PENENTUAN KADAR PROTEIN

1. TUJUAN
a. Memahami penggunaan spektrofotometer sebagai alat menganalisis kadar
protein
b. Menjelaskan prinsip dasar penggunaan spektrofotometer
c. Terampil dalam menggunakan spektrofotometer
d. menentukan konsentrasi atau kadar protein sel hati ayam
2. TEORI
Protein merupakan makromolekul yang penting bagi mahkluk hidup. Protein
merupakan suatu polimer atau makromolekul. Satuan monomer pembentuk protein adalah
asam amino. Terdapat dua puluh jenis asam amino yang merupakan penyusun protein pada
mahkluk hidup (Campbell et al 2002). Banyak peran penting srotein dalam mahkluk hidup.
Peranan protein dalam mahkluk hidup seperti dapat berperan sebagai biokatalisator
(enzim), berperan dalam sistem pergerakan, berperan dalam sistem imun, dan sebagai
penentu ekspresi gen (Yuono T 2007). selain itu protein juga merupakan komponen
penyusun sel.
Analisis protein dapat dilakukan dengan dua cara, yaitu secara kualitatif dan secara
kuantitatif.  Analisis protein secara kualitatif terdiri atas reaksi Xantoprotein, reaksi Hopkins-
Cole, reaksi Millon, reaksi Nitroprusida, dan reaksi Sakaguchi.  Sedangkan analisis protein
secara kuantitatif terdiri dari metode Kjeldahl, metode titrasi formol, metode Lowry,
metode spektrofotometri visible (Biuret), dan metode spektrofotometri UV (Poedjiadi,
2007). Metode pengukuran kadar protein kali ini adalah metode Biuret. Metode ini
berprinsip pada reaksi yang terjadi antara ion tembaga dengan ikatan peptide yang ada
pada protein. Reaksi Biuret menggunakan tiga macam reagen, yaitu reagen A, B, dan C.
Reagen A mengandung CuSO4 dalam akuades. CuSO4 berfungsi sebagai penyedia ion Cu2+
untuk membentuk kompleks dengan protein. Reagen B mengandung KI dalam akuades. KI
berfungsi untuk mencegah terjadinya reduksi pada Cu 2+ sehingga tidak mengendap. Reagen
C mengandung Na-sitrat, Na2CO3, dan NaOH. Na-sitrat dan Na2CO3 berfungsi sebagai buffer
dan NaOH berfungsi untuk menyediakan seasana basa (Martono et al. 2012).
Uji ini dapat mendeteksi kehadiran ikatan peptida. Uji Biuret didasarkan pada reaksi
antara ion Cu2+ dan ikatan peptida dalam suasana basa. Warna kompleks ungu menunjukkan
adanya protein. Intensitas warna ynag dihasilkan merupakan ukuran jumlah ikatan peptida
yang ada dalam protein. Ion Cu 2+ dari pereaksi Biuret dalam suasana basa akan bereaksi
dengan polipeptida atau ikatan-ikatan peptide yang menyusun protein, dan membentuk
senyawa kompleks berwarna ungu atau violet. Reaksi ini positif terhadap dua buah ikatan
peptida atau lebih, tetapi negatif untuk asam amino bebas atau ikatan peptida. Protein
melarutkan hidroksida tembaga untuk membentuk kompleks warna. Reaksi pembentukan
warna ini dapat terjadi pada senyawa yang mengandung dua gugus karbonil yang berikatan
dengan nitrogen atau atom karbon. Kelebihan metode pengukuran dengan menggunakan
metode Biuret ialah mudah dilakukan dan menggunakan bahan yang murah. Namun,
kekurangannya ialah metode ini memerlukan bahan yang cukup karena sensitivitasnya yang
rendah (Pamungkas KR 2010).

3. ALAT DAN BAHAN

Alat: Bahan:
a. Erlemeyer a. Reagen biuret
b. Beker Glass b. BSA (Bovin serum albumin)
 c. Spektrofotometer diganti kasein
d. Kuvet c. NaOH 3 %
e. Labu takar d. Telur ayam
f. Pipet e. Hati ayam
g. Pipet volum f. Aquades
h. Tabung reaksi
4. PROSEDUR PERCOBAAN
1) Pembuatan Kurva Standar.
 menyiapkan tujuh buah tabung reaksi
 Tabung reaksi 1 diisi 0,1 ml BSA(2 mg/ml) dan 1,2 ml H2O,
 tabung 2 diisi 0,2 ml BSA(2mg/ml) dan 1,1 ml H2O,
 tabung 3 diisi 0,4 ml BSA ( 2 mg/ml) dan
 tabung 4 diisi 0,6 ml BSA (2 mg/ml) dan 0,7 ml H2O,
 tabung 5 diisi 0,8 ml (2 mg/ml) dan 0,5 ml H2O,
 tabung 6 diisi 1 ml BSA ( 2 mg/ml) dan 0,3 ml H2O, dan
 tabung 7 diisi 1,2 ml BSA ( 2 mg/ml) dan 0,1 ml H2O.
 Blanko dibuat dari 1,3 ml akuades.
 Kemudian, setiap tabung ditambahkan beberapa tetes NaOH dan 3 ml reagen
biuret dan vortex lalu diinkubasi 37oC selama 15 menit.
 Setiap tabung diukur absorbansinya menggunakan spektrofotometer dengan
panjang gelombang 540 nm.
 Kurva standar dapat dibuat dengan mengukur hubungan absorbandi dan
konsentrasi sehingga dapat digunakan untuk mengukur konstrasasi protein
(y=a+bx)
2) Penentuan konsentrasi protein sampel fraksi. Setiap tabung sampel diukur
absorbansinya menggunakan spektrofotometer dengan panjang gelombang 540
nm.
3) Untuk menentukan sampel fraksi dengan melakukan sentrifugasi terlebih
dahulu.
5. HASIL
Tabel 1. Analisis kuantitatif protein
Tabun Konsentrasi BSA
Absorbansi terukur Absorbansi terkoreksi
g (mg/mL)
Blanko 0.053 0 0
1 0.055 0.002 0.154
2 0.082 0.029 0.308
3
4
5
6
7
Contoh perhitungan:
absorbansi terkoreksi tabung 2= absorbansi terukur – absorbansi blanko
= 0.082 – 0.053
= 0.029
Tabung 1
 [BSA]
V1 x M1 = V2 x M2
0.1 mL x 2 mg/mL = 1.3 mL x M2
M2 = 0.154 mg/mL

0.16
f(x) = 0.08 x − 0
0.14 R² = 0.98

0.12

0.1
Absorbansi

0.08

0.06

0.04

0.02

0
0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2 1.4 1.6 1.8 2
Konsentrasi BSA

Gambar 1 Hubungan konsentrasi BSA dengan nilai absorbansi

Tabel 2 Analisis kuantitatif protein sampel

Absorbansi Absorbansi [Protein]
Fraksi Faktor pengenceran
terukur terkoreksi mg/ml
Blanko (0.05 ml) 0.062 0.000 0.000 0.000
Blanko (0.5 ml) 0.199 0.000 0.000 0.000
Homogenat 0.243 0.181 26.000 56.333
Inti
Mitokondria
Mikrosom
Sitosol
Contoh perhitungan:
Homogenat
Absorbansi terkoreksi = absorbansi terukur – absorbansi blanko
= 0.243 – 0.062
= 0.181
V akhir 1.3 mL
Faktor pengenceran ¿ = =26
V awal 0.05 mL
[Protein] : y = a + bx
y = -0.001 + 0.084x [Protein] = x * Faktor pengenceran
0.181 = -0.001 + 0.084x [Protein] = 2.167 * 26
x = 2.167 [Protein] = 56.333

6. PEMBAHASAN

7. KESIMPULAN

8. REFERENSI