A concentração de atividade enzimática (U/mL) em uma amostra pode ser determinada a partir da velocidade da

reação catalisada pela enzima em análise.

Antes de iniciar a explicação da estratégia usada neste cálculo deve ser lembrado que por definição 1 unidade
(1U) de atividade enzimática corresponde à quantidade de enzima que catalisa uma reação com velocidade de
formação de 1 micromol de produto por minuto.
Nesta disciplina, propomos uma estratégia para avaliação da concentração de atividade enzimática que se baseia
na determinação da velocidade de uma reação através da quantificação de produto em diferentes tempos de
reação.
Nesta estratégia são preparados 4 tubos de ensaio idênticos contendo substrato e solução com enzima. Os 4 tubos
são simultaneamente incubados a 30°C e a reação é interrompida em cada um dos tubos em tempos diferentes
através da desnaturação da enzima. Ao final, o produto da reação é detectado através de espectrofotometria nos 4
tubos.
Os valores de absorbância são convertidos em mols através de uma curva-padrão apropriada para o produto
detectado. A partir dos dados de tempo de incubação versus mols de produto é construído um gráfico, o qual
deve ser linear se o produto não estiver sendo “esgotado” ou a enzima não estiver se inativando durante o ensaio.
A inclinação da reta (por exemplo: mols/min) corresponde à velocidade da reação e pode ser diretamente
convertida em unidades de atividade enzimática. A concentração de atividade enzimática (U/mL) da amostra é
calculada levando em consideração o volume de amostra utilizado em um tubo de ensaio e a diluição prévia
(antes da amostra ser adicionada em um dos 4 tubos de ensaio), segundo descrito no exemplo abaixo.
 Exemplo:
tubo substrato amostra experimental tempo de incubação (min) absorbância micromols de produto
1 0,1 mL 0,1 mL 5 0,1 0,5
2 0,1 mL 0,1 mL 10 0,2 1
3 0,1 mL 0,1 mL 15 0,3 1,5
4 0,1 mL 0,1 mL 20 0,4 2

Suponha que antes de ser Todos os quatro tubos foram

adicionada nestes tubos de previamente preparados no gelo
Os valores de absorbância
ensaio esta amostra tenha sido e levados para o banho-maria a
foram convertidos em micromols
diluída 5x. Esta amostra contém 30°C simultaneamente. Após 5
utilizando-se uma curva padrão
a enzima minutos a reação no tubo nº 1
apropriada para o produto
foi interrompida. A reação nos
formado nesta reação
demais tubos foi interrompida
2,5 nos tempos indicados.
y = 0,1x
2
1,5
mols

1 Este gráfico foi construído

utilizando as colunas 4 e 6 da
0,5 tabela acima. A inclinação da
reta (coeficiente angular)
0 corresponde à velocidade da
reação, ou seja, formam-se
0 5 10 15 20 0,1micromols de produto por
min min.
A inclinação (0,1 micromols/min) é a velocidade da reação e corresponde à atividade enzimática presente em cada um dos tubos. Note que a
obtenção de uma reta indica que a velocidade é igual em todos os tubos, independentemente do tempo de incubação. Logo, qualquer um dos
tubos contém a mesma quantidade de atividade enzimática (0,1 U).
Sabendo que cada um dos tubos recebeu 0,1 mL de amostra com enzima, conclui-se que a solução inicial contendo a enzima apresenta a
concentração de 1U/mL (0,1 U / 0,1 mL).
Um erro comum é considerar que 0,1 U de enzima está presente na somatória dos 4 tubos simplesmente porque foram usados 4 tubos no
ensaio.
Supondo que antes de ser adicionada em cada um dos tubos de ensaio a solução contendo enzima foi diluída 5 vezes (1:4), conclui-se que a
solução original continha 5U/mL (1 U/mL x 5).