BAB II

PEMBAHASAN

A. Pengertian HPLC

Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT) atau High Performance Liquid

Chromatography (HPLC) merupakan salah satu metode fisikokimia berdasarkan pada
teknik kromatografi di mana fase geraknya berupa cairan dan fase diam dapat dalam
bentuk cair atau padat.
Metode ini sangat bermanfaat di bidang farmasi untuk menganalisis secara
simultan beberapa analit dalam martiks sederhana maupun kompleks.
Pada akhir 1960-an, semakin banyak usaha untuk pengembangan kromatografi
cair sebagai suatu teknik untuk mengimbangi kromatografi gas. KCKT adalah
kromatografi cair kolom modern, yang dasarnya merupakan pengembangan dari
kromatografi kolom menjadi suatu sistem pemisahan yang cepat dan efisien.
Peningkatan kecepatan dan efisiensi pemisahannya terkait dengan peningkatan
performa kolomnya yang menggunakan kolom dengan ukuran dimensi dan partikel
yang jauh lebih kecil dari kolom yang dipakai pada kromatografi kolom, sehingga
agar fase gerak dapat mengalir pada kolom, fase gerak dipompa dengan tekanan
tinggi. Di samping itu, kinerja tingginya dalam analisis didukung dengan adanya
berbagai sistem deteksi dengan kepekaan tinggi yang dapat diintegrasikan dengan
sistem kromatografinya.
HPLC adalah singkatan dari High Performance Liquid Chromatography, yaitu
alat yang berfungsi mendorong analit melalui sebuah kolom dari fase diam ( yaitu
sebuah tube dengan partikel bulat kecil dengan permukaan kimia tertentu) dengan
memompa cairan (fase bergerak) pada tekanan tinggi melalui kolom. HPLC secara
mendasar merupakan perkembangan tingkat tinggi dari kromatografi kolom. Selain
dari pelarut yang menetes melalui kolom dibawah grafitasi, didukung melalui tekanan
tinggi sampai dengan 400 atm. Ini membuatnya lebih cepat.
         HPLC memperbolehkan penggunaan partikel yang berukuran sangat kecil
untuk material terpadatkan dalam kolom yang mana akan memberi luas permukaan
yang lebih besar berinteraksi antara fase diam dan molekul-molekul yang
melintasinya. Hal ini memungkinkan pemisahan yang lebih baik dari komponen-
komponen dalam campuran.Sampel yang akan dianalisis dijadikan dalam volume
yang kecil dari fase bergerak dan diubah melalui reaksi kimia oleh fase diam ketika
sampel melalui sepanjang kolom. Tujuan penggunaan alat ini adalah mengetahui
kadar asam organik.
      Banyak dari pengubahan tergantung dari sifat alami analit, fase diam, dan fase
bergerak. Waktu saat analit keluar dari ujung kolom disebut waktu retensi dan
merupakan suatu karakteristik yang unik dari tiap analit. Penggunaan dari tekanan
menaikkan kecepatan linear memberikan lebih sedikit waktu bagi analit untuk
berdifusi, dan menghasilkan chromatogram. Pelarut yang banyak digunakan yaitu air
dan zat-zat organik seperti methanol.  Jika sampel mula-mula berbentuk padatan harus
di-distruksi dulu kemudian di-treatment sehingga berupa larutan homogen yang tidak
terdapat endapan lagi dan bening, karena syarat sampel yang dapat dianalisa
menggunakan HPLC adalah harus tidak ada endapan dan harus bening.
 KCKT dapat dipandang sebagai pelengkap Kromatografi gas (KG), keduanya
dapat digunakan untuk menghasilkan efek pemisahan yang sama baiknya. Bila
derivatisasi diperlukan dalam KG, namun pada KCKT zat-zat yang tidak
diderivatisasi dapat dianalisis. Untuk zat-zat yang labil pada pemanasan atau tidak
menguap, KCKT adalah pilihan utama. Namun demikian bukan berarti KCKT
menggantikan KG, tetapi akan memainkan peranan lebih besar dalam analisis.
KCKT menawarkan beberapa keuntungan dibanding dengan metode kromatografi
lainnya, antara lain :

a) Cepat :: waktu analisis umumnya kurang dari 1 jam. Banyak analisis yang dapat
diselesaikan sekitar 15-30 menit. Untuk analisis yang  uncomplicated waktu analisis
kurang dari 5 menit bisa dicapai.
b) Resolusi tinggi :: berbeda dengan KG, interaksi selektif dapat terjadi pada KCKT
karena pengaruh yang besar dari fase diam dan fase geraknya.
c) Sensitivitas detektor :: detektor absorbsi UV yang biasa digunakan dalam KCKT
dapat mendeteksi kadar dalam jumlah nanogram (10-9 gram) dari bermacam-macam
zat. Detektor-detektor fluoresensi dan elektrokimia dapat mendeteksi jumlah sampai
picogram (10-12 gram).
d) kolom dapat digunakan kembali :: berbeda dengan kolom kromatografi klasik,
kolom KCKT dapat digunakan kembali. Banyak analisis yang bisa dilakukan dengan
kolom yang sama sehingga satu kolom dapat digunakan berulang kali untuk berbagai
jenis sampel.
e) Ideal untuk zat termolabil dan volatilitas rendah :: zat-zat yang tidak bisa dianalisis
dengan KG karena terurai oleh suhu  tinggi atau volatilitasnya rendah dan dapat
dianalisis secara KCKT.
f) Mekanisme pemisahan lebih variatif :: banyaknya pilihan fase gerak dan fase diam
yang digunakan serta besarnya interaksi analit terhadap fase diam dan fase gerak
memungkinkan terjadinya pemisahan dengan berbagai mekanisme.
g) Mudah rekoveri sampel :: umumnya detektor yang digunakan dalam KCKT tidak
menyebabkan kerusakan pada komponen sampel yang diperiksa, sehingga komponen
sampel tersebut dapat dengan mudah dikumpulkan setelah melewati detektor.
Namun, jika dibandingkan dengan kromatografi lapis tipis kinerja tinggi, KCKT
memiliki beberapa kelemahan, yaitu :
1. Tidak dapat menganalisis lebih dari satu jenis sampel sekaligus
2. Kromatogram tidak dapat disimpan sebagai dokumen otentik

Kromatografi cair kinerja tinggi merupakan suatu metode pemisahan canggih

dalam analisis farmasi yang dapat digunakan sebagai uji identitas, uji kemurnian dan
penetapan kadar. Titik beratnya adalah untuk analisis senyawa-senyawa yang tidak
mudah menguap dan tidak stabil pada suhu tinggi, yang tidak bisa dianalisis dengan
metode KG. Banyak senyawa yang dapat dianalisis dengan KCKT mulai dari
senyawa ion anorganik sampai senyawa organik makromolekul. Untuk analisis dan
pemisahan obat/bahan obat campuran rasemis optis aktif dikembangkan suatu fase
pemisahan kiral yang mampu menetukan rasemis dan isomer aktif.
Walaupun disadari biaya yang dibutuhkan untuk analisis dengan KCKT sangat mahal,
namun metode ini tetap dipilih untuk digunakan menganalisis 277 obat / bahan obat
karena hasil analisis yang memiliki akurasi dan presisi yang tinggi dalam waktu
analisis yang cepat.
Secara umum KCKT digunakan dalam kondisi-kondisi berikut:
 1.                  Pemisahan berbagai senyawa organik maupun anorganik, ataupun spesimen
biologis
2.                  Analisis ketidakmurnian (impurities)
3.                  Analisis senyawa-senyawa yang tak mudah menguap (non-volatil)
4.                  Penentuan molekul-molekul netral, ionik maupun zwitter ion
5.                  Isolasi dan pemurnian senyawa
6.                  Pemisahan senyawa-senyawa dengan struktur kimia yang mirip
7.                  Pemisahan senyawa-senyawa dalam jumlah kecil (trace elements)

B. Konsep Dasar HPLC

C. Prinsip Kerja Alat

Adapun prinsip kerja dari KCKT adalah suatu tekhnik yang mana solut atau
zat terlarut terpisah perbedaan kecepatan elusi, dikarenakan solut-solut ini melewati
suatu kolom kromatografi. Pemisahan solut-solut ini diatur oleh distribusi solut dalam
fase gerak dan fase diam
Kerja HPLC pada prinsipnya adalah pemisahan analit-analit berdasarkan
kepolarannya, alatnya terdiri dari kolom (sebagai fasa diam) dan larutan tertentu
sebagai fasa geraknya. Yang paling membedakan HPLC dengan kromatografi lainnya
adalah pada HPLC digunakan tekanan tinggi untuk mendorong fasa gerak. Campuran
analit akan terpisah berdasarkan kepolarannya, dan kecepatannya untuk sampai ke
detektor (waktu retensinya) akan berbeda, hal ini akan teramati pada spektrum yang
puncak-puncaknya terpisah.
Urutan skala polaritas : golongan fluorocarbon < golongan hidrokarbon < senyawa
terhalogenasi < golongan eter < golongan ester < golongan keton < golongan alkohol
< golongan asam.
HPLC dapat menganalisa secara kualitatif dan kuantitatif. Pada proses
kualitatif cara yang paling umum untuk mengidentifikasi adalah dengan melihat
Retention time (RT). Peak yang mempunyai RT yang sama dengan standard
umumnya adalah sebagai peak milik analat. Selain melihat RT hal lain yang perlu
dilihat adalah spektrum 3D dari signal kromatogram. Zat yang sama akan mempunyai
spektrum 3D yang juga sama. Sehingga jika spektrum 3D antara dua zat berbeda,
maka kedua zat tersebut juga dipastikan adalah zat yang berlainan, meskipun
memiliki RT yang sama.
Kemudian melalui analisa kuantitatif dapat diketahui kadar komponen yang dianalisis
di dalam sampel.  Yang berperan dalam proses separasi pada system HPLC adalah
 kolom. Ada kolom yang digunakan untuk beberapa jenis analisa, misalnya kolom C18
yang dapat digunakan untuk analisa carotenoid, protein, lovastatin, dan sebagainya.
Namun ada juga kolom yang khusus dibuat untuk tujuan analisa tertentu, seperti
kolom Zorbax carbohydrat (Agilent) yang khusus digunakan untuk analisa
karbohidrat (mono-, di-, polysakarida). Keberhasilan proses separasi sangat
dipengaruhi oleh pemilihan jenis kolom dan juga fasa mobil.
Setelah komponen dalam sample berhasil dipisahkan, tahap selanjutnya adalah
proses identifikasi. Hasil analisa HPLC diperoleh dalam bentuk signal kromatogram.
Dalam kromatogram akan terdapat peak-peak yang menggambarkan banyaknya jenis
komponen dalam sample.
Sample yang mengandung banyak komponen didalamnya akan mempunyai
kromatogram dengan banyak peak. Bahkan tak jarang antar peak saling bertumpuk
(overlap). Hal ini akan menyulitkan dalam identifikasi dan perhitungan konsentrasi.
Oleh karena itu biasanya untuk sample jenis ini dilakukan tahapan preparasi sample
yang lebih rumit agar sample yang siap diinjeksikan ke HPLC sudah cukup bersih
dari impuritis. Sample farmasi biasanya jauh lebih mudah karena sedikit mengandung
komponen selain zat aktif. Sample ini umumnya hanya melalui proses pelarutan saja.
D.

Komponen Alat Dan Kegunaannya

 Pompa (Pump)
Ada dua tipe pompa yang digunakan, yaitu pompa kinerja konstan (constant pressure) dan
pompa pemindahan konstan (constant displacement). Pemindahan konstan dapat
dibagi
menjadi dua, yaitu: pompa reciprocating dan pompa syringe. Pompa reciprocating
menghasilkan suatu aliran yang berdenyut teratur (pulsating), oleh karena itu
membutuhkan
peredam pulsa atau peredam elektronik untuk, menghasilkan garis dasar (base line)
detektor
yang stabil, bila detektor sensitif terhadapan aliran. Keuntungan utamanya ialah
ukuran
reservoir tidak terbatas. Pompa syringe memberikan aliran yang tidak berdenyut,
tetapi
reservoirnya terbatas.
·         Syarat – syarat pompa yang ideal:
1)      Mampu membangkitkan tekanan tinggi
2)      Pulse free – out put
3)      Control laju alir yang akurat
4)      Tahan korosi
5)      Terbuat dari bahan yang tahan terhadap fasa gerak
6)      Bebas pulsa
7)      Perlu“de gasser”
8)      Dapat menyalurkan fasa gerak pada rentang kecepatan dan tekanan lebar
9)      Dapat digunakan untuk melakukan elusi gradien
10)  Bekerja pada tekanan sampai 6000 psi (400 atm)
2.      Detektor (Detector)
Suatu detektor dibutuhkan untuk mendeteksi adanya komponen sampel di dalam
kolom (analisis kualitatif) dan menghitung kadamya (analisis kuantitatif). Detektor
yang baik
memiliki sensitifitas yang tinggi, gangguan (noise) yang rendah, kisar respons linier
yang
luas, dan memberi respons untuk semua tipe senyawa. Suatu kepekaan yang rendah
terhadap
aliran dan fluktuasi temperatur sangat diinginkan, tetapi tidak selalu dapat diperoleh.
Jenis – jenis detector
· SpektrofotometerUV –Visible
· Indeks bias
· Spektrofluorimeter( zatberfluoresensi)
· Konduktivitaslistrik( zationik)
· Spektrometerinfra merah

· Spektrometermassa( LC –MS )
· SpektrometerNMR ( LC –NMR )
Detektor KCKT yang umum digunakan adalah detektor UV 254 nm. Variabel panjang
gelombang dapat digunakan untuk mendeteksi banyak senyawa dengan range yang
lebih luas.
Detektor indeks refraksi juga digunakan secara luas, terutama pada kromatografi
eksklusi,
tetapi umumnya kurang sensitif jika dibandingkan dengan detektor UV.

3.      Injektor (injector)
Injektor merupakan tempat untuk memasukkkan sempel ke kolom. Waktu yang
dibutuhkan
oleh senyawa untuk bergerak melalui kolom menuju detektor disebut sebagai waktu
retensi.
Waktu retensi diukur berdasarkan waktu dimana sampel diinjeksikan sampai sampel
menunjukkan ketinggian puncak yang maksimum dari senyawa itu. Senyawa-senyawa
yang
berbeda memiliki waktu retensi yang berbeda. Untuk beberapa senyawa, waktu retensi
akan
sangat bervariasi dan bergantung pada:
·         tekanan yang digunakan (karena itu akan berpengaruh pada laju alir dari
pelarut)
·         kondisi dari fase diam (tidak hanya terbuat dari material apa, tetapi juga pada
ukuran
·         partikel)
·         komposisi yang tepat dari pelarut
·         temperatur pada kolom

4.      Elusi Gradien
Elusi Gradien didefinisikan sebagai penambahan kekuatan fasa gerak selama analisis
kromatografi berlangsung. Efek dari Elusi Gradien adalah mempersingkat waktu
retensi dari
senyawa-senyawa yang tertahan kuat pada kolom. Dasar-dasar elusi gradien
dijelaskan oleh
Snyder.
Elusi Gradien menawarkan beberapa keuntungan :
a.              Total waktu analisis dapat direduksi
b.              Resolusi persatuan waktu setiap senyawa dalam campuran bertambah
c.              Ketajaman Peak bertambah (menghilangkan tailing)
d.             Efek sensitivitas bertambah karena sedikit variasi pada peak
5.       Kolom (Column)
Berbeda dengan kolom kromatografi klasik, kolom KCKT dapat digunakan kembali
(reusable) . Banyak analisis yang bisa dilakukan dengan kolom yang sama sebelum
dari jenis
sampel yang diinjeksi, kebersihan dari solven dan jenis solven yang digunakan.
Kolom diisi dengan partikel padatan yang berukuran kecil dilapisi secara kimia oleh
suatu
cairan yang berfungsi sebagai fasa diam. Komponen-komponen sample dibawa oleh
cairan
fasa gerak yang dialirkan dengan bantuan tekanan tinggi melewati kolom fasa diam.
Komponen-komponen dipisahkan berdasarkan partisi antara fasa diam dan fasa gerak
yang
satu sama lain tidak bercampur.
Efisiensi kolom salah satunya sangat tegantung dari besarnya partikel fase stasioner.
Oleh
karena itu bila ukuran fase stasioner lebih kecil, maka tinggi plat teoritik akan
berkurang,
sehingga jumlah plat teoritik akan bertambah, yang meningkatkan efisiensi kolom.
Dengan
kolom yang pendek dan efisiensi, pemisahan akan berjalan dengan cepat. Terdapat
banyak
analisis yang dikerjakan pada suhu kamar, suhu kolom sering dapat diatur dengan
konstan
dengan memakai cara pemanasan. Sering dibutuhkan suhu kolom yang lebih tinggi
dari suhu
kamar untuk mengatasi masalah daya larut solute yang dianalisis dan viskositas fase
gerak
yang agak tinggi.

6.     Pengolahan Data (Data Handling)

Hasil dari pemisahan kromatografi biasanya ditampilkan dalam bentuk kromatogram

pada rekorder.waktu retensi dan volume retensi dapat diketahui atau dihitung. Ini bisa
digunakanuntuk mengidentifikasi secara kualitatif suatu komponen, bila kondisi kerja
dapat dikontrol. Lebar puncak dan tinggi puncak sebanding atau proporsional dengan
konsentrasi dan dapat digunakan untuk memperoleh hasil secara kuantitatif.
E. Cara Penggunaan Alat

Langkah-langkah menganalisa menggunakan HPLC yaitu mula-mula sampel diinjeksi

dengan syringe. Kemudian sampel masuk ke injection hall. Dari injection hall ini proses
utama cara kerja HPLC dimulai, yaitu dengan memompa sampel ke kolom oleh LC20AT
dalam tekanan tinggi.
Dari kolom, sampel dijadikan fase bergerak dan diolah dengan fase diam yaitu biasanya
H2SO4 0,05 N dan CH3OH berdasarkan afinitas elektron. Setelah terpisah, dengan
berbagai perhitungan matematis, HPLC yang sudah disambungkan dengan komputer ini
memberikan pembacaan berupa peak. Setelah itu kita mencari luasan di bawah peak
untuk mengetahui kadar analit.
Rumus perhitungannya adalah y = ½ b.h yaitu persamaan yang diplotkan dengan least
square. Sesuai dengan pengerjaan least square, maka sebelum menggunakan HPLC untuk
analit, kita harus membuat kurva standar terlebih dahulu dengan menggunakan larutan
standar.
     Elusi Gradien didefinisikan sebagai penambahan kekuatan fasa gerak selama analisis
kromatografi berlangsung. Efek  dari Elusi Gradien adalah  mempersingkat waktu retensi
dari senyawa-senyawa yang  tertahan kuat pada kolom.
Diagram alir HPLC

Adapun cara untuk melihat seluruh proses diagram alir HPLC, antara lain:

a.    Injeksi sample
               Proses ini meliputi tekanan, tidak sama halnya dengan kromatografi gas.
b.    Waktu retensi
        Waktu yang dibutuhkan oleh senyawa untuk bergerak melalui kolom menuju
detektor Waktu retensi diukur berdasarkan waktu dimana sampel diinjeksikan sampai
sampel menunjukkan ketinggian puncak yang maksimum dari senyawa itu. Senyawa-
senyawa yang berbeda memiliki waktu retensi yang berbeda.
c.    Detektor
            Ada beberapa cara untuk mendeteksi substansi yang telah melewati kolom.
Metode umum yang mudah dipakai untuk menjelaskan yaitu penggunaan serapan ultra-
violet.
d.      Interpretasi output dari detector
         Output akan direkam sebagai rangkaian puncak-puncak, dimana masing-masing
puncak mewakili satu senyawa dalam campuran yang melalui detektor dan menyerap
sinar UV. Area yang berada dibawah puncak sebanding dengan jumlah X yang melalui
detektor, dan area ini dapat dihitung secara otomatis melalui layar komputer. Area
dihitung sebagai bagian yang berwarna hijau dalam gambar (sangat sederhana).Jika
larutan X kurang pekat, area dibawah puncak akan berkurang meskipun waktu retensi
akan sama.
http://kimia40.blogspot.com/2016/10/makalah-kromatografi-cair-kinerja.html?m=1
https://aryadhede.blogspot.com/2016/08/v-behaviorurldefaultvmlo.html?m=1

http://putrawan-bachriul999.blogspot.com/2012/05/hplc.html?m=1