One Health 12 (2021) 100241

Daftar isi tersedia di SainsLangsung

Satu Kesehatan

beranda jurnal: www.elsevier.com/locate/onehlt

Bakteri yang tidak aktif (paraprobiotik) mengekspresikan Bacillus thuringiensis

Cry5B sebagai terapi untuk Ascaris dan Parascaris sp. infeksi pada
hewan besar

Joseph F. Urban Jr Sebuah,b,**,1, Martin K. Nielsen c,1, David Gazzola d, Yue Xie Sebuah,b,e,
Ethiopia Besyah Sebuah,b, Yan Hu d,2, Hanchen Li d, Florentina Rus d, Kelly Flanagan d, Austin Draper f,
Sridhar Vakalapudi f, Robert W. Li Sebuah, Gary R. Ostroff d, Raffi V. Aroian d,*
Sebuah Departemen Pertanian AS, Layanan Penelitian Pertanian, Pusat Penelitian Pertanian Beltsville, Laboratorium Penyakit Hewan dan Parasit, Beltsville, MD, Amerika
Serikat
b Departemen Pertanian AS, Layanan Penelitian Pertanian, Pusat Penelitian Nutrisi Manusia Beltsville, Laboratorium Diet, Genomik dan Imunologi, Beltsville, MD, Amerika

Serikat
c MH Gluck Equine Research Center, Departemen Ilmu Kedokteran Hewan, University of Kentucky, Lexington, KY, Amerika Serikat

d Program Kedokteran Molekuler, Fakultas Kedokteran Universitas Massachusetts, Worcester, MA, Amerika Serikat

e Departemen Parasitologi, Fakultas Kedokteran Hewan, Universitas Pertanian Sichuan, Sichuan, Cina
f Fasilitas Biomanufaktur Sintetis, Universitas Negeri Utah, Logan, UT, Amerika Serikat

INFO ARTIKEL ABSTRAK

Kata kunci: Ascaris dan Parascaris adalah parasit penting dalam famili Ascarididae, nematoda usus besar yang hidup di mana-mana yang
Ascaris menginfeksi semua kelas vertebrata. Resistensi obat nematoda parasit dalam kedokteran hewan dan resistensi obat dalam
Parascaris
pengobatan manusia meningkat di seluruh dunia, dengan sedikit jika ada kelas terapi baru di cakrawala. Beberapa parasit ini
Obat cacing
bersifat zoonosis,misalnya, Ascaris ditularkan dari manusia ke babi dan dan sebaliknya. Pengembangan terapi baru terhadap
Paraprobiotik
keluarga parasit ini akan memiliki implikasi besar bagi kesehatan manusia dan ternak. Di sini kami menguji kemampuan
Bacillus thuringiensis
Protein kristal Cry5B terapeutik paraprobiotik atau probiotik mati yang mengekspresikan express
Bacillus thuringiensis Protein Cry5B dengan sifat anthelmintik yang diketahui, melawan zoonosis Ascaris suum dan
Parascaris sp. Paraprobiotik ini, yang dikenal sebagai IBaCC, memabukkanA. suum larva in vitro dan sangat efektif in vivo
melawan usus A. suum infeksi pada model tikus baru untuk parasit ini. Fermentasi ditingkatkan hingga 350 l untuk mengolah
babi dan kuda. Dosis tunggal Cry5B IBaCC hampir sepenuhnya dibersihkanA. suum infeksi pada babi. Selanjutnya, Cry5B
IBaCC dosis tunggal mendorong jumlah telur feses dalamParascaris-anak kuda yang terinfeksi menjadi nol, menunjukkan
setidaknya paritas dengan, dan potensi keunggulan, kemanjuran obat cacing saat ini yang digunakan untuk melawan parasit
ini. Oleh karena itu, Cry5B IBaCC mewakili pendekatan One Health paraprobiotik baru untuk menargetkan Ascarididae yang
aman, efektif, skalabel secara besar-besaran, stabil, dan berguna dalam kedokteran manusia dan hewan baik di kawasan
maju maupun berkembang di dunia.

1. Perkenalan Parasit gastrointestinal nematoda (GIN) hidup di usus halus, panjangnya

mencapai lebih dari 30 cm. Studi genom nuklir baru-baru ini menunjukkan bahwa
Ascaris lumbricoides atau cacing gelang usus besar adalah parasit nematoda A.lumbricoides dan Ascaris suum, yang ada di mana-mana dan penting Ascaris
manusia yang paling umum, menginfeksi sekitar 1 miliar orang di sebagian besar parasit babi, sangat kawin silang [3]. Memang,
negara tropis dan subtropis [1,2]. Ini A. suum adalah zoonosis yang dapat diekspresikan sebagai haplotipe dari A.lumbricoides,

* Penulis yang sesuai.

* * Penulis koresponden di: Departemen Pertanian AS, Layanan Penelitian Pertanian, Pusat Penelitian Pertanian Beltsville, Penyakit Hewan dan Parasit
Laboratorium, Beltsville, MD, Amerika Serikat.
Alamat email: joe.urban@usda.gov (JF Urban), raffi.aroian@umassmed.edu (RV Aroian).
1 Para penulis ini berkontribusi sama untuk pekerjaan ini.
2 Alamat saat ini: Departemen Biologi, Universitas Negeri Worcester, Worcester, MA.

https://doi.org/10.1016/j.onehlt.2021.100241
Diterima 11 Desember 2020; Diterima dalam bentuk revisi 22 Maret 2021; Diterima 22 Maret 2021
Tersedia online 26 Maret 2021 2352-7714/© 2021 Penulis. Diterbitkan oleh Elsevier BV Ini terbuka
mengakses artikel dibawah itu CC BY-NC-ND lisensi
(http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/).
JF Urban Jr dkk.
dengan masing-masing spesies parasit dapat menginfeksi babi dan manusia [3-8
]. Dalam keluarga yang sama (Ascarididae) dan terkait erat dengan iniAscaris
parasit adalah Parascaris spp., parasit anak kuda dan kuda muda yang ada di
mana-mana di seluruh dunia yang telah mengembangkan resistensi multi-obat,
dengan semakin mengkhawatirkan [9]. Ascaris dan Ascaris-parasit terkait adalah
komponen penting dari “Satu Kesehatan” konsep [3,10,11].
Infestasi pada manusia dengan Ascaris bertanggung jawab atas perkiraan kerugian
1-1,5 juta tahun hidup yang disesuaikan dengan kecacatan (DALYs) dan untuk
60.000-200.000 kematian setiap tahun karena obstruksi saluran pencernaan dan
ascariasis hepatobiliary dan pankreas, dampak sebenarnya yang mungkin telah
diremehkan [1,2,12]. Tingkat infeksi bisa sangat tinggi di beberapa tempat,
misalnya, mencapai >50% prevalensi di enam negara bagian di India yang
mencakup hampir 30% dari total populasi India dan >44% prevalensi dalam meta-
analisis sistematis studi yang dilakukan pada anak-anak Nigeria [13,14]. Gejala
akut akibat parasit dewasa yang menghuni saluran gastrointestinal (GI) termasuk
sakit perut, kembung, mual, muntah, anoreksia, dan diare intermiten (dengan
beban berat yang menyebabkan komplikasi serius dan bahkan kematian).
Namun, dampak yang lebih signifikan adalah pada anak-anak yang lebih rentan
terhadap parasit tersebut. Konsekuensi dari infestasi jangka panjang termasuk
malabsorpsi nutrisi, malnutrisi energi protein, dan asupan makanan berkurang,
yang mengarah ke keterbelakangan pertumbuhan, dampak negatif pada
perkembangan kognitif, absensi sekolah, dan penurunan produktivitas ekonomi [1
,2,8,15].
Meskipun tingkat kesembuhan anthelmintik dosis tunggal terhadap A.lumbricoides
dilaporkan >90% [8], ada banyak laporan dalam literatur tentang defisiensi dalam
mengobati parasit ini dengan benzimidazol (obat cacing pilihan untuk
Administrasi Obat Massal atau MDA). Kesulitan ini termasuk tingkat kesembuhan
yang lebih rendah dari yang diharapkan dengan albendazole di Afrika dan Asia
(0%, 19%, 41%, dan 56% dalam empat studi terpisah; [16-19]) dan kegigihan yang
kuat dari parasit ini di negara-negara Afrika, Asia, dan Amerika Tengah meskipun
kampanye pemberantasan cacing tahunan yang konsisten berlangsung selama
beberapa tahun [20-25]. Alel resistensi benzimidazol yang diketahui telah
terdeteksi pada populasi alamiAscaris, meskipun ada bukti bahwa resistensi/
rekalsitrans dapat terjadi tanpa alel ini [19,21,26]. Meskipun ivermectin juga dapat
digunakan untuk melawan parasit ini, MDA tahunan yang menggabungkan
albendazol dan ivermectin telah gagal untuk menghilangkannya, sehingga hanya
mengurangi prevalensi yang sederhana.27].
Seperti disebutkan di atas, ascarids terkait erat dengan A.lumbricoides juga
merupakan parasit umum dan penting pada ternak dan hewan pendamping.
Ascaris suum adalah masalah produksi dan kesehatan umum pada babi di seluruh dunia
karena pemanfaatan pakan yang buruk dan kecaman hati pada pemotongan di mana
manajemen ketat yang berbeda gagal untuk menghilangkan tingkat infeksi bahkan di
negara produsen global yang besar28]. Baru
A. suum survei prevalensi di Amerika Serikat masih kurang, tetapi strategi
pemberantasan cacing rutin digunakan di >77% fasilitas produksi untuk babi usia
pembiakan dan di >17% dan >14% untuk babi pembibitan dan babi grower/
finisher, masing-masing [29], menunjukkan perlunya formulasi obat cacing yang
praktis dan efektif di pasar. Parascaris sp. adalah parasit terpenting pada anak
kuda dan kuda muda di seluruh dunia [9]. Parasit benar-benar ada di mana-mana
dan hampir setiap anak kuda harus dianggap terpapar. Ascarids kuda
menyebabkan impaksi usus kecil ketika sekelompok cacing menghalangi lumen
usus. Ini adalah kondisi yang menyakitkan dan mengancam jiwa, dan bahkan
dengan operasi perut yang berhasil, prognosis untuk kelangsungan hidup jangka
panjang dijaga agar tetap buruk [9]. Ini menyangkut sebagaiParascaris sp.
ditemukan secara luas resisten terhadap kelas obat anthelmintik yang tersedia
saat ini, terutama kelas obat yang paling banyak digunakan, lakton makrosiklik.30
]. Industri farmasi telah mengembangkan dan memperkenalkan sangat sedikit
kelas obat anthelmintik baru dan tidak satupun untuk penggunaan kuda sejak
awal 1980-an, dan penelitian yang mengeksplorasi modalitas pengobatan
alternatif sangat dibutuhkan. Ada kekhawatiran nyata bahwaAscaris sp. juga
dapat (secara mandiri) mengembangkan resistensi obat yang meluas yang
sekarang diamati dalam hubungan dekatParascaris sp. Secara keseluruhan,
semua temuan ini menunjukkan urgensi dan pentingnya mengembangkan
formulasi anthelmintik baru untuk pengobatanAscaris dan Parascaris parasit
manusia, ternak,
2
One Health 12 (2021) 100241
dan hewan pendamping.
Oleh karena itu, melanjutkan kampanye MDA manusia dan strategi
pengendalian parasit veteriner akan sangat bermanfaat dengan penambahan
anthelmintik baru terhadap parasit ascarid dengan persyaratan berikut: sangat
kuat dan luas terhadap famili cacing ini, dan aman, murah, dan skalabel secara
besar-besaran untuk MDA. Kami baru-baru ini menggambarkan bahan farmasi
aktif (API) yang disebut IBaCC (lihat di bawah) yang mengandung:Bacillus
thuringiensis (Bt) Crystal (Cry) protein Cry5B yang efektif melawan infeksi cacing
tambang manusia pada hewan pengerat dan terhadap Haemonchus contortus
infeksi pada domba dan yang memenuhi semua persyaratan untuk MDA [31,32].
Cry5B sendiri terbukti aktif melawanA. suum pada babi ketika dikirim sebagai lisat
kristal spora hidup (SCL) [33]. Namun, pengiriman SCL atau bakteri hidup secara
umum tidak ideal untuk MDA karena umur simpan yang tidak stabil, masalah
lingkungan, potensi masalah keamanan/peraturan, dan perkembangan resistensi.
melalui
dosis suboptimal [31,34-38]. Di sini, untuk pertama kalinya, kami menjelaskan dan
menguji Cry5B IBaCC melawanAscaris infeksi pada babi dan Cry5B itu sendiri (sebagai
IBaCC) untuk pertama kalinya melawan Parascaris infeksi pada kuda.
2. Bahan-bahan dan metode-metode
2.1. Etika dan persetujuan hewan
Semua protokol dalam penelitian ini disetujui oleh Komite Perawatan dan
Penggunaan Hewan Institusional Universitas Kentucky (Protokol 2015-2078)
untuk studi kuda dan USDA Beltsville - Institutional Animal Care and Use
Committee #18-008, #18-029 dan #17-019 untuk penggunaan tikus dan babi,
masing-masing, dan Komite Keamanan Hayati Kelembagaan
# 271.
2.2. Persiapan Cry5B IBaCC dan studi in vitro
Cry5B IBaCC disiapkan seperti yang dijelaskan [31]. Secara singkat, spo0A-
B. thuringiensis sel yang mengekspresikan Cry5B dari promotor vegetatif dikultur
dalam 3× LB selama 48 jam, disuspensikan kembali dalam 1/2 volume, diolah
dengan minyak esensial, dan kemudian dicuci. Semua Cry5B IBaCC yang
digunakan dalam penelitian ini disiapkan di Synthetic Biomanufacturing Facility,
Utah State University, pada skala 350 l. Konsentrasi Cry5B dihitung relatif
terhadap standar BSA dengan densitometri SDS PAGE.
Ascaris suum parasit larva tahap keempat (L4) diisolasi dari usus kecil tikus B6/
STAT6KO ~ 12 hari pasca-inokulasi (P.
I.) dan dikirim semalaman ke laboratorium Aroian dari laboratorium Urban di
Beltsville, MD. Keesokan harinya, parasit menjadi sasaranin vitro pengujian
dengan Cry5B IBaCC pada dua dosis dan kontrol buffer menggunakan protokol
yang sama untuk pengaturan dan penilaian Ascaris larva in vitro [33,39]. Dalam
setiap percobaan, setiap kondisi berisi dua sumur dengan lima larva per sumur.
Secara sederhana, larva yang bergerak sendiri atau setelah disentuh dengan
jarum diberi skor sebagai hidup dan larva yang gagal bergerak bahkan setelah
disentuh diberi skor sebagai mati [33,39]. Percobaan diulang dua kali dengan dua
kelompok larva yang berbeda dan dua kelompok Cry5B IBaCC yang berbeda.
Eksperimen terpisah dilakukan di mana IBa (sayadiaktifkan bacterium dengan
vektor kosong, identik dan diproses secara identik ke IBaCC dalam segala hal
kecuali bahwa vektor tidak
tidak mengandung sisipan Cry5B) dicocokkan dalam kepadatan optik (OD600) ke
100 μg/mL IBaCC dan diuji terhadap A. suum Parasit L4 dalam dua inde-
percobaan tergantung (n = 20 larva). Inkubasi dengan IBa menghasilkan viabilitas
100% (20/20) dariA. suum L4 hingga dan termasuk inkubasi 96 jam.
2.3. Eksperimen tikus Ascaris in vivo
Pasangan pemuliaan C57BL/6(B6)-STAT6KO awalnya diperoleh dari
Laboratorium Jackson, Bar Harbor, ME dan dibesarkan di Pusat Penelitian
Pertanian USDA/ARS/Beltsville di Beltsville, MD. Kelompok lima tikus yang masing-
masing berisi jantan dan betina diinokulasiper os
dengan 10.000 infeksi A. suum telur dan 12 hari kemudian 1) tidak diobati,
JF Urban Jr dkk.
2) dirawat per os dengan IBaCC yang mengandung Cry5B pada 6 mg/kg berat
badan, atau 3) diobati per os dengan IBaCC yang mengandung Cry5B pada 20 mg/
kg berat badan. Mereka yang berada dalam kelompok 3 menerima dosis kedua
IBaCC yang mengandung Cry5B pada 20 mg/kg berat badan pada hari
berikutnya. SEBUAH.jumlah L4 diisolasi dari usus halus enam hari kemudian
dengan membuka usus halus dengan gunting dan menempatkannya di atas
saringan teh yang direndam dalam 100 ml phosphate-buffered saline (PBS)
dipertahankan selama 3 jam pada suhu 37C dalam penangas air. . L4 yang jatuh
ke dasar gelas kimia yang berisi PBS kemudian ditempatkan dalam cawan kultur
persegi panjang yang diparut dan dihitung menggunakan mikroskop bedah; larva
diidentifikasi secara morfologis sebagai L4 [40]. Tikus-tikus ini juga diinokulasi
dengan infektifHeligmosomoides polygyrus bakeri larva tahap ketiga dan infektif
Trichuris muris telur untuk menguji kemanjuran Cry5B IBaCC terhadap beberapa
infeksi nematoda dalam satu inang tikus. Hasil pengobatan IBaCC pada parasit
lain ini akan disajikan dalam laporan terpisah.
2.4. Babi Ascaris dalam percobaan vivo
Babi percobaan diperoleh dari fasilitas di Pusat Penelitian Pertanian Beltsville,
Beltsville, MD dan ditempatkan serta dikelola seperti yang dijelaskan sebelumnya [
33]. Babi-babi tersebut dicampur jenis kelamin dan berumur sekitar 8 minggu
dengan masing-masing kelompok berisi enam ekor babi pada saatper os
inokulasi dengan 10.000 infektif A. suum telur [33]. Babi diperlakukanper os 12
hari setelah inokulasi telur parasit dengan dosis tunggal IBaCC pada 30 mg/kg
berat badan Cry5B (kelompok perlakuan) atau kendaraan kontrol (kelompok
kontrol) dan di-eutanasia empat hari kemudian untuk pemulihan
A. suum L4 dari usus halus [33]. L4 yang diisolasi dari matriks agargel isi usus
dihitung menggunakan mikroskop untuk menentukan jumlah L4 yang
diidentifikasi secara morfologis [40] per babi.
2.5. Kuda Parascaris spp. percobaan
Sepuluh anak kuda yang lahir di University of Kentucky Research Farm pada
tahun 2019 terdaftar dalam penelitian ini. Anak kuda terkena parasit di padang
rumput yang terkontaminasi untuk terinfeksi secara alami naturallyParascaris sp.
dan tidak menerima pengobatan anthelmintik sebelum penelitian. Dari usia tiga
bulan, anak kuda diperiksa untuk jumlah telur tinja ascarid ditentukan dalam
rangkap tiga dengan metode Mini-FLOTAC seperti yang dijelaskan sebelumnya [41
] . Setelah anak kuda melebihi 100 telur ascarid per gram (EPG), mereka diberi
peringkat berdasarkan jumlah telur dan diblokir menjadi dua pasang. Dari blok-
blok ini, anak kuda secara acak dialokasikan ke kelompok perlakuan atau kontrol.
Anak kuda dalam kelompok perlakuan diberikan dosis tunggal Cry5B IBaCC pada
30 mg/kgmelalui tabung nasogastrik. Anak kuda dalam kelompok kontrol tetap
tidak diobati. Jumlah telur ditentukan pada hari perawatan dan mingguan selama
empat minggu pasca perawatan.
2.6. Metode statistik
Prisma v.8 digunakan untuk semua grafik dan perbandingan. Perbandingan
jumlah telur feses pada penelitian anak kuda dilakukan dengan menggunakan
analisis varians dua arah (analisis efek campuran Time x Treatment). Untuk
in vivo percobaan tikus, analisis varians satu arah (ANOVA) dengan Dunnett's post-
test digunakan relatif terhadap kontrol air. Untuk perbandingan termasuk hanya
dua kelompok dalam studi babi dan akhir studi kuda, uji Mann-Whitney (non-
parametrik) satu sisi digunakan dengan asumsi bahwa pengobatan mengurangi
beban parasit atau jumlah telur tinja. Untuk perbandingan jumlah telur tinja pada
awal penelitian kuda, uji Mann-Whitney dua sisi digunakan untuk menguji
kesetaraan jumlah telur tinja awal.
3
One Health 12 (2021) 100241
3. Hasil
3.1. Cry5B IBaCC memabukkan A. suum usus tahap larva keempat in vitro
Bt Cry5B adalah protein anthelmintik ampuh yang telah dipelajari in vivo
terhadap cacing tambang pada hewan pengerat/anjing dan Ascaris infeksi pada
babi yang dikirim sebagai lisat kristal spora atau sebagai protein yang diisolasi
dari lisat kristal spora, keduanya tidak kompatibel dengan teknologi peningkatan
atau strategi distribusi obat yang efektif secara luas [31,33,42-46]. IBaCC atau
sayadiaktifkan bakandang dengan Cytosolik Crystal adalah bentuk API yang
kompatibel dengan MDA di mana kristal protein Bt Cry diproduksi di sitosol Bt
asporagen, yang kemudian dibunuh atau dinonaktifkan dengan inkubasi dalam
minyak esensial food grade [31]. IBaCC efektif melawan infeksi cacing tambang
pada hewan pengerat danHaemonchus infeksi pada ruminansia (Li et al. 2020;
Sanders et al. 2020). Probiotik mati dengan manfaat terapeutik dikenal sebagai
paraprobiotik.37].
Bagaimana IBaCC akan berinteraksi dengan ascarids, yang memiliki bagian
mulut yang berbeda, pola makan, sumber makanan, dan perilaku dari cacing
tambang, tidak diketahui. IBaCC yang mengandung Cry5B (atau Cry5B IBaCC)
awalnya diuji terhadap ususA. suum larva tahap keempat (L4s) menggunakan
protokol baru untuk isolasi dari tikus yang kekurangan kekebalan dan diinkubasi
in vitro dengan IBaCC yang mengandung dua dosis Cry5B yang berbeda. Perubahan
yang terlihat pada L4 yang diobati dengan Cry5B IBaCC relatif terhadap kontrol buffer
terlihat (misalnya, warna yang lebih pucat, penampilan usus yang merosot, bentuk yang
kaku, dan gerakan yang berkurang), menunjukkan keracunan yang jelas dari A. suum
oleh Cry5B IBaCC (Gambar 1SEBUAH). Keracunan secara kuantitatif terbukti pada 10
μg/mL dan lebih kuat pada 100 μg/mL konten Cry5B, dengan kematian/
imobilisasi hampir sempurna terlihat pada 100 μg/mL (~700 nmolar) pada 48 jam (
Gambar 1B). Seperti yang telah ditunjukkan dengan semua nematoda parasit lain
yang diuji [31,47], keracunan A. suum oleh Cry5B IBaCC bergantung pada protein
Cry5B karena inkubasi parasit dengan adanya kontrol IBa yang tidak memiliki
Cry5B tetapi sebaliknya identik dengan IBaCC tidak menghasilkan keracunan
(dirinci dalam Bahan dan Metode). Iniin vitro data menunjukkan bahwa Cry5B
IBaCC, tetapi bukan bakteri yang tidak aktif
B. thuringiensis dengan vektor kosong (IBa), berpotensi berdampak A. suum
infeksi dalam hidup.
3.2. Cry5B IBaCC memiliki dampak signifikan pada infeksi usus A. suum pada
tikus dan babi pig
Sebelum menguji pada hewan besar, kami menguji Cry5B IBaCC terhadap
usus A. suum infeksi pada tikus. Kami telah menemukan bahwa tikus C57BL/
6(B6)- STAT6KO mendukung pengembanganA. suum ke tahap usus L4, di mana
mereka dikeluarkan (~ hari ke-20 pasca-inokulasi atau
PI). Tikus B6/STAT6KO diinokulasiper os dengan A. suum telur. Dua belas hari PI,
tikus (n = 5 per kelompok) diperlakukan dengan air (kontrol), IBaCC pada 6 mg
Cry5B/kg berat badan, atau IBaCC pada 20 mg Cry5B/kg berat badan. Tikus-tikus
yang menerima 20 mg/kg menerima dosis 20 mg/kg berat badan kedua hari ke
13 PI Dosis ganda 20 mg/kg ini meniru apa yang dilakukan dalam studi babi yang
dipublikasikan menggunakan Cry5B SCL [33]. Lima hari kemudian beban cacing
usus kecil ditentukan. Pengobatan dengan dua dosis 20 mg/kg menghasilkan
peningkatan yang signifikan secara statistik
92,5% pengurangan beban cacing usus relatif terhadap kontrol (Gambar 2.), mirip
dengan apa yang terlihat pada babi yang menggunakan SCL dan rejimen dosis
yang sama [33]. Pengobatan menggunakan 6 mg/kg berat badan tunggal Cry5B
di IBaCC juga menghasilkan pengurangan 62% yang signifikan dalam usus.A.
suum beban L4 (Gambar 2.). Hasil ini pada tikus dengan latar belakang defisiensi
TH2-imun semakin memperkuat temuan sebelumnya bahwa kemanjuran Cry5B
disebabkan oleh dampak langsung pada parasit dan tidak bergantung pada
respons imun yang utuh [44].
Berdasarkan in vitro data dan in vivo kemanjuran dalam model tikus, produksi
Cry5B IBaCC ditingkatkan hingga 350 l di organisasi manufaktur kontrak (CMO)
untuk studi pada hewan besar [31]. Dua belas babi diinokulasiper os dengan A.
suum telur. Berdasarkan keberhasilan dengan dosis tunggal pada tikus,
percobaan pengobatan dosis tunggal dilakukan. Dua belas hari PI,
JF Urban Jr dkk.
Gambar 2. Cry5B IBaCC berkhasiat melawan A. suum Tahap usus L4 pada tikus.
Ditampilkan adalah beban parasit dari tikus B6/STAT6KO yang diinokulasi dengan infektif
A. suum telur dan diolah dengan air, Cry5B IBaCC dosis tunggal (6 mg/kg berat badan),
atau Cry5B IBaCC dosis ganda (2 × 20 mg/kg berat badan). Perbandingan statistik
kelompok perlakuan relatif terhadap kontrol air ditampilkan. Bilah panjang untuk setiap
perlakuan berarti; bar pendek menunjukkan kesalahan standar.
enam babi dibiarkan tidak dirawat dan enam babi diberikan per os dosis tunggal IBaCC
dengan dosis 30 mg Cry5B/kg berat badan. Empat hari kemudian, jumlah cacing usus
ditentukan untuk semua babi. Seperti yang ditunjukkan (Gambar 3), dosis tunggal Cry5B
IBaCC menghasilkan pengurangan yang signifikan secara statistik dan pembersihan
complete yang hampir sempurna A. suum L4 dari usus babi (reduksi 96% relatif terhadap
kontrol).
Gambar 3. Cry5B IBaCC sangat efektif melawan A. suum Infeksi tahap usus L4 pada
babi. Ditampilkan adalah rata-rata beban parasit pada babi yang diberi air atau dosis
tunggal Cry5B IBaCC pada 30 mg/kg berat badan. Baris kesalahan menunjukkan
kesalahan standar.
4
One Health 12 (2021) 100241
Gambar 1. Cry5B IBaCC memabukkan A. jumlah in vitro. A)
Gambar dari A. suum larva tahap keempat (L4) di hadapan
100 μg/mL Cry5B pada IBaCC atau tidak adanya Cry5B IBaCC.
Larva mabuk diluruskan dan tidak bergerak. Larva yang
sehat memiliki banyak tikungan dan bergerak. Gambar
diambil pada 48 jam. B) Persen dari
A. suum larva hidup dari waktu ke waktu in vitro pada dua dosis
Cry5B di IBaCC relatif terhadap kontrol (hanya penyangga).
Ditampilkan adalah kesalahan rata-rata dan standar dari dua
percobaan independen dengan dua sumur per percobaan (5 larva
per sumur).
3.3. Cry5B IBaCC membersihkan jumlah telur tinja pada kuda yang
terinfeksi parasit Parascaris spp terkait
Parascaris infeksi merusak kuda (anak kuda) dan secara filogenetik terkait
dengan A. suum dan A.lumbricoides [48,49]. Saat IBaCC yang ditingkatkan secara
efektif dibersihkanA. suum infeksi pada babi pada dosis tunggal 30 mg Cry5B/kg
berat badan, kami juga menguji dosis tunggal IBaCC pada 30 mg Cry5B/kg berat
badan terhadap orang dewasa Parascaris sp. infeksi pada anak kuda yang
terinfeksi secara alami.
Sepuluh anak kuda dipilih melalui pendaftaran bergulir terkendali (n = 4) dan
Lengan pengobatan Cry5B IBaCC (n = 6). Setiap anak kuda dalam kelompok
pengobatan diberikanmelalui selang naso-gastrik dosis tunggal 30 mg/kg Cry5B
dalam IBaCC yang diproduksi pada skala 350 l oleh CMO. Jumlah telur tinja
ditentukan pada hari pengobatan dan kemudian sekali seminggu selama 4
minggu. Hasilnya ditampilkan dalamGambar 4. Jumlah telur tinja pada anak kuda
dari kelompok kontrol dan perlakuan secara statistik serupa pada awal penelitian,
dengan jumlah telur ascarid rata-rata masing-masing 916 dan 673 telur per gram
tinja. Jumlah telur tinja bertahan pada semua anak kuda dalam kelompok kontrol
sampai dan termasuk hari ke-14 dan pada tiga dari empat anak kuda selama
seluruh durasi penelitian. Sebaliknya, jumlah telur tinja menjadi nol pada semua
anak kuda yang diobati dengan Cry5B IBaCC pada sampel pertama yang diambil
satu minggu setelah perawatan dan tetap nol untuk semua anak kuda yang
dirawat selama penelitian. Analisis varians dua arah menunjukkan perbedaan
yang signifikan secara statistik antara kelompok kontrol dan kelompok perlakuan.
Perbedaan yang signifikan dalam jumlah telur tinja pada setiap titik waktu pasca
perawatan juga terlihat (ditunjukkan untuk titik waktu akhir;Gambar 4). Data ini
menunjukkan bahwa Cry5B IBaCC memiliki dampak dramatis padaParascaris
infeksi pada anak kuda.
4. Diskusi
Parasit ascarid adalah beberapa yang paling umum dan merusak
Gambar 4. Cry5B IBaCC sangat efektif melawan Parascaris sp. Infeksi pada anak kuda.
Ditampilkan adalah rata-rata jumlah telur tinja dari waktu ke waktu; bilah kesalahan
menunjukkan kesalahan standar. Hitung telur feses hari ke-0 diambil sebelum perlakuan
pertama. Perbedaan antara jumlah telur feses antara kontrol dan anak kuda yang diobati
dengan IBaCC pada 30 mg/kg berat badan Cry5B berdasarkan analisis varians dua arah adalah
signifikan (P = 0,0074). P nilai yang ditunjukkan menunjukkan perbandingan antara jumlah telur
tinja pada kelompok perlakuan dan kontrol sebelum perlakuan (hari ke 0; P =
0,91) dan pada titik data terakhir yang diambil (hari ke-28; P = 0,033).
JF Urban Jr dkk.
parasit manusia dan hewan di bumi. Dalam kedokteran hewan, keengganan dari
Parascaris pengobatan dan perkembangan resistensi didokumentasikan dengan
baik. MeskipunAscaris infeksi pada manusia dianggap dikelola dengan baik
dengan terapi saat ini, tampilan rinci pada data kemanjuran dan kecenderungan
ternak untuk mengembangkan resistensi anthelmintik dari perawatan obat
intensif adalah firasat untuk strategi MDA pada manusia (lihat Pendahuluan).
Oleh karena itu, terapi baru terhadap kelas parasit ini sangat dibutuhkan dan
akan memainkan peran penting dalam mempromosikan One Health. Namun,
agar dapat digunakan secara terapeutik dalam pengobatan manusia dan hewan
di negara maju dan berkembang, terapi semacam itu harus aman, aktif secara
luas terhadap kelas parasit ini, murah, dan skalabel secara besar-besaran. Kami
tidak mengetahui adanya obat baru yang memenuhi kriteria ini yang ada di jalur
komersial.
Di sini kami menunjukkan bahwa Cry5B IBaCC, paraprobiotik rekombinan
(hantu bakteri mati) yang mengandung kristal protein Bt Cry aktif, sangat
menjanjikan untuk memenuhi kekosongan ini. Cry5B IBaCC dosis tunggal efektif
melawan dua spesies ascaridin vivo pada tiga inang mamalia yang berbeda. Pada
tikus dan babi, Cry5B IBaCC efektif dalam menghilangkan completeA. suum
beban parasit di usus kecil. Pada kuda, Cry5B IBaCC benar-benar menghilangkan
jumlah telur feses parasit. Studi masa depan yang penting pada kuda akan
mencakup penentuan beban parasit usus dalam kontrolmelawan Anak kuda yang
dirawat dengan Cry5B IBaCC. KarenaA. suum
dan A.lumbricoides adalah parasit yang sangat erat hubungannya dan karena saluran
pencernaan babi dianggap sebagai model yang baik untuk saluran pencernaan manusia,
data menunjukkan bahwa Cry5B IBaCC akan sangat efektif melawan A.lumbricoides
infeksi pada manusia. Studi masa depan yang penting juga akan mencakup
pengujian hipotesis ini.
Produksi Cry5B IBaCC ditingkatkan untuk penelitian hewan besar ini menjadi
skala 350 l pada CMO. Protein kristal sebagai bagian dari lisat kristal spora hidup
diproduksi secara massal dan murah di seluruh dunia untuk mengendalikan
hama serangga, membuka jalan bagi tingkat produksi Cry5B IBaCC yang
sebanding. Namun, aplikasi terapeutik lisat kristal spora hidup atau bakteri hidup
secara umum tidak diinginkan untuk manusia dan hewan lain karena potensi
masalah keamanan, kontaminasi lingkungan, replikasi di tanah dan usus yang
mengarah pada peningkatan risiko resistensi parasit, ketidakstabilan. bakteri
hidup di rak, dan hubungan antaraB. thuringiensis dan Bacillus cereus [31]. Cry5B
IBaCC mengurangi semua kelemahan ini sambil mempertahankan semua
keuntungan skalabilitas dan keamanan protein Cry itu sendiri. Proses produksi
Cry5B IBaCC sendiri sederhana dan dapat dialihkan [31]. Selain itu, studi
toksikologi percontohan pada hamster menunjukkan bahwa lima dosis harian
berturut-turut IBaCC pada 200 mg Cry5B/kg berat badan benar-benar aman dan
tidak beracun berdasarkan tidak ada penyimpangan dari histopatologi normal
dan kimia darah [31]. Studi toksikologi praktik laboratorium yang baik (GLP)
dengan kelompok studi berukuran lebih besar dan bahan kelas klinis
direncanakan dalam waktu dekat.
Khususnya, perkembangan resistensi anthelmintik terhadap Cry5B ditemukan
relatif lebih sulit daripada benzimidazol dan agonis reseptor asetilkolin nikotinat
(nAChR) berdasarkan skrining genetik maju di Caenorhabditis. elegan [50].
Selanjutnya, nematoda yang resisten terhadap anthelmintik agonis nAChR sangat
rentan terhadap Cry5B, dan agonis Cry5B dan nAChR (misalnya, pirantel dan
sukundimidin) secara sinergis lebih manjur in vitro dan in vivo terhadap
nematoda yang hidup bebas dan parasit.43,50]. Sifat-sifat ini (hipersusseptibilitas
dan sinergi) merupakan prediksi dari terapi obat kombinasi yang bandel terhadap
perkembangan resistensi.
5. Kesimpulan
Data kami menunjukkan bahwa Cry5B IBaCC dapat memberikan kontribusi yang
signifikan terhadap pengendalian parasit ascarid jangka panjang, aman, dan efektif pada
manusia dan hewan lainnya. Skalabilitas, kemampuan beradaptasi, keamanan, dan
kemudahan pembuatan Cry5B IBaCC membuatnya cocok untuk mempromosikan One
Health melawan parasit ascarid secara merata pada manusia dan ternak di negara maju
dan berkembang. Penelitian dilaporkan di sini lebih lanjut
5
One Health 12 (2021) 100241
umumnya menunjuk ke arah kesesuaian dan potensi besar paraprobiotik untuk
mengobati patogen manusia dan ternak, yang juga mungkin termasuk ascarids
dari hewan pendamping seperti anjing dan kucing. Pengembangan sistem
pengiriman umum formulasi paraprobiotik untuk pengobatan manusia dan
hewan mempromosikan konsep One Health.
Sumber pendanaan
Proyek ini didukung oleh (1) Institut Kesehatan Nasional/ Institut Nasional
Alergi dan Penyakit Menular hibah R01AI056189 dan R01AI50866 kepada RVA, (2)
Hibah Kompetitif Inisiatif Penelitian Pertanian dan Pangan no. 2015-11323 dari
Institut Pangan dan Pertanian Nasional USDA ke RVA, dan (3) proyek CRIS #8042-
31000-107-00D: “Pendekatan Molekuler untuk Mengontrol Parasit Usus yang
Mempengaruhi Mikrobioma pada Babi dan Ruminansia Kecil” ke JFU
Pernyataan kontribusi kepengarangan CReditT
Joseph F. Urban: Konseptualisasi, Metodologi, Investigasi, Penulisan - review &
editing, Supervisi, Akuisisi pendanaan. Martin K. Nielsen: Konseptualisasi,
Metodologi, Investigasi, Penulisan - tinjauan & penyuntingan, Pengawasan. David
Gazzola: Investigasi. Yue Xie: Investigasi. Ethiopia Beshah: Investigasi. Yan Hu:
Investigasi. Hanchen Li: Investigasi. Florentina Rus: Investigasi. Kelly Flanagan:
Investigasi. Austin Draper: Sumberdaya. Sridhar Vakalapudi: Sumber. Robert W.
Li: Sumber Daya, Penulisan - tinjauan & penyuntingan. Gary R. Ostroff: Sumber
Daya, Penulisan - tinjauan & penyuntingan, Pengawasan. Raffi V. Aroian:
Konseptualisasi, Analisis Formal, Penulisan - draf asli, Visualisasi, Pengawasan,
Administrasi proyek, Perolehan dana.
Pernyataan Kepentingan Bersaing
Para penulis menyatakan bahwa mereka tidak mengetahui adanya persaingan kepentingan
keuangan atau hubungan pribadi yang tampaknya dapat mempengaruhi pekerjaan yang
dilaporkan dalam makalah ini.
Referensi
[1] DF de Lima Corvino, S. Horrall, Ascariasis. https://europepmc.org/book s/n/
statpearls/article-17878/, 2019.
[2] PM Jourdan, PHL Lamberton, A. Fenwick, DG Addiss, Infeksi cacing yang ditularkan
melalui tanah, Lancet. 391 (2018) 252-265.
[3] A. Easton, S. Gao, SP Lawton, S. Bennuru, A. Khan, E. Dahlstrom, RG Oliveira,
S. Kepha, SF Porcella, J. Webster, R. Anderson, ME Grigg, RE Davis, J. Wang, T.
B. Nutman, Bukti molekuler hibridisasi antara babi dan manusia Ascaris menunjukkan
kompleks spesies kawin silang yang menginfeksi manusia, Elife. 9 (2020),https://doi.org/
10.7554/eLife.61562.
[4] D. Leles, SL Gardner, K. Reinhard, A. Iniguez, A. Araujo, Apakah Ascaris lumbricoides dan
Ascaris suum merupakan spesies tunggal? Parãsit. Vektor 5 (2012) 42.
[5] PHL Lamberton, PM Jourdan, Ascariasis Manusia: pembaruan diagnostik, Curr. Trop. Med.
Rep.2 (2015) 189-200.
[6] J. Vlaminck, B. Levecke, J. Vercruysse, P. Geldhof, Kemajuan dalam diagnosis infeksi Ascaris
suum pada babi dan kemungkinan aplikasinya pada manusia, Parasitologi. 141 (2014)
1904-1911.
[7] CA Gordon, J. Kurscheid, MK Jones, DJ Gray, DP McManus, Soil-transmitted helminths di
Australia tropis dan Asia, Trop. Med. Menulari. Dis. 2 (2017) 56.
[8] KJ Else, J. Keiser, CV Holland, RK Grencis, DB Sattelle, RT Fujiwara, L.
L. Bueno, SO Asaolu, OA Sowemimo, PJ Cooper, Cacing cambuk dan infeksi cacing
gelang, Nat. Pdt. Dis. Primer. 6 (2020) 44.
[9] MK Nielsen, Pertimbangan berbasis bukti untuk pengendalian Parascaris spp.
infeksi pada kuda, Equine Vet. Pendidikan 28 (2016) 224-231.
[10] E. Pozio, Bagaimana globalisasi dan perubahan iklim dapat mempengaruhi parasit bawaan
makanan, Exp. parasit. 208 (2020) 107807.
[11] JP Webster, CM Gower, SCL Knowles, DH Molyneux, A. Fenton, One health - kerangka
ekologi dan evolusioner untuk mengatasi penyakit zoonosis yang terabaikan, Evol.
aplikasi 9 (2016) 313-333, https://doi.org/10.1111/eva.12341.
[12] MS Khuroo, AA Sebaliknya, NS Khuroo, MS Khuroo, Hepatobiliary dan ascariasis pankreas,
Dunia J. Gastroenterol. 22 (2016) 7507-7517.
[13] SN Karshima, Prevalensi dan distribusi infeksi cacing yang ditularkan melalui tanah pada
anak-anak Nigeria: tinjauan sistematis dan meta-analisis, Infect. Dis. Kemiskinan.
(2018), https://doi.org/10.1186/s40249-018-0451-2.
JF Urban Jr dkk.
[14] N. Salam, S. Azam, Prevalensi dan distribusi infeksi cacing yang ditularkan melalui tanah di
India, BMC Public Health 17 (2017) 201, https://doi.org/10.1186/ s12889-017-4113-2.
[15] J. Bethony, S. Brooker, M. Albonico, SM Geiger, A. Loukas, D. Diemert, PJ Hotez, Infeksi
cacing yang ditularkan melalui tanah: ascariasis, trichuriasis, dan cacing tambang, Lancet.
367 (2006) 1521-1532.
[16] SH Subba, TS Singh, Studi tentang prevalensi infeksi parasit usus dan penilaian kemanjuran
albendazole pada cacing yang ditularkan melalui tanah pada anak-anak sekolah di East
Sikkim, Trop. parasit. 10 (2020) 18-23.
[17] EG Edelduok, FN Eke, NE Evelyn, CI Atama, JE Eyo, Khasiat kemoterapi albendazol dosis
tunggal pada cacing usus manusia di antara anak-anak sekolah di komunitas tropis
pedesaan terpilih, Ann. Trop. Med. Kesehatan masyarakat. 6
(2013) 413.
[18] JR Stothard, D. Rollinson, E. Imison, IS Khamis, Sebuah spot-check khasiat albendazole atau
levamisole, terhadap cacing yang ditularkan melalui tanah pada anak-anak Ungujan muda,
mengungkapkan frekuensi penyembuhan yang rendah, Ann. Trop. Med. parasit. 103
(2009) 357-360.
[19] J. Krücken, K. Fraundorfer, JC Mugisha, S. Ramünke, KC Sifft, D. Geus,
F. Habarugira, J. Ndoli, A. Sendegeya, C. Mukampunga, C. Bayingana,
T. Aebischer, J. Demeler, JB Gahutu, FP Mockenhaupt, G. von Samson- Himmelstjerna,
Mengurangi kemanjuran albendazole terhadap Ascaris lumbricoides pada anak sekolah
Rwanda, Int. J. Parasit. Obat Tahan Obat. 7 (2017) 262-271.
[20] JR Stothard, MD Prancis, IS Khamis, M.-G. Bas'áñez, D. Rollinson, Epidemiologi dan
pengendalian schistosomiasis kemih dan cacing yang ditularkan melalui tanah pada
anak sekolah di Pulau Unguja, Zanzibar, Trans. R. Soc. Trop. Med. hyg. 103 (2009) 1031-
1044.
[21] G. Matamoros, MM Rueda, C. Rodríguez, JA Gabrie, M. Canales, G. Fontecha,
A. Sanchez, Endemisitas tinggi cacing yang ditularkan melalui tanah pada populasi yang
sering terpapar albendazol tetapi tidak ada bukti resistensi antiparasit, Trop. Med.
Menulari. Dis. 4 (2019) 73.
[22] M. Assoum, G. Ortu, M.-G. Basanez, C. Lau, ACA Clements, K. Halton,
A. Fenwick, RJS Magalhães, S'Distribusi atiotemporal dan populasi yang berisiko infeksi
cacing yang ditularkan melalui tanah setelah program pemberantasan cacing di sekolah
selama delapan tahun di Burundi, 2007-2014, Parasit. Vektor 10 (2017) 583.
[23] G. Ortu, M. Assoum, U. Wittmann, S. Knowles, M. Clements, O. Ndayishimiye, M.-
G. Bas'áñez, C. Lau, A. Clements, A. Fenwick, RJS Magalhaes, Dampak dari program
pemberian obat massal 8 tahun pada prevalensi, intensitas dan koinfeksi cacing yang
ditularkan melalui tanah di Burundi, Parasit. Vektor 9 (2016) 513.
[24] E. Ruberanziza, K. Owada, NJ Clark, I. Umulisa, G. Ortu, W. Lancaster,
T. Munyaneza, A. Mbituyumuremyi, U. Bayisenge, A. Fenwick, RJ Soares Magalhães, Memetakan
infeksi parasit cacing yang ditularkan melalui tanah di rwanda: memperkirakan endemisitas dan
mengidentifikasi populasi berisiko, Trop. Med. Menulari. Dis. 4
(2019), https://doi.org/10.3390/tropicalmed4020093.
[25] NK Gunawardena, NDDM Amarasekera, A. Pathmeswaran, NR de Silva, Pengaruh
kemoterapi massal berulang untuk pengendalian filariasis pada infeksi cacing yang
ditularkan melalui tanah di Sri Lanka, Ceylon Med. J.53 (2008) 13-16.
[26] LFV Furtado, C. da Medeiros, LW Zuccherato, WP Alves, VNGM de Oliveira,
VJ da Silva, GS Miranda, RT Fujiwara, .ML Rabelo, Identifikasi pertama dari SNP F200Y
terkait resistensi benzimidazole dalam gen beta-tubulin di Ascaris lumbricoides, PLoS One
14 (2019), e0224108.
[27] YM Bah, MS Bah, J. Paye, A. Conteh, S. Saffa, A. Tia, M. Sonnie, A. Veinoglou, J.
J. Amon, MH Hodges, Y. Zhang, Infeksi cacing yang ditularkan melalui tanah pada anak-
anak usia sekolah di Sierra Leone setelah satu dekade intervensi kemoterapi preventif,
Infect. Dis. Kemiskinan. 8 (2019),https://doi.org/10.1186/s40249-019-0553-5.
[28] Y. Zheng, Y. Xie, P. Geldhof, J. Vlaminck, G. Ma, RB Gasser, T. Wang, seroprevalensi anti-
Ascaris yang tinggi pada babi penggemukan di Sichuan, Cina, menyerukan peningkatan
strategi manajemen, Parasit. Vektor 13 (2020) 60.
[29] Usda, Swine 2012: Bagian I: referensi dasar kesehatan dan manajemen babi di Amerika
Serikat 2012, 2015.
[30] AS Peregrine, MB Molento, RM Kaplan, MK Nielsen, Resistensi anthelmintik pada parasit
penting kuda: apakah itu penting? Dokter hewan. parasit. 201 (2014) 1-8.
[31] H. Li, A. Abraham, D. Gazzola, Y. Hu, G. Beamer, K. Flanagan, E. Soto, F. Rus,
Z. Mirza, A. Draper, S. Vakalapudi, C. Stockman, P. Bain, JF Urban Jr., G.
R. Ostroff, RV Aroian, Paraprobiotik rekombinan sebagai paradigma baru untuk
mengobati parasit nematoda gastrointestinal manusia, Antimicrob. Agen Kemo. 65
(2021), https://doi.org/10.1128/AAC.01469-20.
One Health 12 (2021) 100241
[32] J. Sanders, Y. Xie, D. Gazzola, H. Li, A. Abraham, K. Flanagan, F. Rus, M. Miller,
Y. Hu, S. Guynn, A. Draper, S. Vakalapudi, KH Petersson, D. Zarlenga, RW Li, J.
F. Urban, GR Ostroff, A. Zajac, RV Aroian, Sebuah pengobatan berbasis paraprobiotik baru
untuk pengendalian Haemonchus contortus pada domba, Int. J. Parasit. Obat Tahan Obat.
14 (2020) 230-236.
[33] JF Urban Jr., Y. Hu, MM Miller, U. Scheib, YY Yiu, RV Aroian, Cry5B yang diturunkan dari
Bacillus thuringiensis memiliki aktivitas anthelmintik yang kuat terhadap Ascaris suum,
PLoS Negl. Trop. Dis. 7 (2013), e2263.
[34] CA Adams, Paradoks probiotik: sel hidup dan mati adalah pengubah respons biologis,
Nutr. Res. Wahyu 23 (2010) 37-46.
[35] CN de Almada, CN Almada, RCR Martinez, AS Sant'Ana, Paraprobiotik: bukti kemampuannya
untuk memodifikasi respons biologis, metode inaktivasi, dan perspektif tentang
penerapannya dalam makanan, Trends Food Sci. teknologi. 58 (2016) 96-114.
[36] JT Guimar~es, CF Balthazar, H. Scudino, TC Pimentel, EA Esmerino,
M. Ashokkumar, MQ Freitas, AG Cruz, Ultrasonografi intensitas tinggi: teknologi
baru untuk pengembangan produk susu probiotik dan prebiotik, Ultrason.
Sonochem. 57 (2019) 12-21.
[37] V. Taverniti, S. Guglielmetti, Sifat imunomodulator mikroorganisme probiotik di luar
viabilitasnya (probiotik hantu: usulan konsep paraprobiotik), Gen Nutr. 6 (2011) 261-274.
[38] BH Nataraj, SA Ali, PV Behare, H. Yadav, Postbiotik-parabiotik: cakrawala baru dalam
bioterapi mikroba dan makanan fungsional, Microb. Pabrik Sel 19
(2020) 168.
[39] Y. Hu, BL Ellis, YY Yiu, MM Miller, JF Urban, LZ Shi, RV Aroian, Perbandingan luas efek kelas
anthelmintik pada beragam nematoda, PLoS One 8 (2013), e70702.
[40] FW Douvres, FG Tromba, GM Malakatis, Morfogenesis dan migrasi larva Ascaris suum
berkembang ke tahap keempat pada babi, J. Parasitol. 55 (1969) 689-712.
[41] ML Noel, JA Scare, JL Bellaw, MK Nielsen, Akurasi dan presisi teknik mini-FLOTAC dan
McMaster untuk menentukan jumlah telur kuda yang kuat,
J. Dokter Hewan Equine. Sci. 48 (2017), 182-187.e1.
[42] Y. Hu, MM Miller, AI Derman, BL Ellis, RG Monnerat, J. Pogliano, R.
V. Aroian, strain Bacillus subtilis yang direkayasa untuk pengobatan penyakit cacing yang
ditularkan melalui tanah, Appl. Mengepung. Mikrobiol. 79 (2013) 5527-5532.
[43] Y. Hu, M. Miller, B. Zhang, T.-T. Nguyen, MK Nielsen, RV Aroian, Studi in vivo dan in vitro dari
Cry5B dan anthelmintik agonis reseptor asetilkolin nikotinik mengungkapkan terapi
kombinasi yang kuat dan unik terhadap parasit nematoda usus, PLoS Negl. Trop. Dis. 12
(2018), e0006506.
[44] Y.Hu, T.-T. Nguyen, ACY Lee, JF Urban Jr., MM Miller, B. Zhan, DJ Koch, J.
B. Siang, A. Abraham, RT Fujiwara, DD Bowman, GR Ostroff, RV Aroian, Bacillus
thuringiensis Protein Cry5B sebagai obat cacing tambang baru, Int. J. Parasit. Obat Tahan
Obat. 8 (2018) 287-294.
[45] Y. Hu, B. Zhan, B. Keegan, YY Yiu, MM Miller, K. Jones, RV Aroian, Studi terapeutik in vivo
mekanistik dan dosis tunggal dari tindakan obat cacing Cry5B terhadap cacing
tambang, PLoS Negl. Trop. Dis. 6 (2012), e1900.
[46] M. Cappello, RD Bungiro, LM Harrison, LJ Bischof, JS Griffitts, BD Barrows,
RV Aroian, Protein kristal Bacillus thuringiensis yang dimurnikan dengan aktivitas
terapeutik terhadap parasit cacing tambang Ancylostoma ceylanicum, Proc. Natal akad.
Sci. AS 103 (2006) 15154-15159.
[47] J. Sanders, Y. Xie, D. Gazzola, H. Li, A. Abraham, K. Flanagan, F. Rus, M. Miller,
Y. Hu, S. Guynn, A. Draper, S. Vakalapudi, KH Petersson, D. Zarlenga, RW Li, J.
F. Urban, GR Ostroff, A. Zajac, RV Aroian, Sebuah pengobatan berbasis paraprobiotik baru
untuk pengendalian Haemonchus contortus pada domba, Int. J. Parasit. Obat Tahan Obat.
14 (2020) 230-236, https://doi.org/10.1016/j.ijpddr.2020.11.004.
[48] JF Gao, XX Zhang, XX Wang, Q. Li, Y. Li, WW Xu, Y. Gao, CR Wang, Menurut bukti DNA
mitokondria, Parascaris equorum dan Parascaris univalens mungkin mewakili spesies
yang sama, J. Helminthol. 93 (2019) 383-388.
[49] A. Jabbar, DTJ Littlewood, N. Mohandas, AG Briscoe, PG Foster, F. Müller,
G. von Samson-Himmelstjerna, AR Jex, RB Gasser, Genom mitokondria univalen
Parascaris - implikasi untuk a “terlupakan” parasit, parasit. Vektor 7
(2014) 428.
[50] Y. Hu, EG Platzer, A. Bellier, RV Aroian, Penemuan kombinasi anthelmintik yang sangat
sinergis yang menunjukkan hipersensitivitas timbal balik, Proc. Natal akad. Sci. Amerika
Serikat 107 (2010) 5955-5960.