DNA disintesis oleh DNA Polimerase ( lanjutan)

Reaksi yang mendasari adalah reaksi transfer kelompok fosforil. Nukleofil adalah
kelompok 3’-hidroksil dari nukleotida yang berada pada ujung rantai yang
berproses ( tumbuh). Nukleofil menyerang α fosfor pada gugus deoksinukleosida
yang masuk yaitu 5’-trifosfat (Gambar 25-5).Senyawa anorganik pirofosfat
dilepaskan dari reaksi.Reaksinya secara umum

Dimana dNMP dan dNTP adalah deoksinukleosida 5 ’ mono phosphate dan 5’

trifosfat. Reaksinya berjalan hanya dengan sedikit perubahan energi bebas,
dimana satu ikatan fosfodiester terbentuk dengan melepaskan anhidrida fosfat
yang kurang stabil. Namun, interaksi non-kovalen basa-bertumpuk dan basa-
berpasangan menyediakan stabilisasi tambahan untuk produk DNA yang
diperpanjang terhadap nukleotida bebas.Dan juga pembentukan produk terjadii
dalam sel dengan energi 19 kJ / mol yang dihasilkan hidrolisis produk pirofosfat
oleh enzim pirofosfatase.
Mekanisme Gambar 25-5. Pemanjangan rantai DNA. (A) DNA polimerase I
beraktivitas membutuhkan untai tunggal tidak berpasangan yang bertindak
sebagai template dan untai primer untuk menyediakan gugus hidroksil bebas di
untaian 3’akhir, dimana unit nukleotida baru ditambahkan. Setiap nukleotida yang
masuk memilih pasangan basa nukleotida yang tepat dalam untai cetakan.
Produk hasil reaksi memiliki 3’hidroksil bebas, yang memungkinkan
penambahan nukleotida lain.

(b) Mekanisme katalitik melibatkan 2 ion Mg2+ , yang bergabung dengan

kelompok fosfat dari nukleotida yang masuk trifosfat dan tiga residu Asp, dua di
antaranya sangat cocok di semua polimerase DNA. Ion Mg2+ pada gambar di atas
memfasilitasi serangan kelompok 3 -hidroksil primer pada α fosfat dari trifosfat
nukleotida, ion Mg2+ yang lebih rendah akan memfasilitasi perpindahan dari
pirofosfat. Kedua ion tersebut menstabilkan struktur pada keadaan transisi
pentacovalent. RNA polimerase menggunakan mekanisme yang serupa (Lihat
Gambar 26–1b).

Tahapan awal pada DNA polimerase I mengarah pada definisi dari dua
persyaratan utama untuk polimerisasi DNA. Pertama,semua polimerase DNA
membutuhkan template. Reaksi polimerisasi diarahkan oleh template. Untai DNA
sesuai dengan aturan basa-berpasangan diprediksi oleh Watson dan Crick: di
mana guanin hadir dalam template, deoxynucleotide sitosin ditambahkan ke
untaian baru, dan seterusnya. Penemuan ini sangat penting, bukan hanya karena
diketahuinya bahan kimia dasar untuk replikasi DNA semikonservatif yang akurat
tetapi juga karena itu merupakan contoh pertama dari penggunaan template untuk
memandu reaksi biosintetik.
Kedua, polimerase membutuhkan primer. Primer adalah segmen untai (pelengkap
template) dengan kelompok 3’-hidroksil bebas yang dapat digunakan untuk
tambahan nukleotida, 3’ untaian ujung akhir primer disebut terminus primer.
Dengan kata lain, bagian dari untaian baru harus sudah di tempatnya, semua
polimerase DNA hanya dapat menambahkan nukleotida ke untaian yang sudah
ada sebelumnya. Kebanyakan primer adalah oligonukleotida RNA daripada DNA,
dan ada enzim khusus yang mensintesis primer saat kapan dan di mana mereka
dibutuhkan.

Setelah menambahkan nukleotida ke untai DNA yang berproses

( tumbuh), polimerase DNA yaitu baik yang terdisosiasi atau bergerak sepanjang
template dan yang ditambahkan nukleotida lain. Disosiasi dan reasosiasi
polimerase dapat membatasi keseluruhan tingkat polimerisasi, prosesnya
umumnya lebih cepat ketika polimerase ditambahkan lebih banyak nukleotida
tanpa dipisahkan dari template. Jumlah rata-rata nukleotida yang ditambahkan
sebelum polimerase berdisosiasi mendefinisikan prosesnya. DNA polimerase
sangat bervariasi dalam proses, beberapa menambahkan hanya beberapa
nukleotida sebelum berdisosiasi, yang lain menambahkan ribuan.

Replikasi Sangat Akurat

Proses replikasi berlanjut dengan tingkat ketepatan yang luar biasa. Di E. coli,
kesalahan dibuat hanya sekali untuk setiap 109 hingga 1010 nukleotida yang
ditambahkan. Untuk kromosom E. coli dari -4,6 x 106 bp, ini berarti kesalahan
terjadi hanya sekali per 1.000 hingga 10.000 pengulangan (replikasi). Selama
polimerisasi, pemisahan antara nukleotida yang benar dan salah tidak hanya
bergantung pada ikatan hydrogen yang menentukan pasangan dengan benar dan
saling melengkapi basa tetapi juga pada geometri umum standar pasangan basa A
≡T dan G≡C (Gbr. 25–6). Sisi aktif DNA polimerase yang hanya mengakomodasi
pasangan basa dengan geometri ini, dimana nukleotida yang salah mungkin bisa
membentuk ikatan hidrogen dengan basa di template, tetapi umumnya tidak akan
masuk ke sisi aktif. Basa yang tidak benar bisa ditolak sebelum ikatan
phosphodiester terbentuk.
Gambar 25–6.Kontribusi geometri pasangan basa terhadap ketepatan replikasi
DNA. (a) Pasangan basis A≡T dan G≡C standar merupakan geometri yang sangat
mirip, dan sisi aktif yang berukuran pas (biru) biasanya akan menampung yang
lain. (b) Geometri yang salah dimana pasangan basa dapat mengecualikan mereka
dari sisi aktif, seperti yang terjadi pada DNA polimerase I.

Keakuratan reaksi polimerisasi itu sendiri tidak cukup untuk

memperhitungkan tingginya tingkat ketepatan dalam replikasi. Pengukuran yang
cermat secara in vitro telah menunjukkan bahwa DNA polimerase memberikan
satu kesalahan penyisipan nukleotida untuk setiap 104 hingga 105 yang penyispan
yang benar. kesalahan-kesalahan ini kadang-kadang terjadi karena basa sesaat
membentuk tautomer yang tidak biasa (lihat Gambar 8-9), yang
memungkinkannya ikatan hidrogen dengan pasangan yang salah. In vivo,
kesalahan karena berkurangnya tingkat mekanisme enzimatik tambahan.

Satu mekanisme yang intrinsic digambarkan pada hampir semua

polimerase DNA yang memisah, aktivitas 3’ 5’ eksonuklease akan memeriksa
ulang setiap nukleotida setelah ditambahkan. Aktivitas nuclease memungkinkan
enzim untuk menghilangkan yang nukeotida baru yang ditambahkn dan yang
sangat spesifik untuk tidak cocok dengan pasangan basa (Gbr. 25-7). Jika
polimerase telah menambahkan nukleotida yang salah, translokasi enzim ke posisi
di mana nukleotida berikutnya akan ditambahkan terhambat. Jeda kinetik ini
memberikan kesempatan untuk sebuah koreksi. Aktivitas exonucleasev 3’ 5’
menghapus nukleotida yang salah pasangan, dan polimerase dimulai lagi.
Aktivitas ini, yang dikenal sebagai proofreading, tidak

hanya berkebalikan dari reaksi polimerisasi (Eqn 25-1), terjadi karena pirofosfat
tidak terlibat. Aktivitas polimerisasi dan proofreading dari polimerase DNA dapat
diukur secara terpisah. Proofreading meningkatkan keakuratan yang melekat pada
reaksi polimerisasi yaitu 102 hingga 103 kali lipat. Dalam DNA monomer
polimerase I, aktivitas polimerisasi dan proofreading memiliki sisi aktif yang
terpisah dalam polipeptida yang sama.

Ketika seleksi basa dan proofreading digabungkan, DNA polymerase

menghasilkan satu kesalahan untuk setiap 106 hingga 108 basa yang ditambahkan.
Padahal akurasi yang diukur pada replikasi di E. coli masih lebih tinggi.
Peningkatan akurasi disediakan oleh sistem enzim terpisah yang memperbaiki
pasangan basa yang tidak cocok yang tersisa setelah replikasi, dimana perbaikan
ketidakcocokan ini, bersama dengan proses perbaikan DNA lainnya, dalam
Bagian 25.2.

Gambar 25–7 Contoh koreksi kesalahan oleh aktivitas 3’ 5’ eksonuklease DNA

polimerase I. Analisis structural menemukan bahwa terjadinya aktivitas
eksonuklease yaitu menjelang aktivitas polimerase sebagai enzim yang
berorientasi pada gerakannya sepanjang DNA. Basa yang tidak cocok (di sini, C-
A tidak cocok) menghambat translokasi polimerase DNA I ke sisi
berikutnya.Dimana enzim mengoreksi kesalahan dengan aktivitas 3 ’ 5’
eksonuklease , kemudian melanjutkan aktivitas polymerase-nya kea rah 3’ 5’

E.coli Memiliki Sedikitnya Lima Polimerase DNA

Lebih dari 90% dari aktivitas DNA polimerase diamati dalam ekstrak E. coli
dapat menjelaskan DNA polymerase I. Namun setelah isolasi enzim ini pada
tahun 1955 banyak bukti yang menemukan bahwa isolasi E.coli untuk
menjelaskan DNA polimerasi I tidak cocok untuk replikasi kromosom E. coli
besar. Pertama, laju penambahan nukleotida (600 nukleotida / min) terlalu lambat
(dengan faktor 100 atau lebih) untuk memperhitungkan di mana garpu replikasi
bergerak di sel bakteri. Kedua, DNA polimerase I memiliki proses yang relatif
rendah. Ketiga, studi genetic telah menunjukkan bahwa banyak gen, dan banyak
protein, terlibat dalam replikasi sehingga DNA polymerase I tidak bertindak
sendiri. Keempat, pada tahun 1969 John Cairns mengisolasi untaian bakteri
dengan gen yang diubah untuk DNA polimerase I yang dihasilkan dari enzim
yang tidak aktif. Meskipun untaian ini tidak normal namun sensitif terhadap agen
yang merusak DNA.

Pencarian untuk polimerase DNA lainnya mengarah pada penemuan E.

coli DNA polymerase II dan DNA polimerase III pada awal 1970-an. DNA
polimerase II adalah enzim yang terlibat dalam satu jenis perbaikan DNA (Bagian

25,3). DNA polimerase III adalah replikasi utama enzim dalam E. coli. Sifat-sifat
dari ketiga DNA polimerase dibandingkan pada Tabel 25-1.

DNA polimerase IV dan V, diidentifikasi pada tahun 1999, terlibat

dalam bentuk perbaikan DNA yang tidak biasa (Bagian 25.2).

DNA polimerase I, maka bukan enzim utama replikasi, akan tetapi

melakukan beberapa hal yaitu sejumlah pembersihan fungsi selama replikasi,
rekombinasi, dan perbaikan.Fungsi khusus polymerase ditingkatkan oleh aktivitas
5’ 3’ eksonuclease. Kegiatan ini, berbeda dari proofreading3 ’ 5’
eksonuclease (Gbr. 25-7), berada dalam domain struktural yang dapat dipisahkan
dari enzim dengan sedikit perlakuan protease . Ketika 5’ 3’ domain
exonuclease dihapus, sisanya fragmen (Mr 68.000), fragmen besar atau Klenow

fragment (Gbr. 25–8), mempertahankan polimerisasi dan kegiatan proofreading.

aktivitas 5’ 3’eksonuclease DNA polymerase I utuh dapat mengganti
segmen DNA (atau RNA) yang dipasangkan ke untai template, dalam proses
yang dikenal sebagai nick translation (Gbr. 25-9). Kebanyakan polimerase DNA
lainnya kekurangan aktivitas 5’ 3’eksonuclease.

DNA polimerase III jauh lebih kompleks daripada DNA polimerase I,

memiliki sepuluh jenis subunit (Tabel 25-2). Kegiatan polimerisasi dan
proofreading berada di dalamnya α dan ε (epsilon) subunit, masing-masing.
Dimana θ subunit dengan α dan ε bergabung untuk membentuk polimerase inti,
yang dapat mempolimerisasi DNA tetapi dengan proses terbatas. Dua polimerase
inti dapat dihubungkan oleh…. Lanjutan hal selanjutnya