TUGAS TENTANG KROMATOGRAFI CAIR KINERJA TINGGI

1. Sebutkan jenis-jenis kromatografi dan jelaskan perbedaannya!

2. Jelaskan prinsip kerja kromatografi gas dan kromatografi cair kinerja tinggi!
3. Sebutkan komponen alat kromatografi cair kinerja tinggi beserta fungsinya masing-masing!
4. Dalam kromatografi cair kinerja tinggi pada fase geraknya dikenal dengan isokrat dan gradien.
Apa yang dimaksud dengan dengan isokrat dan gradien?
5. Fase diam pada kromatografi cair kinerja tinggi terbuat dari apa? Serta sebutkan contohnya
untuk setiap fase diam berdasarkan sifatnya!

1.
Kromatografi Cair (Liquid Chromatography)
Kromatografi cairu adalah teknik yang sangat tepat untuk memisahkan ion atau molekul
yang terlarut dalam suatu larutan. Jika larutan sampel berinteraksi dengan fase
stasioner, maka molekul-molekulnya yang ada didalam berinteraski dengan fase
stasioner. Tetapi interaksinya berbeda disebabkan adanya perberdaan daya serap
(adsorption), pertukaran ion (ion exchange), partisi (partitioning) atau ukuran.
Perbedaan tersebut menjadikan komponen terpisah satu dengan yang lain dan bisa
dilihat perbedaannya dari lamanya waktu transit komponen tersebut melewati kolom.
Jenis dari kromatografi cair yaitu :

Kromatografi Fase Terbalik (Reverse Phrase Chromatography)

Kromatografi fase terbalik adalah alat analitikal yang kuat dengan adanya perpaduan
sifat hidrofobik dan juga rendahnya polaritas fase stasioner yang terikat secara kimia
pada padatan inert seperti silika. Metode ini seringkali dipakai untuk proses ekstraksi
dan pemisahan senyawa yang sulit menguap (non-volatile)

Kromatografi Cair Kinerja Tinggi, KCKT (High Performance Liquid

Chromatography)

High performance liquid chromatography (HPLC) memiliki prinsip yang sama dengan
reverse phrase. Namun dalam metode ini, dipakai tekanan dan kecepatan yang tinggi.
Kolom yang dipakai dalam HPLC lebih pendek dan memiliki diameter kecil, tetapi bisa
menghasilkan beberapa tingkatan equilibrium dengan jumlah besar.
Size Exclusion Chromatography

Size exclusion chromatography disebut juga dengan gel permetation atau filtration
chromatography sering kali dipakai untuk memisahkan dan memurnikan protein.
Metode ini tidak mencampuri berbagai jenis penyerapan dan sangat cepat. Perangkat
kromatografinya serupa gel berpori yang bisa memisahkan molekul besar dan molekul
kecil. Molekul besar akan terelusi lebih dullu dikarenakan molekul tersebut tidak bisa
penetrasi pada pori-pori.

Kromatografi Perkutarakan Ion (Ion Exchange Chromatography)

Kromatografi pertukaran ion sering kali dipakai dalam pemurnian materi biologis, seperti
asam amino, peptida, protein. Dengan metode ini bisa dilakukan dengan dua tipe, yaitu
dalam kolom ataupun ruang datar. Ada dua tipe pertukaran ion:

-Pertukaran kation (cation exchange): fase stasioner mempunyai muatan negative

-Pertukaran anion (anion exchange): fase stasioner mempunyai muatan positif.

Molekul bermuatan yang terletak pada fase cair akan melewati kolom. Jika muatan
pada molekul sama dengan kolom maka molekul tersebut akan terelusi. Tetapi apabila
muatan pada molekul tidak sama dengan muatan kolom. Untuk mengelusi molekul
yang menempel pada kolom dibutuhkan penambahan larutan dengan kadar PH dan
kekuatan ionik tertentu.

Pemisahan menggunakan metode ini sangat selektif dan karena biaya untuk
mengoperasikan metodi ini murah dan juga kapasistasnya tinggi. Jadi metode ini
seringkali dipakai pada awal proses keseluruhan.

Secara Umum.

kromatografi dibagi menjadi dua jenis, yaitu kromatografi cair dan kromatografi gas.
Kromatografi cair mempunyai beberap jenis yang terdiri dari

-.Kromatografi kertas atau kromatografi partisi

-.Kromatografi kolom

-.Kromatografi lapis tipis atau absorbsi.

Dari tiga jenis kromatografi cair tersebut, berikut ini adalah penjelasannya.
-Kromatografi Kertas
Yaitu kromatografi yang memakai fase diam kertas yaitu kertas yang terkandung
selulosa didalamnya, sedangkan yang dipakai sebagai fase geraknya adalah pelarut
atau campuran pelarut yang sesuai. Kertas yang melakukan tindakan sebagai fase
diam akan dicelupkan ke dalam sampel atau pelarut, lalu sampel dan pelarut dengan
gaya kapilaritas akan terserap dan bergerak keatas. Kromatografi kertas ini dipakai
dalam memisahkan tinta, zat pewarna, senyawa tumbuhan misalnya klorofil, make up
dan zat lain.

-Kromatografi kolom

Yaitu jenis kromatografi yang menggunakan kolom gelas pada metodenya. Proses
kromatografi jenis ini umumnya dipakai untuk memisahkan pigmen pada tumbuhan.
Campuran pigmen lalu dimasukkan pada kolom gelas yangisinya aluminia. Pelarut lalu
dialirkan supaya membawa campura melalui kolom. Pigmen akan berjalan turun melalui
kolom dengan kecepatan yang tergantung pada kuat atau tidaknya adsorbsi pigmen
pada aluminia. Pigmen yang terarsorbsi lemah pada aluminia akan melewati kolom
dengan cepat daripada pigmen yang terarsorbsi kuat. Pigmen lalu terpisah dan menjadi
satu pada tempat berbeda ketika keluar dari kolom.

-Kromatografi Lapis Tipis

Kromatografi lapis tipis adalah teknik analisis kualitatif berasal dari sampel yang hendak
diperiksa dengan memisahkan komponen sampel berdasarkan perbedaan kepolaran.
Prinsip kerja kromatografi lapis tipis adalah memisahkan sampel berdasarkan
perbedaan kepolaran antara sampel dengan pelarut yang dipakai. Umumnya teknik
kromatografi jenis ini memakai plat silika sebagai fase diam dan fase gerak yang
dipakai disesuaikan dengan jenis sampel yang hendak dipisahkan. Larutan atau
campuran yang dipakai disebut eluen.

2.
1. Kromatografi Gas (GC)

Adalah teknik pemisahan berdasarkan perbedaan kecepatan migrasi komponen

penyusun senyawa. Instrumen ini memiliki fungsi untuk menganalisa struktur molekul
senyawa dan memisahkan fraksi-fraksi kimia dalam senyawa. serta massa partikel dan
konsentrasinya. Oleh sebab itu penggabungan kedua alat tersebut sudah menjadi
lumrah dan biasa digunakan, karena keduanya saling berkesinambungan dan memiliki
fungsi yang mendukung untuk analisis satu sama lain.
-Prinsip Kerja Kromatografi Gas
Prinsip mekanisme kromatografi gas diawali dengan cuplikan diinjeksikan ke dalam
injektor kemudian diuapkan hingga cuplikan berubah menjadi uap atau gas. Cuplikan
yang berbentuk gas dibawa oleh gas pembawa dengan laju alir yang konstan masuk
dalam kolom pemisah. Komponen-komponen sampel akan terpisah pada saat melewati
kolom karena adanya perbedaan daya adsorpsi fasa diam terhadap komponen-
komponen sampel. Komponen yang sudah terpisah akan didorong oleh fasa gerak
untuk bergerak di sepanjang kolom berupa pita-pita. Setelah sampel dipisahkan
menjadi komponen-komponennya, masing-masing komponen tersebut akan keluar dari
kolom bersama fasa gerak. Konsentrasi komponen tersebut dapat diukur dengan suatu
detektor yang akan menghasilkan sinyal dan dikirim ke pencatat. Komponen-komponen
dari sampel yang telah terpisahkan akan menghasilkan kurva-kurva karena masing-
masing komponen tersebut ditahan pada kolom dalam waktu berbeda-beda. Lamanya
waktu suatu komponen ditahan oleh kolom adsorpsi merupakan ciri khas komponen
yang disebut sebagai waktu retensi atau waktu tambat. Hal ini sangat berkaitan erat
dengan analisis secara kualitatif, yang dimana dalam prosesnya, parameter hasil
pemisahan yang digunakan adalah waktu retensi. Waktu retensi sejak penyuntikan
hingga terbentuknya puncak maksimum, sifat ini merupakan ciri khas cuplikan dan fasa
cair pada suhu tertentu. Dengan menggunakan aliran yang tepat dan pengendalian
suhu, waktu retensi dapat terulang dalam batas 1% dan dapat digunakan untuk
mengidentifikasi tiap puncak. Beberapa senyawa mungkin mempunyai waktu retensi
yang sama atau berdekatan, tetapi tiap senyawa hanya mempunyai satu waktu retensi
saja.Itu sebabnya, ketelitian amat sangat diperlukan ketika sedang mengoperasikan
alat ini, agar waktu retensi yang berjalan tidak terlewat begitu saja.

2. Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (High performance liquid chromatography)

adalah sebuah teknik analisis untuk identifikasi zat/senyawa dan memisahkan serta
mengukur jumlahnya dalam suatu larutan campuran. HPLC ini sering digunakan
pada laboratorium kimia (quality control) makanan, limbah, biologi maupun farmasi. Di
industri farmasi sendiri hampir pasti ada unit HPLC yang digunakan untuk menguji
kadar bahan baku, bahan antara maupun produk jadi. HPLC merupakan tipe
kromatografi kolom yang secara luas digunakan di farmasi. HPLC ini sangat berguna
untuk menentukan kadar dan kadar zat terkait pada obat. Secara umum HPLC
digunakan untuk memisahkan komponen zat dalam obat.

-Prinsip kerja kromatografi cair kinerja tinggi (HPLC)

HPLC merupakan jenis dari kromatografi kolom dan bekerja dengan prinsip yang sama.
Prinsip utama dari kromatografi kolom adalah adanya adsorbsi (penempelan
permukaan) dari solut (cairan sampel) ke dalam larutan melalui fase diam yang
menyebabkan adanya pemisahan solut dengan larutan. Tingkat adsorbsi tergantung
pada afinitas dari fase diam dan fase gerak. Fase diam terdiri dari adsorben seperti
silika.
HPLC berfungsi sama dengan prinsip kromatografi diatas. Campuran sampel atau
analit yang terlarut dalam cairan larutan dipompa. Ini akan menjadi fase geraknya, jadi
analit masuk ke dalam fase gerak. Larutan fase gerak ini karena dipompa maka
bergerak melewati fase diam dengan tekanan yang tinggi. Fase diam terdiri dari kolom
atau disebut juga kolom HPLC. Ketika sampel dilewatkan pada kolom maka akan
berinteraksi dengan dua fase tersebut (fase diam dan fase gerak).

Prinsip kerja HPLC adalah pemisahan komponen analit berdasarkan kepolarannya,

setiap campuran yang keluar akan terdeteksi dengan detektor dan direkam dalam
bentuk kromatogram. Dimana jumlah peak menyatakan jumlah komponen, sedangkan
luas peak menyatakan konsentrasi komponen dalam campuran. Interkasi analait
pada fase diam dan fase gerak menyebabkan pemisahan.

Pemisahan ini didorong oleh kekuatan interaksi dan kepolaran. Bila analit lebih polar dia
akan menempel ke fase yang lebih polar, bila fase diam lebih polar maka analit akan
banyak menempel di dase diam. Akhirnya akan menciptakan pemisahan-pemisahan
fase. Deteksi menggunakan detektor (UV-VIS) akan mengenali pemisahan analit ini
setelah melewati kolom HPLC. SIgnal akan dikonversi dan direkam oleh komputer dan
ditunjukkan menjadi kromatogram. Fase gerak biasanya adalah campran air, asetonitril
dan metanol. Berbagai komponen campuran berinteraksi pada berbagai tingkatan
karena interaksi fase diam dan gerak.

3.

SISTEM PERALATAN HPLC

Instrumentasi HPLC pada dasarnya terdiri atas: wadah fase gerak, pompa, alat untuk
memasukkan sampel (tempat injeksi), kolom, detektor, wadah penampung buangan
fase gerak, dan suatu komputer atau integrator atau perekam.

Diagram skematik sistem kromatografi cair seperti ini :

1.Wadah fase gerak dan fase gerak

Wadah fase gerak harus bersih dan lembam (inert). Wadah pelarut kosong ataupun
labu laboratorium dapat digunakan sebagai wadah fase gerak. Wadah ini biasanya
dapat menampung fase gerak antara 1 sampai 2 liter pelarut.Fase gerak atau eluen
biasanya terdiri atas campuran pelarut yang dapat bercampur yang secara keseluruhan
berperan dalam daya elusi dan resolusi. Daya elusi dan resolusi ini ditentukan oleh
polaritas keseluruhan pelarut, polaritas fase diam, dan sifat komponen-komponen
sampel. Untuk fase normal (fase diam lebih polar daripada fase gerak), kemampuan
elusi meningkat dengan meningkatnya polaritas pelarut. Sementara untuk fase terbalik
(fase diam kurang polar daripada fase gerak), kemampuan elusi menurun dengan
meningkatnya polaritas pelarut.

Fase gerak sebelum digunakan harus disaring terlebih dahulu untuk menghindari
partikel-partikel kecil ini. Selain itu, adanya gas dalam fase gerak juga harus
dihilangkan, sebab adanya gas akan berkumpul dengan komponen lain terutama di
pompa dan detektor sehingga akan mengacaukan analisis.

Elusi dapat dilakukan dengan cara isokratik (komposisi fase gerak tetap selama elusi)
atau dengan cara bergradien (komposisi fase gerak berubah-ubah selama elusi) yang
analog dengan pemrograman suhu pada kromatografi gas. Elusi bergradien digunakan
untuk meningkatkan resolusi campuran yang kompleks terutama jika sampel
mempunyai kisaran polaritas yang luas.
 
Fase gerak yang paling sering digunakan untuk pemisahan dengan fase terbalik adalah
campuran larutan bufer dengan metanol atau campuran air dengan asetonitril. Untuk
pemisahan dengan fase normal, fase gerak yang paling sering digunakan adalah
campuran pelarut-pelarut hidrokarbon dengan pelarut yang terklorisasi atau
menggunakan pelarut-pelarut jenis alkohol. Pemisahan dengan fase normal ini kurang
umum dibanding dengan fase terbalik.

2. Pompa
Pompa yang cocok digunakan untuk HPLC adalah pompa yang mempunyai syarat
sebagaimana syarat wadah pelarut yakni: pompa harus inert terhadap fase gerak.
Bahan yang umum dipakai untuk pompa adalah gelas, baja tahan karat, Teflon, dan
batu nilam. Pompa yang digunakan sebaiknya mampu memberikan tekanan sampai
5000 psi dan mampu mengalirkan fase gerak dengan kecepatan alir 3 mL/menit. Untuk
tujuan preparatif, pompa yang digunakan harus mampu mengalirkan fase gerak dengan
kecepatan 20 mL/menit.
Tujuan penggunaan pompa atau sistem penghantaran fase gerak adalah untuk
menjamin proses penghantaran fase gerak berlangsung secara tepat, reprodusibel,
konstan, dan bebas dari gangguan. Ada 2 jenis pompa dalam HPLC yaitu: pompa
dengan tekanan konstan, dan pompa dengan aliran fase gerak yang konstan. Tipe
pompa dengan aliran fase gerak yang konstan sejauh ini lebih umum dibandingkan
dengan tipe pompa dengan tekanan konstan.

3. Tempat penyuntikan sampel

Sampel-sampel cair dan larutan disuntikkan secara langsung ke dalam fase gerak yang
mengalir di bawah tekanan menuju kolom menggunakan alat penyuntik yang terbuat
dari tembaga tahan karat dan katup teflon yang dilengkapi dengan keluk sampel
(sample loop) internal atau eksternal.
4. Kolom dan Fase diam
Ada 2 jenis kolom pada HPLC yaitu kolom konvensional dan kolom mikrobor. Kolom
merupakan bagian HPLC yang mana terdapat fase diam untuk berlangsungnya proses
pemisahan solut/analit.

Kolom mikrobor mempunyai 3 keuntungan yang utama dibanding dengan kolom

konvensional, yakni:

 Konsumsi fase gerak kolom mikrobor hanya 80% atau lebih kecil dibanding
dengan kolom konvensional karena pada kolom mikrobor kecepatan alir fase
gerak lebih lambat (10 -100 μl/menit).

 Adanya aliran fase gerak yang lebih lambat membuat kolom mikrobor lebih ideal
jika digabung dengan spektrometer massa.

 Sensitivitas kolom mikrobor ditingkatkan karena solut lebih pekat, karenanya

jenis kolom ini sangat bermanfaat jika jumlah sampel terbatas misal sampel
klinis.

1. Meskipun demikian, dalam prakteknya, kolom mikrobor ini tidak setahan kolom
konvensional dan kurang bermanfaat untuk analisis rutin. Mempunyai respon
terhadap solut yang cepat dan reprodusibel.
2. Mempunyai sensitifitas yang tinggi, yakni mampu mendeteksi solut pada kadar
yang sangat kecil.
3. Stabil dalam pengopersiannya.
4. Mempunyai sel volume yang kecil sehingga mampu meminimalkan pelebaran
pita.
5. Signal yang dihasilkan berbanding lurus dengan konsentrasi solut pada kisaran
yang luas (kisaran dinamis linier).
6. Tidak peka terhadap perubahan suhu dan kecepatan alir fase gerak.

Kebanyakan fase diam pada HPLC berupa silika yang dimodifikasi secara kimiawi,
silika yang tidak dimodifikasi, atau polimer-polimer stiren dan divinil benzen. Permukaan
silika adalah polar dan sedikit asam karena adanya residu gugus silanol (Si-OH).
Silika dapat dimodifikasi secara kimiawi dengan menggunakan reagen-reagen seperti
klorosilan. Reagen-reagen ini akan bereaksi dengan gugus silanol dan menggantinya
dengan gugus-gugus fungsional yang lain.
Oktadesil silika (ODS atau C18) merupakan fase diam yang paling banyak digunakan
karena mampu memisahkan senyawa-senyawa dengan kepolaran yang rendah,
sedang, maupun tinggi. Oktil atau rantai alkil yang lebih pendek lagi lebih sesuai untuk
solut yang polar. Silika-silika aminopropil dan sianopropil (nitril) lebih cocok sebagai
pengganti silika yang tidak dimodifikasi. Silika yang tidak dimodifikasi akan memberikan
waktu retensi yang bervariasi disebabkan karena adanya kandungan air yang
digunakan. 

5. Detektor HPLC

Detektor pada HPLC dikelompokkan menjadi 2 golongan yaitu: detektor universal (yang

mampu mendeteksi zat secara umum, tidak bersifat spesifik, dan tidak bersifat selektif)
seperti detektor indeks bias dan detektor spektrometri massa; dan golongan detektor
yang spesifik yang hanya akan mendeteksi analit secara spesifik dan selektif, seperti
detektor UV-Vis, detektor fluoresensi, dan elektrokimia.

Idealnya, suatu detektor harus mempunyai karakteristik sebagai berikut:

1. Mempunyai respon terhadap solut yang cepat dan reprodusibel.

2. Mempunyai sensitifitas yang tinggi, yakni mampu mendeteksi solut pada kadar
yang sangat kecil.
3. Stabil dalam pengopersiannya.
4. Mempunyai sel volume yang kecil sehingga mampu meminimalkan pelebaran
pita.
5. Signal yang dihasilkan berbanding lurus dengan konsentrasi solut pada kisaran
yang luas (kisaran dinamis linier).
6. Tidak peka terhadap perubahan suhu dan kecepatan alir fase gerak.
 4.

Isokratik adalah proses pemisahan dengan menggunakan komposisi pelarut yang

sama. Misalnya ingin memisahkan zat A pada suatu sampel, hanya menggunakan air
dan metanol dengan perbandingan tetap (80:20) hingga proses pemisahan selesai.

Gradien adalah proses pemisahan dengan komposisi pelarut berbeda. Misalnya ingin
memisahkan zat B dan C (sifat kepolarannya mirip) dari sampel. Menggunakan
komposisi pelarut pada 5 menit pertama, air saja (100). Lalu pada 5 menit selanjutnya,
menggunakan campuran air dan metanol (60:40). Lalu menit selanjutnya hingga akhir
pemisahan, menggunakan pelarut metanol saja (100).

5.