................................................... 5
2.4.3 Penukar Ion ................................................................................ 5
2.4.4 Ekslusi (Gel)............................................................................... 6
2.5. Prosedur Kromatografi Kolom ............................................................... 6
2.5.1. Metode Basah ............................................................................. 6
2.5.2. Metode Kering ............................................................................ 6
BAB III METODE PRAKTIKUM ........................................................................... 7
3.1. Alat dan Bahan ....................................................................................... 7
3.2. Langkah Kerja ....................................................................................... 10
BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN ................................................................. 12
4.1. Hasil Percobaan ..................................................................................... 12
4.2. Pembahasan ........................................................................................... 14
BAB V KESIMPULAN ........................................................................................... 16
DAFTAR REFERENSI ............................................................................................ 17
LAMPIRAN ............................................................................................................. 18

ii
 BAB 1
PENDAHULUAN
1.1 Latar Belakang
Kromatografi merupakan teknik analisis yang memisahkan komponen-
komponen yang terdapat dalam suatu campuran. Terdapat dua komponen penting
yang digunakan dalam teknik ini, yaitu fase diam dan fase gerak. Kromatografi
dilakukan dengan mengalirkan fase gerak melewati sampel. Kecenderungan
komponen sampel untuk larut dalam fase diam atau fase gerak menjadi penentu
hasil pemisahan. Komponen yang lebih larut dengan fase gerak tentunya akan
lebih dahulu terpisah dari sampelnya. Begitu pula sebaliknya, komponen yang
lebih larut pada fase diam akan lebih tertahan pada fase diam tersebut. Teknik ini
kerap kali digunakan dalam dunia farmasi untuk mengidentifikasi kemurnian
suatu senyawa dan memastikan kandungan senyawa dalam suatu zat. Oleh
karena itu penting bagi farmasis untuk mengetahui dan memahami tata cara
menggunakan kromatografi.

1.2 Tujuan Praktikum

Memisahkan komponen zat warna dalam suatu campuran secara

kromatografi kolom.

1
 BAB 2
TINJAUAN PUSTAKA
2.1 Kromatografi kolom

Kromatografi kolom adalah suatu metode pemisahan (pemurniaan)

senyawa kimia dengan campurannya. Prinsip kromatografi kolom adalah sampel
dilewatkan pada adsorben (fase diam) di dalam sebuah kolom kemudian eluen
dialirkan dengan gaya gravitasi, gaya berat dan mekanisme adsorpsi melalui
kolom. Komponen pada sampel akan bergerak melewati kolom dengan laju yang
berbeda-beda sesuai dengan afinitas komponen pada adsorben, komponen yang
memiliki afinitas paling kecil akan bergerak paling cepat.

Alat yang digunakan untuk melakukan pemisahan kromatografi kolom

adalah kolom yang berupa pipa gelas, logam atau plastik, yang dilengkapi dengan
kran pada bagian bawah serta penyaring didalamnya. Ukuran kolom sangat
beragam, tergantung pada banyaknya senyawa yang akan dipisahkan. Berikut
adalah ukuran kolom untuk kromatografi kolom.

2.2 Adsorben dan pelarut kromatografi kolom

Adapun hal-hal yang perlu diperhatikan dalam kromatografi kolom adalah

adsorben. Adsorben yang digunakan dalam kromatografi kolom harus tidak larut

2
dalam eluen yang digunakan, inert (tidak bereaksi dengan sampel), cukup aktif
sehingga mampu mengadsorpsi sekaligus memungkinkan perambatan sampel,
tidak berwarna agar pemisahan dapat diamati, memungkinkan eluen mengaliran
dengan baik, reprodusibel, dapat diproduksi dengan sifat yang konstan. Adsorben
yang paling banyak digunakan adalah aluminium dan silika. Berikut adalah
contoh-contoh adsorben pada kromatografi kolom.

Tingkat kekuatan adsorpsi gugus polar pada senyawa-senyawa polar akan

meningkat dengan urutan sebagai berikut -CO2R, =C=O, -NH2, -OH, -CO2H.
Gugus polar pada adsorben akan menarik molekul komponen sampel dengan
interaksi dipol-dipol dan ikatan hidrogen.
Pemilihan adsorben dan pelarut digunakan prinsip, yaitu untuk
adsorben, digunakan adsorben yang memiliki polaritas yang sama dengan
komponen sampel, sedangkan untuk eluen, digunakan eluen yang memiliki
polaritas yang berlawanan dengan komponen sampel. Pemisahan komponen
dengan eluen yang kurang polar akan terjadi sempurna, namun waktu yang
diperlukan lebih lama sehingga volume eluen yang diperlukan lebih banyak
dibandingkan dengan ketika menggunakan eluen yang lebih polar. Jenis adsorben
dan pelarut yang digunakan pada kromatografi kolom adalah sebagai berikut:

3
2.3 Penggunaan kromatografi kolom
Kromatografi kolom dapat digunakan sebagai:
 Dalam penentuan kualitatif maupun kuantitatif, senyawa dalam
protein
 Pemisahan molekul – molekul penting seperti asam nukleat,
karbohidrat, lemak, vitamin dan molekul penting lainnya.
 Mengontrol kondisi obat tersebut sehingga bisa bertahan lama.
 Dalam bidang klinik, menginvestigasi fluida badan seperti air liur
sehingga dapatdiketahui jenis penyakit yang sedang diderita pasien
tersebut.
 Deteksi senyawa oksalat dalam air kencing bagi pasien batu ginjal.

2.4 Klasifikasi Kromatografi Kolom

Kromatografi kolom dapat digolongkan berdasarkan mekanisme
pemisahan yang digunakan:

4
2.4.1 Adsorpsi
Digunakan untuk pemisahan golongan senyawa berdasarkan gugus
fungsional yang terdapat dalam senyawa tersebut. Fase gerak (eluen) biasanya
bersifat non polar terhadap fase diam. Pelarut yang digunakan seperti metanol,
kloroform, dietileter, dan isopropanol.
2.4.2 Partisi
Teknik kromatografi berdasarkan partisi komponen antara fase diam cairan
pada permukaan penyangga padat dengan fase gerak. Fase diam tidak saling
campur dengan fase gerak. Komponen terpisah karena masing-masing memiliki
koefisien partisi yang berbeda. Fase diam yang digunakan dapat berupa
silika/alumina yang permukaannya dilapisi lapisan cair. Fase diam terikat pada
partikel padat. Kromatograf kolom partisi terbagi dua berdasarkan fase terikat,
yaitu:

2.4.3 Penukar Ion

Kromatografi pertukaran ion adalah proses pemisahan senyawa yang
didasarkan pada pertukaran (penjerapan) ion antara fase gerak dengan ion pada
fasa diam. Prinsip dasar pemisahan dengan kromatografi kolom penukar ion
adalah perbedaan kecepatan migrasi ion-ion di dalam kolom penukar ion. Proses
pertukaran ion dikerjakan dengan cara pembebanan ion-ion pada kolom penukar
ion. Kemudian ion-ion yang terikat dalam resin dialiri eluen yang
mampumemberi kondisi keseimbangan yang berbeda. Keseimbangan yang
berbeda ini mengakibatkan kecepatan migrasi ion dalam kolom resin tidak sama
(Biyantoro, 2006).

5
2.4.4 Eksklusi (Gel)

Kromatografi eksklusi metode kromatografi yang menggunakan partikel

berpori untuk memisahkan molekul dengan ukuran yang berbeda. Fase diam
yang digunakan dapat berupa silikaa atau polimer yang berpori, sehingga solut
dapat melewati pori tersebut (lewat diantara partikel), atau berdifusi melalui fase
diam. Sedangkan fase gerak pada kromatografi ini tidak berpengaruh, sehingga
pelarut yang berlainan yang mempunyai daya mensolvasi yang sama
menghasilkan hasil yang sama.

2.5 Prosedur Kromatografi Kolom

Dalam memasukkan zat ke dalam kromatografi kolom, terdapat dua
metode yang digunakan, yaitu;
2.5.1 Metode Basah
Zat dilarutkan dalam pelarut yang sesuai dan dimasukkan ke kolom. Kran
yang berada di bagian bawah dibuka sehingga larutan tersebut dapat mengalir ke
bawah hingga batas permukaan fase diam. Kran ditutup dan dituangkan fase
gerak. Kran kembali dibuka dan larutan zat beserta fase gerak akan mengalir ke
bawah mengikuti gaya gravitasi. Sehingga fase gerak harus tetap dialirkan untuk
menjaga agar fase diam atau penyangga tidak mengering.
2.5.2 Metode Kering
Kepolaran pelarut lebih besar dari eluen, maka zat dapat tidak terikat secara
sempurna dengan fase diam. Pertama – tama zat uji dilarutkan dalam sedikit
pelarut. Lalu ditambahkan zat penyangga (fase diam) seperti silika, lalu diaduk
hingga tersisa campuran kering zat dan penyangga. Campuran kering tersebut
lalu dimasukkan ke dalam kolom, baru ditambahkan fase gerak serta kran dibuka
sehingga larutan akan mengalir ke bawah dan proses elusi dapat berjalan. Fase
gerak harus dialirkan terus untuk mencegah keringnya penyangga

6
 BAB 3
METODE PERCOBAAN PRAKTIKUM
3.1 Alat dan Bahan
Alat Bahan
Kolom kromatografi, klep, statif Silika gel

Batang pengaduk Aquades

Corong Kapas

7
 Gelas kimia Kertas saring

Tabung reaksi Zat warna (phenolphthalein dan

sunset yellow)

8
 Pipet tetes Fase gerak (Etanol : Air : NaOH
= 7:2:1)

Rak tabung reaksi

Gelas ukur

9
3.2 Langkah kerja
1. Siapkan statif, lalu pasang klem pada statif.
2. Pasang kran yang telah diberi vaseline pada kolom kromatografi,
selanjutnya letakan kolom kromatografi pada klem.
3. Masukan kapas ke dalam kolom dengan posisi kran yang ditutup.
4. Bersihkan kolom dengan memasukan fase gerak.
5. Masukan adsorben (silika gel) ke dalam beaker dan tambahkan fase gerak,
larutkan sampai homogen.
6. Masukan secara perlahan adsorben yang telah diberi fase gerak ke dalam
kolom menggunakan corong. Ketuk-ketuk dinding kolom agar tidak ada
rongga (gelembung) udara pada fase diam. Panjang fase diam di dalam
kolom sekitar 2/3 dari panjang kolom. Fase gerak usahakan lebih 2 cm di
atas fase diam.
7. Jika tidak erjadi penurunan fase gerak, masukan analit (campuran zat
warna dengan sampel (silila gel) sebanyak kurang lebih 2-5 ml.
8. Buka keran secara perlahan, dan catat waku pertama penetesan fase gerak.
9. Masukan masing- masing 10 tetes NaOH pada setiap tabung reaksi yang
akan digunakan untung menampung fraksi.
10. Fraksi yang keluar ditampung dan catat waktu penetesan analit pertama,
demikian seterusnya.

10
11. Penambahan fase gerak dilakukan dengan hati-hati (perlahan) dan jangan
sampai terlambat, karena jika terlambat dapat menyebabkan fase diam
kering.

11
 BAB 4

HASIL DAN PEMBAHASAN

4.1 Hasil Percobaan

Pada percobaan kromatografi kolom yang kami lakukan, volume analit

yang diuji adalah 2 mL dan eluen yang digunakan pada pemisahan zat warna
adalah etanol: air: NaOH (7:2:1) dibuat sebanyak 100 mL.

Waktu analit pertama keluar Warna yang Volume warna

No.
(menit ke-) dihasilkan (mL)
Merah orange

1 17 menit 57 detik 4.4-0.5 =3.5

Merah tua

2 24 menit 05 detik 12.8-0.5= 12.3

Pink tua

3 44 menit 30 detik 4.2-0.5= 3.7

12
 Pink bening

4 51 menit 32 detik 2.4-0.5= 1.9

Pink keunguan
bening

5 55 menit 05 detik 2.8-0.5= 2.3

Tidak Berwarna

6 58 menit 57 detik 1.4-0.5= 0.9

Kromatografi dihentikan pada waktu 1 jam 1 menit 20 detik setelah

dipastikan bahwa tidak ada lagi fraksi warna yang keluar dari kolom. Gambar
keseluruhan 6 fraksi warna yang kami dapatkan terdapat dibawah ini dengan
urutan fraksi warna yang keluar pertama hingga terakhir dari kiri ke kanan.

13
4.2 Pembahasan

Pada percobaan kromatografi kolom yang kami lakukan, sample yang

digunakan merupakan zat pewarna yang mengandung sunset yellow dan
phenolphthalein (PP). Pemisahan didasarkan pada daya adsorbsi zat. Fase gerak
yang digunakan adalah campuran etanol, air, dan NaOH yang dibuat dengan
perbandingan 7:2:1 sebanyak 100 mL. Fase diam yang digunakan dalam
percobaan ini adalah silica yang dimasukkan ke dalam kolom dengan wet method
dimana silica dibuat menjadi suspensi dengan fase gerak kemudian dituangkan
ke dalam kolom. Setelah dimasukkan ke dalam kolom, silica dibiarkan
mengendap dan mengisi kolom dengan mampat sebanyak ¾ kolom. Sample
sebanyak 2 mL dimasukkan ke dalam kolom dengan cara dicampurkan dengan
silica sebanyak 2 sendok tanduk kemudian dituangkan ke dalam kolom dengan
bantuan fase gerak. Perlu diperhatikan agar silica dalam kolom tidak kering dan
berkerak sehingga perlu ditambahkan fase gerak terus menerus selama proses
loading dan proses kromatografi.

14
 Dapat dilihat dari hasil percobaan bahwa fraksi warna yang keluar pertama
kali adalah warna merah orange yang diduga merupakan sunset yellow pada
waktu 17 menit 57 detik sejumlah 3.5 mL. Analit kedua yang keluar berwarna
merah tua dengan volume 12.3 mL pada waktu ke 24 menit 05 detik. Analit ini
diduga merupakan sunset yellow. Hal ini disebabkan karena sunset yellow
merupakan zat yang lebih polar sehingga akan larut dalam fase gerak yang
bersifat polar juga dan keluar terlebih dahulu dari kolom. Warna merah pada
fraksi terbentuk akibat interaksi dari sunset yellow dan 0.5 mL NaOH yang
terdapat dalam tabung reaksi tempat menampung. Fraksi berubah warna menjadi
pink ketika sunset yellow telah habis dipisahkan dari kolom dan yang keluar dari
kolom merupakan zat yang diduga PP. Perubahan ini terlihat pada menit ke 44
dan 30 detik dan analit yang keluar sebanyak 3.7 mL. Warna fraksi berubah
menjadi pink karena terjadi interaksi antara NaOH dan PP yang merupakan
indikator asam basa yang menunjukkan warna pink ketika bercampur dengan
basa. Phenolphthalein memiliki kepolaran yang lebih rendah sehingga akan
mengalami elusi lebih lama bila dibandingkan dengan sunset yellow.
Kromatografi dihentikan ketika tidak ada lagi fraksi warna yang keluar dari
kolom, sehingga yang keluar merupakan larutan jernih yang merupakan fase
gerak. Hal ini menandakan bahwa pemisahan telah selesai.

Fraksi warna yang kami dapatkan dari hasil percobaan terdapat sebanyak 6
fraksi. Perubahan warna fraksi tidak terlihat dengan jelas akibat kesalahan
pengamatan ketika pemisahan fraksi pada fraksi ke-2 berwarna merah tua. Hal
ini terjadi karena pengamat tidak memperhatikan perbedaan warna dengan
seksama sehingga tabung reaksi tempat menampung fraksi warna tidak diganti
ketika terjadi pergantian warna dan menyebabkan fraksi warna tercampur.

15
 BAB 5
KESIMPULAN
Kromatografi kolom merupakan salah satu teknik yang dapat digunakan
untuk memisahkan komponen-komponen yang terkandung dalam suatu
senyawa. Pada praktikum ini, campuran yang terdiri dari sunset yellow dan
phenolphthalein (PP) dapat dipisahkan dengan baik menggunakan kromatografi
kolom fase terbalik. Berdasarkan hasil pengamatan, sunset yellow dengan warna
oranye lebih dahulu keluar dari kolom dibandingkan dengan PP dengan warna
lembayung. Dengan demikian dapat ditarik kesimpulan bahwa sunset yellow
lebih polar dibandingkan dengan PP.

16
 DAFTAR REFERENSI
Fakhriya, Ifaa. Tugas Kromatografi Penukar Ion. Diakses dari
http://www.academia.edu/19714729/TUGAS_KROMATOGRAFI_PENUKAR_ION
pada tanggal 24 November 2018, pukul 10.25 WIB.

Harmita. 2015. Analisis Fisikokimia Kromatografi Vol 2. Jakarta: Penerbit Buku

Kedokteran EGC

Rahmawati, Irma. 2013. Exclusion Chromatography. Diakses dari

https://dokumen.tips/documents/kromatografi-eksklusi-5659d6fae2c45.html pada
tanggal 24 November, pukul 10.37 WIB.

Syarif, Mohdar. 2015. Kromatografi Kolom. Dikases dari

http://www.academia.edu/15645322/KROMATOGRAFI_KOLOM_II.2.1_Pengertia
n_Kromatografi_Kolom pada tanggal 24 November 2018, pukul 10.52 WIB. Diakses
dari https://anzdoc.com/kromatografi-partisi.html pada tanggal 24 November 2018,
pukul 11.17 WIB.

17
 LAMPIRAN

Lampiran 1: Tabel Hasil Pengamatan Pemisahan Campuran Menggunakan

Kromatografi Kolom

18