BAB III

TINJAUAN UMUM

3.1. Waktu dan Tempat Penelitian

3.1.1. Waktu Penelitian

Penelitian ini berlangsung dalam waktu 3 bulan dari bulan Maret-Juni 2019.

3.1.2. Tempat Penelitian

Penelitian dilakukan di Laboratoriun Formulasi Teknologi Sediaan Farmasi dan

Laboratorium Biologi Politeknik Indonusa Surakarta.

3.2. Jenis Penelitian

Jenis penelitian tentang uji daya hambat antibakteri fraksi aktif daun kemangi

(Ocinum santum L.) terhadap Staphylococcus epidermidis dengan metode difusi

padat disc diffusion (kertas cakram) adalah deskriptif eksperimen. Penelitian

deskriptif eksperimen merupakan penelitian yang menggambarkan jalannya suatu

penelitian eksperimen dan hasil penelitian yang diperoleh dengan literatur yang

dijadikan acuan.

3.3. Variabel Penelitian

3.3.1 Variabel Bebas

Variabel bebas merupakan variabel yang mempengaruhi atau yang menjadi sebab

perubahannya atau timbulnya variabel dependen (terikat). Dalam penelitian ini

variabel bebas adalah konsentrasi frkasi etil asetat daun kemangi (Ocinum santum

L.).

3.3.2 Variabel Terikat

Variabel terikat merupakan variabel yang dipengaruhi atau yang menjadi akibat,

karena adanya variabel bebas. Dalam penelitian ini variabel terikat adalah daya

hambat antibakteri fraksi etil asetat daun kemangi (Ocinum santum L.).

3.4. Alat dan Bahan

3.4.1 Alat

Alat yang digunakan untuk proses penyarian dan uji daya hambat antibakteri

adalah autoklaf, baskom, batang pengaduk, gelas kimia, bunsen, botol kaca,

cawan petri, cawan porselen, corong kaca, enkas, erlenmeyer, gelas ukur,

inkubator, jarum ose, jangka sorong, kaca arloji, loyan, masker, mikropipet, oven,

penangas air, pipet tetes, pisau, rak, tabung reaksi, sarung tangan, timbangan

analitik.

3.4.2 Bahan

Bahan yang digunakan dalam penelitian ini antara lain akuades, aseton, bakteri

Staphylococcus epidermidis, etil asetat, daun kemangi, etanol 70%, HCl pekat,

kloroform, kontrol positif (kloramfenikol), kontrol negatif (DMSO 10%),

lempeng silika GF 254, logam Mg, media NA (Nutrient Agar), media NB

(Nutrient Broth), metanol, NaCl 10%, toluen.

3.5. Prosedur Penelitian

3.5.1 Determinasi Tanaman

Pada proses awal pada penelitian ini adalah dilakukan identifikasi dan

determinasi. Determinasi tanaman daun kemangi dilakukan di Universitas

Muhammadiyah Surakarta. Bagian yang dideterminasi adalah akar, batang, dan

daun.

3.5.2 Preparasi Sampel

Sampel yang digunakan adalah daun kemangi dari Desa Mangu Kabupaten

Boyolali. Daun kemangi kemudian dilakukan sortasi basah yang meliputi

pemisahan kotoran dan memilih sampel daun kemangi. Daun kemangi selanjutnya

dicuci dengan air bersih dan dilakukan perajangan, serta pengeringan,

menggunakan oven pada suhu 60°C. Daun kemangi selanjutnya disortasi kering

untuk memisahkan benda-benda asing seperti bagian-bagian tanaman yang tidak

diinginkan dan pengotor lainnya.

3.5.3 Ekstraksi dengan Metode Maserasi

Pembuatan ekstrak dilakukan dengan metode maserasi dengan perbandingan

simplisia dengan pelarut adalah 1:10. Serbuk simplisia 400 gram direndam

dengan pelarut etanol 70%. Diamkan selama 5 hari sambil dikocok berulang-

ulang 3 kali sehari, simpan di tempat yang sejuk dan terhindar dari cahaya

matahari. Hasil maserasi disaring dan dikumpulkan, kemudian diuapkan dengan

rotary evaporator pada suhu 60°C sampai diperoleh ekstrak kental. Kemudian

hitung rendemen ekstrak.

3.5.4 Evaluasi Ekstrak

3.5.4.1 Pengamatan Organoleptis

Pengamatan menggunakan alat indra manusia (penglihatan, pembau, perasa,

pengecap, dan peraba) yang meliputi uji warna, bau, rasa, dan bentuk.

3.5.4.2 Uji Kadar Air

bobot sebelum di oven−bobot sesudah di oven

% Kadar air = X 100 %
bobot sebelum dioven

Uji kadar air dilakukan dengan cara menimbang ekstrak daun kemangi 1-2 gram

menggunakan krus yang sudah diketahui beratnya. Keringkan pada oven dengan

suhu 105°C selama 5 jam, kemudian dinginkan menggunakan eksikator. Timbang

kembali hingga diperoleh bobot konstan. Kadar air dalam ekstrak tidak boleh

melebihi 10% (Kemenkes, 2011).

3.5.5 Uji Ekstrak Bebas Etanol

Ekstrak daun kemangi diuji etanolnya untuk mengetahui apakah ekstrak daun

kemangi benar-benar bebas dari etanol. Pemeriksaan bebas etanol dilakukan

dengan menambahkan H2SO4 dan CH3COOH pekat pada ekstrak daun kemangi

kemudian dipanaskan. Hasil uji bebas etanol dalam ekstrak daun kemangi ditandai

dengan tidak adanya bau khas ester atau bau wangi (Fahri, 2018).

3.5.6 Fraksinasi

Fraksinasi dari ekstrak kental daun kemangi (Ocinum sanctum L.) dibuat dengan

menimbang ekstrak kental di dalam gelas kimia sebanyak 10 gram. Ekstrak yang

sudah ditimbang dijenuhkan dengan akuades sebanyak 100 ml. Larutan dipartisi

dengan menambahkan 100 ml etil asetat dan dikocok dalam corong pisah dan

sesekali katup labu pemisah dibuka untuk mengeluarkan gas yang dihasilkan
dalam proses pengocokan. Campuran larutan didiamkan hingga terdapat dua

lapisan (lapisan bawah akuades dan lapisan atas etil asetat) kemudian keduanya

dipisahkan. Lapisan etil asetat ditampung dalam wadah, proses penambahan

pelarut untuk partisi dilakukan hingga lapisan etil asetat menjadi bening. Hasil

fraksi kemudian dipekatkan menggunakan rotary evaporator pada suhu 40°C

selama 10 menit hingga diperoleh fraksi dari pelarut lalu ditimbang (Brenda,

2017).

3.5.7 Skrining Fitokimia Fraksi Etil Asetat

3.5.7.1 Uji Warna (Tabung Reaksi)

a. Identifikasi Flavonoid

Sebanyak 10 mg fraksi etil asetat dilarutkan dalam 10 ml etanol, dipanaskan.

Larutan diambil sebanyak 2 ml di dalam tabung reaksi, ditambahkan pita

magnesium (Mg) 1 cm dan ditambahkan HCl pekat 5 tetes. Terbentuknya larutan

berwarna kuning pucat, kuning kehijauan hingga merah bata menunjukkan adanya

flavonoid (J.B. Harbone, 1996).

b. Identifikasi Saponin

Sebanyak 0,5 gram fraksi etil asetat dituangkan ke dalam tabung reaksi.

Kemudian tambahkan 10 ml akuades dan dikocok kuat selama 10 detik. Jika

terbentuk busa setinggi 1-10 cm selama tidak kurang dari 10 menit dan tidak

hilang dengan penambahan HCl 2N menujukkan positif adanya saponin (Depkes

RI, 1995).
c. Identifikasi Alkaloid

Sebanyak 0,5 gram fraksi etil asetat ditambah 1 ml asam klorida 2 N dan 9 ml

akuades, dipanaskan diatas penangas air selama 2 menit, didinginkan dan disaring.

Positif alkaloid jika terjadi endapan atau kekeruhan berwarna jingga (Depkes RI,

1995).

d. Identifikasi Tanin

Sampel uji ditimbang sebanyak 0,5 gram, didihkan selama 3 menit dalam 100 ml

air suling lalu didinginkan dan disaring. Larutan diambil 2 ml ditambahkan 1-2

tetes pereaksi besi (III) klorida 1%. Jika terjadi warna biru kehitaman atau hijau

kehitaman menunjukkan adanya tanin (Depkes RI, 1995).

3.5.7.2 Uji KLT

Larutan uji dibuat dalam konsentrasi 20% b/v dengan menimbang ekstrak daun

tumbuhan sebanyak 200 mg dalam 1 ml pelarut etanol, dan digunakan untuk

percobaan KLT (Endang, 2014).

a. Flavonoid

Fase diam : Lempeng silika GF 254

Fase gerak : Kloroform:Metanol:Air (8:1,8:0,2)

b. Saponin

Fase diam : Lempeng silika GF 254

Fase gerak : Toluen:Etil Asetat (7:3)

c. Alkaloid

Fase diam : Lempeng silika GF 254

Fase gerak : Toluen:Etil Asetat:Dietilamin (7:2:1)

d. Tanin

Fase diam : Lempeng silika GF 254

Fase gerak : Toluen:Aseton:Asam Format (6:6:1)

Larutan uji ditotolkan menggunakan pipa kapiler pada lempeng jarak 1,5-2 cm

dari tepi bawah lempeng. Totolan dibiarkan mengering. Lempeng dimasukkan

dalam beker gelas yang sudah diisi dengan fase gerak yang sudah jenuh dengan

posisi tegak dan bagian tepi bawah tercelup fase gerak, tetapi totolan tidak sampai

terendam. Beker gelas ditutup rapat dan biarkan fase gerak merambat hingga batas

jarak rambat. Lempeng dikeluarkan dan dikeringkan di udara. Lihat bercak yang

timbul dalam sinar ultraviolet pada panjang gelombang 254nm dan 366nm. Ukur

jarak rambat bercak yang timbul dan fase gerak dari titik penotolan sehingga

diperoleh nilai RF.

Jarak tempuh noda

RF =
Jarak eluen

3.6. Uji Aktivitas Antibakteri

Langkah-langkah digunakan untuk uji daya hambat antibakteri fraksi etil asetat

daun kemangi sebagai berikut :

3.6.1 Penyiapan Sterilisasi Alat

Semua alat yang berbahan kaca yang digunakan untuk uji daya hambat antibakteri

disterilkan dengan oven pada suhu 200°C selama 1 jam setelah dicuci bersih dan

dikeringkan, alat-alat tersebut harus dalam kedaan kering agar tidak terdapat noda

pada alat dan dibungkus kertas, untuk alat-alat berisi media bakteri di autoclave

pada suhu 121°C selama 15 menit.

3.6.2 Kontrol Positif dan Kontrol Negatif

Kontrol positif yang digunakan adalah thiamfenicol sebanyak 0,025 gram

dilarutkan dengan akuades steril 1 ml dan kontrol negatif yang digunakan adalah

DMSO 10%.

3.6.3 Pembuatan Media

1. Media NA (Nutrient Agar)

Media NA (0,4 gram) dilarutkan dalam akuades sampai volume 20 ml dan

dipanaskan hingga larut, dituangkan kedalam tabung reaksi steril sebanyak

5 ml, dan ditutup dengan kapas. Media NA disterilkan dalam autoklaf

selama 15 menit dengan suhu 121°C dan tekanan 1 atm, kemudian diamkan

pada suhu ruangan selama 30 menit dan posisikan miring sampai media

memadat. Media NA miring digunakan untuk inokulasi bakteri.

2. Media NB (Nutrient Broth)

Media NB (0,16 gram) dilarutkam dalam akuades sampai volume 20 ml dan

dipanaskan hingga larut, dituangkan kedalam tabung reaksi steril sebanyak

5 ml, dan ditutup dengan kapas. Media NB disterilkan dalam autoklaf

selama 15 menit dengan suhu 121°C dan tekanan 1 atm.

3. Media Pembenihan

Media NA (2 gram) dilarutkan dalam akuades sampai volume 100 ml dan

dipanaskan hingga larut. Media NA disterilkan dalam autoklaf selama 15

menit dengan suhu 121°C dan tekanan 1 atm, dituangkan ke dalam cawan

petri diamkan hinga memadat ke dalam media ditambahkan kultur bakteri

uji secara aseptis.

3.6.4 Inokulasi

Inokulasi bakteri adalah menumbuhkan bakteri pada media agar miring ditabung

reaksi. Cara yang dilakukan dalam inokulasi bakteri adalah dengan diambil 1 ose

bakteri Staphylococcus epidermidis dan digoreskan di media agar miring NA, lalu

diinkubasi selama 24 jam pada suhu 37°C.

3.6.5 Pembuatan Suspensi Bakteri Uji

Sebanyak satu ose kultur bakteri dari media NA (miring) diambil dan dimasukkan

ke dalam media cair NB, diinkubasi pada suhu 37°C selama 24 jam. Bakteri

dalam media NB diambil 100 mikron ditambahkan ke dalam media pembenih dan

diratakan menggunakan batang penyebar.

3.6.6 Pembuatan Seri Konsentrasi Fraksi Etil Asetat Daun Kemangi

Fraksi Etil Asetat daun kemangi dibuat 3 seri konsentrasi 40%, 60%, dan 80%.

Kemudian setiap konsentrasi diencerkan dengan DMSO 10% hingga volume 10

ml.

3.6.7 Pengujian Aktivitas Antibakteri

Pengujian aktivitas antibakteri menggunakan metode difusi padat dengan disc

diffusion. Media NA yang dibuat di cawan petri dibagi menjadi 3 bagian, masing-

masing bagian ditanami bakteri yang telah diinokulasi di atas media NA miring.

Selanjutnya media diberi kertas cakram yang telah diolesi dengan ekstrak. Media

diinkubasi pada suhu 37°C selama 24 jam dan diameter daya hambat masing-

masing sampel uji diukur menggunakan jangka sorong. Bandingkan diameter

daya hambat sampel uji dengan kontrol positif (kloramfenikol) dan kontrol negatif

(DMSO 10%). Dilakukan pengulangan sebanyak 5 kali.

3.7. Teknik Pengolahan Data

3.7.1 Perhitungan Rendemen Ekstrak

Rendemen ekstrak dihitung menggunakan rumus sebagai berikut :

bobot ekstrak
Rendemen (%)¿ X 100 %
bobot simplisia kering

3.7.2 Perhitungan LOD (Lost On Drying)

Perhitungan LOD (Lost On Drying) menggunakan rumus sebagai berikut :

bobot simplisia basah−bobot simplisiakering

LOD ¿ X 100 %
bobot simplisia basah

3.7.3 Teknik Analisis Data

Data dianalisis dengan program microsoft excel dan konsentrasi hambat minimum

diperoleh dari pengmatan diameter daya hambat yang diperoleh dari seri

konsentrasi ekstrak etanol daun kemangi yang didapatkan dari hasil pengukuran

diameter zona hambat fraksi etil asetat terhadap bakteri Staphylococcus

epidermidis.