INTRODUCCIÓN A LA MICROBIOLOGÍA

INGENIERÍA QUÍMICA

Prácticas de Microbiología Básica

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 Práctica 1
Aislamiento de microorganismos del suelo
Objetivo

Aislar microorganismos a partir de muestras naturales de suelo y conservar algunos de

ellos en cultivo puro.

Materiales

1. Bata de laboratorio y marcador permanente.

2. Muestras de suelo: aprox. 2 g de suelo de diverso origen, resuspendido en 50 ml de agua mineral.
3. Tubo con10 ml agua estéril, pipetas automáticas (P1000 o P200), puntas de pipeta estériles.
4. 2 Placas de cada uno de los siguientes medios: AN (Agar Nutritivo), LB (Luria-Bertani), y SSM
(Streptomyces Selective Medium)
5. Alcohol de quemar, mechero de alcohol, asa de siembra de vidrio.

Procedimiento

DÍA PRIMERO: Aislamiento I

1. Mezclar la muestra de suelo (en tubo de 50 ml) con 50 ml de agua mineral. Agitar vigorosamente durante
unos 5 minutos. Dejar reposar para que sedimente el material grueso.
2. Hacer una dilución 1/50 a partir del líquido sobrenadante de las muestras (200µl en 10ml en el tubo
preparado)
3. Inocular las 2 placas de los 3 medios con 200µl de sobrenadante sin diluir y 200µl de la dilución 1/50.
4. Incubar las placas a 30º C.
DÍA SEGUNDO: Aislamiento II
1. Observar los microorganismos que han crecido en las placas. Calcular la carga microbiana de la
muestra inicial.
2. Resembrar en placas nuevas de AN para aislar varios microorganismos: ¡Colonias aisladas!
3. Incubar las placas hasta el día siguiente a 30º C.
 Práctica 2
Resiembra en tubo y Tinción de Gram
Objetivos

Resembrar en tubo de agar inclinado los microorganismos seleccionados en la Práctica 1.

Tinción de Gram de los microorganismos seleccionados y resembrados en tubo de agar
inclinado.
Observaciones Tinción de Gram:
Es una tinción diferencial de gran importancia en Microbiología porque permite diferenciar dos grandes
grupos de bacterias, Gram+ y Gram-, según se comporten ante esta tinción. El fundamento radica en la diferente
estructura de la pared celular de ambos grupos. Se emplean dos colorantes, cristal violeta y safranina. Tras la
tinción con el primer colorante (Cristal violeta) se efectúa un lavado con etanol que arrastrará al colorante sólo en
las Gram (-), mientras que en las Gram (+) el colorante queda retenido y las células permanecerán azules. Las
células Gram (-) se teñirán después con un colorante de contraste (safranina) para que puedan observarse.

Materiales

1. Bata de laboratorio, marcador permanente y encendedor de gas, mechero de alcohol, asa de siembra.
2. Placas de los microorganismos aislados por estría en la Práctica 1
3. 4 Tubos de agar inclinado (Agar Nutritivo)
4. Reactivos para la Tinción de Gram: Cristal violeta, Lugol, Etanol, Safranina, Agua.
5. Material para microscopía óptica: Portas y microscopio óptico y aceite de inmersión (para 100X)

Procedimiento

DÍA PRIMERO: Resiembra a tubo de agar inclinado

1. Empleando la técnica estéril, inocular cada microorganismo aislado en un tubo de agar inclinado
(Agar Nutritivo). Incubar a 30º C hasta el día siguiente.
DÍA SEGUNDO: Tinción de Gram a partir de las resiembras del día anterior

1. Extensión de la muestra en el porta (hasta 2 microorganismos por porta)

2. Fijar a la llama (¡SIN QUEMAR LA MUESTRA!)
3. Cristal violeta 1-2 minutos. Tirar el exceso de colorante (¡NO lavar con agua!).
4. Añadir lugol, esperar 1 minuto y tirar el exceso (¡No lavar con agua!)
5. Decolorar con etanol (20 segundos). Lavar con agua.
6. Añadir Safranina (colorante de contraste), esperar 1 minuto. Lavar con agua.
7. Secar al aire (o ¡muy suavemente a la llama!)
8. Observar al microscopio con objetivo 40X. Observar con objetivo 100X y aceite de inmersión.
9. ANOTAR LOS RESULTADOS: FORMA, TINCIÓN GRAM, OBSERVACIONES.
 Práctica 3
Detección de actividades enzimáticas en placa
Objetivos

Comprobar si los microorganismos seleccionados poseen actividades enzimáticas

extracelulares: amilasa, celulasa, proteasa.

Materiales

1. Bata de laboratorio, marcador permanente y encendedor de gas, mechero de alcohol, asa de siembra,
guantes de plástico
2. Tubos de los microorganismos aislados en la Práctica 2
3. Placas de agar nutritivo con sustratos en superficie (Almidón, Carboximetil Celulosa, Caseína)
4. Reactivos para revelar las actividades enzimáticas: Yodo resublimado, Rojo Congo 0.5% en agua,
Cloruro Sódico 1 M, TCA 1% en agua.

Procedimiento

DÍA PRIMERO: Inoculación de microorganismos seleccionados en placas de medio con sustratos

1. Empleando la técnica estéril, hacer una estría de cada microorganismo aislado en cada placa de Agar
Nutritivo con sustrato. Incubar a 30º C hasta el día siguiente.
DÍA SEGUNDO: Observación de los halos de degradación de sustratos en placa

1. Observar las placas para ver halos de degradación de sustratos

2. Revelar los halos de degradación para incrementar el contraste:
• Actividad amilásica: Vapores de Yodo resublimado (¡GUANTES Y EN CAMPANA DE
EXTRACCIÓN!)
• Actividad Célulasica: Inundar la placa con Rojo Congo (0,5%) (. Esperar 10 minutos. Lavar con
Cloruro Sódico 1 M. (¡GUANTES!)
• Actividad proteásica: Inundar la placa con TCA 1%. (¡GUANTES!)