PETUNJUK PRAKTIKUM

KULTUR JARINGAN TUMBUHAN

Oleh

Sellia Virgia Rahmawati, S.P.

Daftar Isi

I. Pengenalan Laboratorium
II. Sterilisasi alat
III. Pembuatan Media Kultur
IV. Sterilisasi Eksplan
V. Inisiasi
VI. Multiplikasi (Subkultur)
VII. Aklimatisasi

2
 I. Pengenalan Laboratorium

A. Pendahuluan

Kultur jaringan dilakukan pada lingkungan yang

aseptis dan terkendali, yaitu di laboratorium. Sehingga,
pengetahuan mengenai laboratorium kultur jaringan
sangat penting bagi orang yang ingin mendalami kultur
jaringan, dalam hal ini adalah mahasiswa yang
melaksanakan praktikum.

B. Tujuan

Praktikum ini bertujuan untuk mengenalkan

laboratorium kultur jaringan dan alat-alat yang digunakan
dalam pelaksanaan kultur jaringan.

C. Alat
1. Laminar air flow cabinet
2. Autoklaf
3. Timbangan analitik
4. pH meter
5. Oven
6. Hot plat and stirer
7. Refrigerator
8. Alat-alat diseksi
9. Glassware

D. Bahan
1. Bahan untuk membuat media
2. Bahan untuk strerilisasi eksplan, alat dan ruangan

3
E. Cara Kerja
1. Praktikan dengan tertib masuk ke ruang lab. Kultur
jaringan tumbuhan
2. Praktikan diperkenalkan dengan ruangan-ruangan yang
ada di lingkungan lab. Kultur jaringan tumbuhan
3. Selain itu, praktikan diperkenalan dengan alat-alat
dan bahan-bahan yang digunakan dalam proses
kultur jaringan tumbuhan dan cara penggunaannya

4
 II. Sterilisasi Alat

A. Pendahuluan

Alat-alat yang dipakai ketika penanaman harus

dalam keadaan steril. Alat-alat logam, gelas dan media
tanam disterilkan dengan autoclave.

Autoklaf yang dapat digunakan ada bermacam-

macam, mulai dari yang sederhana sampai yang
progamable. Autoklaf yang sederhana menggunakan
sumber panas dengan menggunakan kompor gas. Pada
autoklaf yang sederhana ini, tekanan dan suhu diatur
dengan membesarkan atau mengecilkan sumber api.
Kelemahan autoklaf ini adalah perlunya penjagaan dan
pengaturan panas secara manual selama masa
sterilisasi dilakukan. Keuntungan penggunaan autoklaf ini
adalah sederhana pengoperasianya, harganya relatif
murah, tidak tergantung pada aliran listrik, dan lebih
cepat masak dibandingkan dengan autoklaf listrik.

B. Tujuan
1. Mengetahui alat-alat yang digunakan dalam
kultur jaringan
2. Mempelajari cara sterilisasi alat
menggunakan autoklaf

C. Alat
1. Alat Diseksi
2. Botol Kultur
3. Cawan petri
4. Autoclaf
5. Almunium Foil

5
D. Bahan
1. Sabun cuci
2. Aquades

E. Cara Kerja

Sterilisasi alat

1. Alat-alat diseksi dan cawan petri dicuci dengan

menggunakan sabun cuci kemudian dikeringkan
2. Bungkus alat-alat yang sudah kering tersebut dengan
menggunakan almunium foil
3. Masukkan ke dalam autoklaf selama 15 menit dengan
o
pengaturan tekanan sebesar 17,5 psi dan suhu 121 C
4. Setelah suhu autoklaf dingin, keluarkan alat-alat
diseksi dan cawan petri kemudian di simpan di ruang
steril

Membuat air steril

1. Botol kultur dicuci dengan menggunakan sabun cuci

kemudian dikeringkan
2. Setelah kering, masukkan Aquades sebanyak 100 ml
per botol
3. Tutup botol dengan plastik khusus
4. Masukkaan botol yg berisi air tersebut ke dalam
autoklaf selama 15 menit dengan pengaturan
o
sebesar 17,5 psi dan suhu 121 C
5. Setelah suhu autoklaf dingin, botol kultur yang berisi
air steril kemudian di simpan di ruang steril

6
 III. Membuat Media Kultur

A. Pendahuluan
Media merupakan faktor utama dalam perbanyakan
dengan kultur jaringan. Keberhasilan perbanyakan dan
perkembangbiakan tanaman dengan metode kultur
jaringan secara umum sangat tergantung pada jenis
media .
Media tumbuh pada kultur jaringan sangat besar
pengaruhnya terhadap pertumbuhan dan perkembangan
eksplan serta bibit yang dihasilkannya. Oleh karena itu,
macam-macam media kultur jaringan telah ditemukan
sehingga jumlahnya cukup banyak. Nama-nama media
tumbuh untuk eksplan ini biasanya sesuai dengan nama
penemunya.
Pada umumnya komposisi utama media tanam kultur
jaringan, terdiri dari hormon (zat pengatur tumbuh) dan
sejumlah unsur yang biasanya terdapat di dalam tanah yang
dikelompokkan ke dalam unsur makro, unsur mikro. Hasil
yang lebih baik akan dapat kita peroleh bila, kedalam media
tersebut, ditambahkan vitamin, asam amino, dan hormon,
bahan pemadat media (agar), glukosa dalam bentuk gula
maupun sukrosa, air destilata (akuades), dan bahan organik
tambahan (Gunawan, 1992).

B. Tujuan
1. Mengetahui jenis-jenis media kultur
jaringan tumbuhan
2. Mengetahui cara pembuatan meduia kultur jaringan
tumbuhan
C. Alat

7
 1. Gelas piala 1 liter
2. Botol Kultur
3. Plastik
4. Karet
5. Hotplate and stirer
6. pH meter
7. Autoklaf

D. Bahan
1. Media MS
2. ZPT
3. Agar
4. Gula
5. NaOH
6. HCl
7. Aquades

E. Cara Kerja
1. Siapkan alat-alat dan bahan-bahan yang akan
digunakan dalam proses pembuatan media kultur
2. Timbang media MS sebesar 21,7gr, gula 20gr dan
agar 7gr
3. Larutkan MS, gula dan ZPT ke dalam gelas piala
kemudian tambahkan aquades mencapai 1 liter
4. Ukur pH larutan media, atur menggunakan NaOH
dan HCl hingga mencapai pH 5,7
5. Masukkan agar dan didihkan larutan
6. Stelah larutan masak, masukkan ke dalam botol-
botol kultur kemudian ditutup dengan plastik
5. Masukkan botol-botol kultur yang berisi larutan media ke
dalam autoklaf selama 20 menit dengan pengaturan
o
tekanan sebesar 17,5 psi dan suhu 121 C
7. Setelah suhu autoklaf dingin, angkat botol-botol
kultur yang berisi larutan media tersebut

8
8. Simpan botol-botol kultur di tempat steril

9
 IV. Sterilisisasi Eksplan

A. Pendahuluan
Sterilisasi eksplan yang bebas dari kontaminan
merupakan langkah yang sangat penting, karena
tanaman yang dari lapang mengandung debu, kotoran-
kotoran dan berbagai kontaminan hidup pada
permukaannya. Kontaminan hidup dapat berupa
cendawan, bakteri, serangga dan telurnya, tungau serta
spora-spora. Bila sumber kontaminan ini tidak
dihilangkan, maka pada media yang me-ngandung gula,
vitamin dan mineral akan ditumbuhi oleh jamur dan
bakteri. Apabila eksplan terkontaminasi, maka akan mati
oleh persenyawaan beracun yang di produksi dan
dikeluarkan oleh bakteri atau jamur.

B. Tujuan
1. Mengetahui bahan-bahan yang digunakan
dalam strerilisasi eksplan
2. Mengetahui proses strerilisasi eksplan dalam
kultur jaringan tumbuhan

C. Alat
1. Botol kultur
2. Gunting
3. Bunsen
4. Pinset
5. Skalpel
6. Sprayer
7. Spatula
8. Tissue

10
D. Bahan
1. Bibit tanaman
2. Aquades
3. Air steril
4. Deterjen
5. Pemutih pakaian (clorox)

E. Cara Kerja
1. Siapkan semua alat dan bahan yang akan digunakan
dalam proses sterilisasi eksplan
2. Gunakan gunting untuk mengambil bagian tanaman
yang akan dikulturkan, sebaiknya bagian pucuk
karena masih muda dan tidak terlalu banyak
kontaminasi
3. Masukan potongan eksplan tersebut ke dalam
botol kultur yang sudah diisi dengan air bersih
4. Cuci dengan menggunakan deterjen di air mengalir,
kemudian masukkan eksplan tersebut ke dalam botol
5. Masukkan eksplan tanaman yang akan dikulturkan ke
dalam larutan fungisida selama 1 jam
6. Eksplan dibawa ke ruang Laminar air flow cabinet
7. Pindahkan eksplan tersebut dari larutan fungisida ke
larutan clorox 30%, 20% dan 10% masing-masing
10 menit
8. Stelah semua proses dilalui, eksplan tersebut dibilas
3 kali dalam air steril
9. Eksplan siap diinisiasi

11
 V. Inisiasi Eksplan

A. Pendahuluan
Inisiasi merupakan salah satu aspek dari tumbuh
pada tanaman dengan menghasilkan bagian-bagian atau
organ baru. Inisiasi adalah tahap pengambilan eksplan
dari tanaman induk yangakan diperbanyak secara kultur
jaringan. Sebelum melakukan inisiasi sebaiknya terlebih
dahulu melakukan sterilisasi. Tujuan utama tahap ini
adalah mengusahakan kultur yang aseptic atau aksenik.
Aseptik berarti bebas darimikroorganisme, sedangkan
aksenik berarti bebas dari mikroorganisme yang tidak
diinginkan.

B. Tujuan
Mengetahui langkah-langkah penanaman kultur jaringan
pada laminar air flow dalam keadaan steril .

C. Alat
1. Laminar air flow
2. Cawan petri
3. Bunsen
4. Sprayer
5. Alat diseksi
6. Plastik wrap

D. Bahan
1. Media kultur yang sudah disiapkan sebelumnya
2. Eksplan yang sudah disterilisasi
3. Spirtus
4. Alkohol 96%
5. Alkohol 70%
6. Air steril

12
E. Cara Kerja
1. Siapkan semua alat dan bahan yang akan
digunakan dalam proses inisiasi eksplan
2. Kemudian nyalakan lampu bunsen.
3. Semprot pinset dengan alkohol 70 % atau celupkan
pada alkohol 96 % atau pada spiritus, kemudian
bakar di atas lampu bunsen dari pangkal sampai
ujung. Lakukan 2 – 3 kali. Langkah ini untuk
memusnahkan spora jamur atau bakteri yang
masih menempel pada pinset.
4. Letakkan pinset di atas petridish/botol alkohol.
5. Ambil botol media dan buka.
6. Ambil eksplan dengan pinset dan
masukkan langsung ke dalam botol kultur.
7. Tutup rapat dan letakkan disebelah kanan.
8. Agar tekanan dari luar tidak masuk, tutup
botol dapat dilapisi plastik klin wrap.
9. Beri label tanggal penanaman, jenis tanaman
dan nama media.

13
 VI. Multiplikasi (Subkultur)

A. Pendahuluan
Multiplikasi merupakan tahap penumbuhan tunas
hasil inisiasi yang dirangsang dengan memotong plantlet
dengan media kultur baru. Tahap ini dilakukan dengan
metode subkultur yaitu usaha untuk menggantikan media
tanaman kultur jaringan dengan media yang baru,
sehingga kebutuhan nutrisi untuk pertumbuhan kalus
dapat terpenuhi.
Subkultur dapat dilakukan beberapa kali sampai
jumlah tunas yang dihasilkan sesuai dengan yang kita
harapkan. Subkultur yang terlalu banyak dapat
menurunkan mutu tunas, seperti terjadinya vitrifikasi
(suatu gejala ketidaknormalan fisiologis) dan aberasi
(penyimpangan) genetik. Keadaan ini terjadi karena
semakin banyak subkultur dilakukan berarti semakin
sering tanaman dikondisikan dalam media yang
mengandung sitokinin, sehingga daya regenerasinya
meningkat.

B. Tujuan
Megetahui cara memperbanya kultur melalui
proses subkultur

C. Alat
1. Laminar air flow
2. Cawan petri
3. Bunsen
4. Sprayer
5. Alat diseksi
6. Plastik wrap

14
D. Bahan
1. Planlet
2. Media kultur
3. Spirtus
4. Alkohol 96%
5. Alkohol 70%
6. Air steril

E. Cara Kerja
1. Siapkan semua alat dan bahan yang
akan digunakan dalam proses multiplikasi
2. Kemudian nyalakan lampu bunsen.
3. Semprot pinset dengan alkohol 70 % atau celupkan
pada alkohol 96 % atau pada spiritus, kemudian
bakar di atas lampu bunsen dari pangkal sampai
ujung. Lakukan 2 – 3 kali. Langkah ini untuk
memusnahkan spora jamur atau bakteri yang
masih menempel pada pinset.
4. Ambil tanaman dari botol kultur yang akan
di multiplikasi.
5. Letakkan tanaman di dalam petridish dan
dipotong-potong dengan meng-gunakan pisau
scapel atau gunting.
6. Ukuran eksplan, bisa pernodlus untuk
tanaman berkayu atau pertunas.
7. Kemudian tanam kembali eksplan pada media kultur
yang baru. Isi 1 botol kultur bisa 5 -10 eksplan.
8. Tutup rapat dan letakkan disebelah kanan.
9. Agar tekanan dari luar tidak masuk, tutup
botol dapat dilapisi plastik klin wrap.
10. Beri label tanggal penanaman, jenis tanaman dan
nama media.

15
 VII. Aklimatisasi

A. Pendahuluan
Aklimatisasi merupakan proses penyesuaian planlet dari
kondisi mikro dalam botol (heterotrof) ke kondisi lingkungan
luar (autotrof). Planlet yang dipelihara dalam keadaan steril
dalam lingkungan (suhu dan kelembaban) optimal, sangat
rentan terhadap lingkungan luar (lapang). Mengingat sifat-
sifat tersebut, sebelum ditanam di lapang, planlet
memerlukan aklimatisasi. Aklimatisasi dapat dilakukan di
rumah kaca atau pesemaian, baik di rumah kaca atau
pesemaian. Dalam aklimatisasi, lingkungan tumbuh
(terutama kelembaban) berangsur-aengsur disesuaikan
dengan kondisi lapang (Rahardja 1989).
B. Tujuan
1. Mengetahui cara mempersiapkan tanaman
untuk diaklimatisasikan
2. Mengetahui cara mengaklimatisasikan tanaman
hasil kultur jaringan dalam media aklimatisasi
C. Alat
1. Bak kecambah
2. Sungkup plastik
3. Pinset
4. Ember
5. Sprayer

D. Bahan
1. Planlet
2. Arang, peat moss dan sekam bakar

E. Cara Kerja

16
1. Siapkan semua alat dan bahan yang akan digunakan
dalam proses aklimatisasi
2. Keluarkan planlet dari botol kultur kemudian dicuci di
air mengalir sampai media kultur yang menempel di
akar bersih
3. Siapkan media di dalam bak kecambah
4. Tanam planlet yang sudah bersih di bak
kecambah tersebut dengan jarak terrentu
5. Atur kelembaban dengan menggunakan sungkup dan
menyiramnya dengan mengguakan sprayer

17