TUGAS BIOTEKNOLOGI

RESUME BUKU PHARMACEUTICAL BIOTECHNOLOGY

CHAPTER 24 GENE THERAPY

Disusun Untuk Memenuhi Tugas Mata Kuliah Bioteknologi Farmasi

Dosen Pengampu : BAWON TRIATMOKO, S.Farm., M.Sc., Apt.

Disusun Oleh :

Nama : CHRISMA ENGGAR P

NIM : 172210101065

Kelas :A

FAKULTAS FARMASI

UNIVERSITAS JEMBER

2019
 TERAPI GEN

PENDAHULUAN

Terapi gen adalah penggunaan asam nukleat sebagai agen untuk mengobati
penyakit. Terapi gen biasanya menargetkan satu atau lebih gen yang termutasi tanpa
memengaruhi gen normal di sekitar lokasi penyakit. Target terapi gen dapat berupa
onkogen abnormal yang produknya dapat menyebabkan tumor atau mutasi gen yang
mana seharusnya produk tersebut sangat penting untuk mempertahankan fungsi
fisiologis normal. Dibandingkan dengan obat-obatan molekul kecil, terapi gen tidak
akan menyebabkan resistensi obat bahkan setelah perawatan berulang karena target
pengobatan gen bukanlah reseptor tertentu tetapi gen yang mengkode penyakit
tersebut.

VEKTOR UNTUK TRANSFER GEN

■ Komponen Dasar Plasmid

Plasmid adalah molekul DNA sirkuler, untai ganda yang mengandung DNA
komplementer (cDNA) pengkodean urutan untuk gen terapeutik dan beberapa elemen
genetik lainnya termasuk elemen bakteri, transcription regulatory elements (TRE),
multiple cloning sites (MCS), daerah yang tidak diterjemahkan (UTR), intron, urutan
polyadenylation (polyA), dan tag fusion, yang semuanya memiliki dampak besar pada
fungsi produk genetik akhir.

Elemen Bakteri

Plasmid memiliki dua fitur yang penting untuk perbanyakan bakteri. Salah
satunya adalah Ori, yang merupakan urutan DNA spesifik itu mengikat faktor-faktor
yang mengatur replikasi plasmid dan mengendalikan jumlah salinan plasmid per
bakteri. Elemen yang diperlukan kedua adalah penanda, biasanya gen yang
memberikan resistensi terhadap antibiotika.

Elemen Pengaturan Transkripsi (TRE)

Plasmid pengekspres gen mengandung elemen pengatur transkripsi (TRE).

Berbagai TRE (promotor, enhancer, operator, isolator, dll.) akan berinteraksi dengan
mesin molekuler (faktor transkripsi umum, aktivator, co-aktivator, dan penekan) untuk
mengontrol pola gen ekspresi.
 Promotor adalah urutan DNA yang memungkinkan gen yang akan ditranskripsi.
Mutasi dibagian ini akan mencegah pengikatan RNA polimerase dan proses transkripsi
selanjutnya. Cytomegalovirus (CMV), virus Rous sarcoma (RSV), dan virus Simian 40
(SV40) adalah promotor virus terkuat yang diketahui. Potensi promotor dapat spesifik
bekerja pada sel dan jaringan. Jarak antara promotor dan kaset transgen juga memiliki
dampak besar pada gen ekspresi.

Enhancer adalah urutan DNA pendek yang bisa mengikat faktor transkripsi atau
aktivator untuk ditingkatkan tingkat transkripsi gen dalam kluster gen. Enhancer tidak
langsung bertindak pada wilayah promotor, tetapi akan didapatkan efeknya setelah
diikat oleh aktivator atau faktor transkripsi lainnya. Protein ini merekrut RNA polimerase
dan faktor transkrip umum dan menstabilkan inisiasi transkripsi kompleks.

Multiple Cloning Site (MCS)

Beberapa situs kloning (MCS), dikenal sebagai polylinker, adalah segmen DNA
pendek yang berisi banyak sisi pembatas restriksi endonuclease. Dalam setiap MCS,
biasanya ada hingga 20 situs pembatasan yang dapat diidentifikasi dan mudah dibelah
dengan restriksi endonuklease. MCS memungkinkan penyisipan cDNA tunggal atau
multiple cDNA bergantung pada persyaratan gen terapeutik.

Wilayah yang Tidak Diterjemahkan (UTR)

Daerah yang tidak diterjemahkan (UTR) merujuk pada dua bagian di setiap sisi
pengkodean urutan pada untai mRNA. 5 ′ UTR adalah wilayah transkripsi mRNA yang
terletak di antara capsite dan kodon inisiasi. 5 ′ UTR berisi elemen pengatur yang
mengendalikan ekspresi gen. 3 ′ UTR adalah wilayah transkrip mRNA mengikuti kodon
terminasi. 3 ′ Memainkan UTR peran penting dalam stabilitas mRNA.

Intron

Dalam setiap sel eukariotik, intron ditranskripsi bersama dengan ekson

pengode protein menjadi mRNA prematur dan dihilangkan dengan splicing mRNA.
Tidak ada intron dalam urutan cDNA. Intron sering dimasukkan ke dalam 5 ′ UTR unit
transkrip.

Urutan Polyadenylation (polyA)

Sinyal polyA adalah situs pengenalan yang terdiri dari Hexamer AAUAAA
diposisikan 10-30 nukleotida hulu dari ujung 5 ′ dan elemen kaya GU atau U terletak
maksimal 30 nukleotida di hilir 3′end. Fungsi terpenting dari urutan poliA adalah untuk
mencegah mRNA degradasi enzimatik.
Tag Fusion

Tag fusi adalah protein atau peptida yang terletak di C- atau N- terminal protein
target untuk mengerahkan satu atau beberapa fungsi seperti meningkatkan ekspresi,
kelayakan, deteksi, pemurnian, atau pelokalan. Maltose binding protein (MBP) sering
digunakan untuk meningkatkan kelarutan protein rekombinan diekspresikan dalam
sistem E. coli. Tag protein fluoresen akan memberikan informasi tentang lokasi
intraseluler dari ekspresi transgen.

VEKTOR VIRAL

Untuk membangun vektor virus, gen yang bertanggung jawab untuk replikasi virus
dan patogenisitas dihilangkan dan diganti dengan kaset transgen. Kemudian genom
virus rekombinan dimasukkan ke dalam plasmid dan ditransduksi ke garis sel yang
berisi gen yang bertanggung jawab untuk replikasi virus untuk menghasilkan vektor
virus rekombinan. Konstruk vektor berisi urutan terminal (ITRs atau LTRs), sinyal
pengemasan (ψ), dan kaset transgen. Sinyal pengemasan (ψ) mengatur proses
penting dari pengemasan materi genetik ke dalam kapsid virus selama replikasi.
Retrovirus, lentivirus, adenovirus, dan virus terkait adeno (AAV) banyak dipelajari dan
digunakan sebagai vektor virus untuk terapi gen.

■ Retrovirus

Biologi

Retrovirus adalah virus RNA yang diselimuti dua salinan genom RNA untai tunggal.
Retrovirus berdiameter 80-100 nm dan memiliki virus genom sekitar 7-10 kb, terdiri dari
kelompok spesifik kode gen antigen (gag) untuk protein inti dan struktural virus; kode
gen polimerase (pol) untuk reverse transcriptase, protease, dan integrase; dan kode
gen amplop (env) untuk protein mantel retroviral. Pengulangan panjang terminal (LTR)
mengontrol ekspresi gen virus, karena bertindak sebagai penambah promotor.

Kesesuaian Retrovirus sebagai Vektor untuk Transfer Gen

Untuk menghasilkan vektor retroviral yang kekurangan replikasi, urutan

pengkodean protein virion (gag, pol, dan env) bertanggung jawab atas replikasi virus
dan patogenisitas digantikan oleh transgen. Transgen dapat dikontrol oleh LTR asli
atau eksogen urutan penambah promotor yang dapat direkayasa ke dalam genom
bersama dengan transgen.
 Vektor retroviral mampu mengintegrasikan ke dalam genom inang. Retrovirus
dapat digunakan untuk mengarahkan transdifferensiasi sel induk oleh sel somatik yang
memiliki sifat seperti sel induk. Keterbatasan utama gen berbasis terapi retrovirus
adalah retrovirus secara acak memasukkan materi genetik ke dalam genom inang.

Penggunaan Klinis Retrovirus

Virus leukemia murine Moloney (MoMLV), salah satu yang paling teliti dicirikan
retrovirus, adalah vektor virus pertama yang digunakan klinik untuk mengobati
kekurangan ADA yang disebabkan oleh SCID, penyakit bawaan di mana penumpukan
deoxyadenosine yang disebabkan oleh defisiensi ADA melarang ekspansi limfosit,
untuk mengobati bentuk langka X-linked parah kombinasi immunodeficency (X-SCID).

■ Lentivirus

Biologi

Lentivirus adalah retrovirus unik yang dapat ditiru di kedua sel membelah dan
tidak membelah. Lentivirus miliki enam gen aksesori seperti tat, rev, vpr, vpu, nef, dan
vif, yang mengatur sintesis dan pemrosesan viral RNA dan fungsi replikasi lainnya.

Human Immunodeficency Virus (HIV) adalah lentivirus terbaik yang dikenal.

Virus HIV secara genetik telah dimanipulasi untuk menghasilkan vektor virus untuk gen
yang efisien ditransfer ke sel T manusia dan makrofag.

Kesesuaian Lentivirus sebagai Vektor untuk Transfer Gen

Signifikan vektor lentiviral terletak pada kenyataan bahwa mereka secara

efisien dapat mentransduksi sel-sel yang tidak membelah atau secara terminal sel-sel
yang berdiferensiasi seperti neuron, makrofag, sel punca hematopoietik, otot, dan hati
sel serta jenis sel lainnya yang tradisional. Lentivirus tidak mendapatkan respon imun
yang signifikan dan dengan demikian bisa ideal untuk ekspresi gen in vivo.

Penggunaan Klinis Vektor Lentiviral

Penggunaan lentivirus sebagian besar untuk mengobati infeksi HIV. Tujuan

klinis dari pendekatan pengobatan ini adalah untuk mengurangi HIV dan
mempromosikan kelangsungan hidup sel T CD4 in vivo.

■ Adenovirus

Biologi
 Adenovirus adalah virus tanpa lipid bilayer luar , icosahedral, virus DNA litik
yang terdiri dari nukleokapsid dan genom beruntai ganda linier. Adenovirus mampu
menginfeksi sel yang membelah dan yang tidak membelah.

Kesesuaian Adenovirus sebagai Vektor untuk Transfer Gen

Untuk membangun vektor adenoviral sebagai terapi gen, daerah E1 dan E3

dari genom virus sering dihapus untuk mencegah replikasi virus serta mengakomodasi
kaset-kaset transgen.Adenovirus memiliki genom besar yang mampu menampung
kaset transgen besar. Genom adenoviral juga mudah dimanipulasi untuk menghasilkan
vektor dengan banyak penghapusan dan sisipan tanpa memengaruhi efisiensi
transduksi.

Karakteristik lain yang menguntungkan dari adenovirus yaitu biologi virus

mudah dipahami dengan baik, virus rekombinan dapat dihasilkan dengan titer dan
kemurnian tinggi, ekspresi transgen dari adenovirus cepat dan kuat, dan adenovirus
dapat menginfeksi berbagai pemisahan dan tidak membagi sel.Adenovirus tidak
berintegrasi ke dalam genom inang.

Penggunaan Klinis Vektor Adenoviral

Saat ini, sekitar 23% dari semua uji klinis terapi gen melibatkan adenovirus
rekombinan, menjadikannya vektor yang paling banyak digunakan untuk transfer gen.
Cerepro, obat yang terdiri dari thymidine kinase (TK) yang mengkode adenovirus
rekombinan, telah diberikan status obat orphan oleh European Committee for Orphan
Medicinal Products dan Office of Orphan Products Development (FDA).

■ Adeno-Associated Virus (AAV)

Biologi

Genom AAV adalah molekul DNA 4,1 kb linier, beruntai tunggal yang terdiri dari
dua frame pembacaan terbuka (ORF), rep, cap, dan dua pengulangan terminal terbalik
(ITR) yang menentukan awal dan akhir dari genom virus dan urutan pengemasan. Gen
rep mengkode protein yang bertanggung jawab untuk replikasi virus, sedangkan gen
topi mengkode protein kapsid struktural. ITR diperlukan untuk replikasi, pengemasan,
dan integrasi genom.

Kesesuaian AAV sebagai Vektor untuk Transfer Gen

Genom AAV sederhana, sehingga mudah dimanipulasi. Virus ini tahan

terhadap tantangan fisik dan kimia selama pemurnian dan penyimpanan jangka
panjang. Kemampuan virus untuk berintegrasi dalam kromosom manusia adalah
persoalan awal, tetapi akhirnya AAV hanya berintegrasi ke lokasi kromosom manusia
yang tetap dan frekuensi integrasi AAV rekombinan cukup rendah.

Penggunaan Klinis Vektor AAV

Penggunaan klinis pertama AAV rekombinan adalah untuk mentransfer cDNA

cDNA fibrosis transmembran konduktansi regulator (CFTR) ke epitel pernapasan untuk
mengobati fibrosis cystic. Percobaan fase I dan fase II lainnya menunjukkan bahwa
transfer gen yang dimediasi AAV aman dan efektif untuk mengobati Leber’s congenital
amaurosis , hemophilia, defisiensi lipoprotein lipase dan penyakit parkinson. Saat ini
ada empat percobaan menggunakan vektor AAV2 dalam pengujian fase III untuk
kanker prostat yang resisten terhadap hormon metastatik

VEKTOR NON VIRAL

Vektor nonviral secara signifikan kurang imunogenik dan cenderung tidak

menginduksi mutagenesis insersi dan rekombinasi homolog yang tidak diinginkan
setelah di ambil oleh sel. Vector nonviral juga relatif mudah untuk dimanipulasi,
diproduksi, dan dimurnikan dalam skala besar dibandingkan dengan vektor viral.

■ Metode Pengiriman untuk Transfer Gen Nonviral

Metode Fisik untuk Transfer Gen

Teknik paling awal untuk mengirimkan DNA rekombinan ke target seluler

meliputi injeksi mikro, penembakan partikel, dan elektroporasi. Mikroinjeksi, injeksi
langsung DNA atau RNA ke dalam sitoplasma atau inti sel tunggal, adalah metode
paling sederhana dan paling efektif untuk pengiriman fisik bahan genetik ke sel. Selain
itu, microinjection tidak cocok untuk transfer gen in vivo atau transfer gen in vitro ke
jaringan atau organ yang terdiri dari sejumlah besar sel. Penembakan partikel, atau
perawatan gen, dimulai dengan pelapisan partikel tungsten atau partikel emas dengan
DNA plasmid. Pengeboman partikel dapat digunakan untuk memperkenalkan berbagai
vaksin DNA ke dalam sel yang diinginkan secara in vitro. Elektroporasi digunakan
untuk menghasilkan pori-pori, sementara di membran plasma untuk mentransfer DNA
plasmid ke sel-sel oleh medan listrik tegangan tinggi yang diterapkan secara eksternal.
Elektroporasi meningkatkan efisiensi transfer gen hingga 100-1000 kali lipat
dibandingkan dengan larutan DNA telanjang dan telah sukses dalam praktik
laboratorium dan uji klinis.Transfer gen termediasi elektroporasi juga menunjukkan
keamanan dan kemanjuran dalam uji klinis untuk mengobati melanoma, kanker
prostat, dan infeksi HIV. Metode fisik lainnya untuk transfer gen termasuk sonoporasi,
iradiasi laser, magnetofeksi, dan hidroporasi.

Lipid kationik

Sebagian besar lipid kationik terdiri dari tiga bagian: (i) kelompok jangkar lipid
hidrofobik; (ii) kelompok penghubung, seperti ester, amida, atau karbamat; dan (iii)
kelompok kepala bermuatan positif, yang berinteraksi dengan DNA plasmid bermuatan
negatif, yang mengarah pada pembentukan kondensasi dan agregatnya (rentang
nanometer / mikrometer). 2, 3-dioleyloxypropyl-1-trimethyl ammonium bromide
(DOTMA) dan 3-β [N (NV, NV- dimethylaminoethane) -carbamoyl] kolesterol (DC-Chol)
adalah dua lipid kationik yang umum digunakan dengan struktur yang berbeda. Lipid
kationik biasanya dicampur dengan ko-lipid netral seperti
dioleoylphosphatidylethanolamine (DOPE) pada rasio molar tertentu untuk mengurangi
toksisitas dan meningkatkan pengiriman gen. PEGilasi poliplex sering digunakan untuk
mengurangi pengikatan plasma dan meningkatkan waktu sirkulasi liposom kationik.

Lipoplexes diambil oleh sel melalui rute endosome. Untuk pelepasan dan
transportasi endosom ke dan melalui membran inti, elemen fungsional tambahan dapat
dilampirkan: untuk pelepasan endosom (peptida fusiogenik yang peka terhadap pH),
untuk transportasi dalam sitoplasma, dan bagian membran inti (inti peptida
translokasi).

Peptida

Sama seperti lipid kationik, peptida kationik memadatkan DNA dengan cara
yang serupa dan dapat digunakan sebagai pembawa pengiriman gen. Poly (L -lysine)
(PLL), suatu polidisperse, pengulangan sintetis dari asam amino lisin, adalah salah
satu peptida kationik pertama yang menghasilkan gen. Namun, peningkatan panjang
PLL menyebabkan peningkatan sitotoksisitas. Selain itu, PLL menunjukkan efisiensi
transfeksi terbatas dan membutuhkan penambahan agen endoosmolitik seperti peptida
fusogeni untuk memfasilitasi pelepasan plasmid ke dalam sitoplasma.

Sistem pengiriman gen berbasis peptida memiliki potensi untuk mengatasi

barrier pengiriman gen ekstraseluler dan intraseluler menggunakan urutan peptida
tunggal. Namun, mereka melakukan pengikatan protein plasma yang tidak spesifik dan
diambil oleh sistem retikuloendotelial. Di sini, PEGilasi ditunjukkan sebagai strategi
yang efektif untuk meningkatkan waktu sirkulasi darah kompleks. Tantangan dalam
sistem pengiriman gen berbasis peptida adalah proteasom sitosol, yang mendegradasi
protein yang tidak dibutuhkan atau rusak oleh proteolisis. Proteasom mengganggu
kestabilan dan menurunkan kondensat DNA / peptida dan mencegah transfer gen yang
efektif. Pemberian bersama proteasome inhibitor adalah strategi paling efektif untuk
mengatasi masalah ini.

Polimer

Polimer kationik sintetik dan alami merupakan kategori lain dari pembawa gen.
Polyethyleneimine (PEI) telah menjadi polimer kationik yang paling banyak digunakan
untuk pengiriman gen dalam dua dekade terakhir. Namun, PEI, terutama PEI dengan
berat molekul tinggi (> 25 kD), sangat sitotoksik. PEI menginduksi gangguan membran
sel yang menyebabkan kematian sel nekrotik segera dan gangguan membran
mitokondria setelah internalisasi yang mengarah ke apoptosis. PEI berikatan dengan
komponen darah, matriks ekstraseluler, dan sel yang tidak ditargetkan setelah injeksi
intravena. Modifikasi kimia PEI diusulkan untuk mengatasi masalah ini, misalnya
cholesteryl chloroformate siap membentuk misel (10-100 nm) dalam larutan air ketika
terkonjugasi menjadi PEI bercabang. Lipopolymer baru ini menunjukkan penurunan
toksisitas dan efisiensi transfer gen yang optimal.

Pencampuran sederhana DNA plasmid dan polimer PEG-PLL menghasilkan

pembentukan misel poliion kompleks (PIC) spontan yang ditandai dengan ukuran
partikel kecil, stabilitas koloid yang sangat baik, dan kemampuan transfer gen optimal
dalam media yang mengandung serum. Namun, harus dicatat bahwa misel berada
dalam keadaan termodinamik yang tidak stabil. Untuk mengatasi masalah ini, misel
ikatan silang disiapkan menggunakan PEG-b-PLL yang dimodifikasi tiol melalui
pembentukan ikatan disulfida di area inti. Misel-misel yang saling bersilangan ini lebih
stabil dalam darah selama sirkulasi dan ikatan disulfi diasumsikan dapat terbelah
dalam sitoplasma.

■ Penggunaan Klinis Vektor Nonviral

Secara kolektif, studi-studi klinis ini menyediakan "prinsip bukti" untuk terapi
gen nonviral tetapi juga menyoroti perlunya pengembangan formulasi dengan
peningkatan efisiensi transfeksi dan kemanjuran terapeutik. Juga harus disebutkan
bahwa sebagian besar uji coba ini tidak terkontrol, label terbuka, desain fase I terutama
menyelidiki keselamatan dan kelayakan. Kemungkinan efek plasebo yang kuat tidak
dapat diabaikan dalam uji coba ini. Hasil dari studi ini harus ditafsirkan dengan hati-hati
dan hanya dapat dinilai dengan melakukan uji coba fase II / III lebih lanjut.
TERAPI GEN BERBASIS SEL PUNCA

Terapi gen berbasis sel punca adalah proses multistep, dimulai dengan isolasi
sel punca dari pasien. Langkah ini diikuti oleh ekspansi sel punca dan transduksi ex
vivo dengan vektor transfer gen. Akhirnya, sel-sel punca yang ditransfusikan kembali
diinfuskan ke pasien untuk mengobati penyakit tertentu.

TERAPI SEL PUNCA

Sel punca paling awal dalam kehidupan manusia adalah embryonic stem cells
(ESC), yang berasal dari massa sel dalam blastokista dan mampu berdiferensiasi
menjadi semua turunan dari tiga lapisan benih utama: ektoderm, endoderm, dan
mesoderm. Selain ESC, yang hanya dapat diisolasi dari embrio awal, ada jenis sel
punca lain di jaringan dewasa semua mamalia tua yang disebut sel punca dewasa. Sel
punca dewasa memiliki kapasitas pembaruan diri yang tidak terbatas dan potensi
diferensiasi yang lebih terbatas. Sel punca dewasa yang paling terkenal adalah sel
punca hematopoietic stem cells (HSC), yang memunculkan semua tipe sel darah dan
garis keturunan limfoid. Sumsum tulang juga mengandung populasi sel punca dewasa
yang bernama mesenchymal stem cells (MSC).

Injeksi langsung dari ESC yang sangat berpotensi majemuk ke dalam organ
ektopik sering menimbulkan teratoma, tumor jinak yang mengandung turunan dari
ketiga lapisan benih. MSC kurang potensial untuk menginduksi teratoma atau
transformasi ganas lainnya karena mereka hanya memiliki potensi diferensiasi
terbatas. Dibandingkan dengan sel punca dewasa lainnya seperti HSC, sel punca
mammae, atau sel punca saraf, MSC memiliki efek trofik dan sifat imunomodulator
yang dikarakterisasi dengan baik, menjadikannya kandidat yang baik dalam mengobati
penyakit degeneratif. Sebagai mediator trofik, MSC menghasilkan faktor bioaktif yang
menghambat apoptosis, mempromosikan angiogenesis, dan merangsang mitosis dan
diferensiasi menjadi sel reparatif spesifik jaringan.

Ada dua arah utama terapi gen berbasis sel punca: (1) sel punca digunakan
sebagai sarana pengiriman gen untuk mengekspresikan gen terapeutik di lokasi target
dan (2) sel punca diprogram ulang atau ditransdifferensiasikan dengan modifikasi
genetik untuk mengisi kembali sel atau jaringan cacat (obat regeneratif).

SEL PUNCA SEBAGAI KENDARAAN PENGIRIMAN GEN

Karena kasus terapi gen pertama yang berhasil di mana gen ADA dimasukkan
ke dalam limfosit T autologus untuk mengobati ADA yang mengalami defisiensi SCID,
beberapa kelompok memiliki tujuan ambisius untuk memperbaiki kekurangan ADA
secara permanen dengan memasukkan gen ADA ke dalam sel-sel progenitor
hematopoietik dari sumsum tulang dan darah tali pusat.

Terapi gen tradisional berfokus pada pengenalan materi genetik dalam sel
dewasa untuk mengobati penyakit genetik bawaan, sedangkan terapi gen berbasis sel
punca dapat mewakili pengobatan permanen untuk penyakit genetik ini.

SEL PUNCA SEBAGAI OBAT REGENERATIF

Sel punca dapat diprogram ulang atau ditransdiferensiasikan dengan modifikasi

genetik untuk mengisi sel atau jaringan yang rusak. Vektor virus secara efisien
mentransduksi sel punca dan mengarahkan diferensiasinya. Sel-sel punca yang
diturunkan dari otot direkayasa secara genetik dengan retrovirus untuk
mengekspresikan bone morphogenetic protein-4 (BMP4) dan VEGF mempromosikan
pembentukan tulang dan penyembuhan tulang dalam model tikus. MSC yang
direkayasa secara genetik dengan adenovirus untuk mengekspresi bone
morphogenetic protein-2 (BMP2) secara berlebihan akan meningkatkan pembentukan
tulang ektopik pada tikus. Dari penelitian ini orang dapat menyimpulkan bahwa
cangkok tulang manusia yang layak dapat direkayasa dalam kondisi laboratorium
dengan menggunakan MSC manusia dan sistem bioreaktor perancah "biomimetik".

Vektor virus adalah alat yang paling populer untuk mengarahkan diferensiasi
sel punca dalam pengobatan regeneratif. Namun, karena risiko mutagenesis insersi
dan generasi replikasi virus yang kompeten, vektor nonviral juga dipelajari dalam terapi
gen berbasis sel.

Perlu dicatat bahwa sebagian besar terapi gen berbasis sel punca, terutama
yang menggunakan retrovirus atau lentivirus sebagai vektor pengiriman gen, tidak
menyediakan mekanisme untuk mematikan ekspresi gen terapeutik ketika ekspresi
lebih lanjut tidak diperlukan atau untuk membersihkan sel-sel punca proliferatif ketika
jaringan yang rusak sepenuhnya sembuh. Untuk membersihkan kelebihan sel punca
ketika jaringan yang rusak sembuh sepenuhnya, sel punca embrionik manusia yang
direkayasa secara genetika untuk mengekspresikan gen “bunuh diri” dapat dihilangkan
secara in vivo dengan pemberian obat gansiklovir yang disetujui FDA.

SASARAN PENYAKIT BAGI TERAPI GEN

Pengobatan penyakit monogenetik, penyakit kardiovaskular, dan penyakit

menular masing-masing mengambil ~ 10% dari jumlah uji klinis aktif. Pengobatan
penyakit neurologis, yang telah berkembang sangat cepat dalam 5 tahun terakhir
adalah tujuan dari 2% uji klinis aktif. Saat ini, uji coba terapi gen terutama dilakukan di
Amerika Serikat (64% dari semua uji coba), Inggris (11%), dan Jerman (4,5%).

TERAPI GEN KANKER

Mayoritas uji klinis terapi gen saat ini dikhususkan untuk mengobati kanker.
Ada dua manfaat potensial menggunakan terapi gen untuk mengobati kanker: (a)
perawatan berbasis gen dapat menyerang kanker yang ada pada tingkat molekuler,
menghilangkan kebutuhan akan obat-obatan, radiasi, atau operasi dan (b)
mengidentifikasi gen kerentanan kanker pada individu atau keluarga mungkin memiliki
dampak signifikan dalam mencegah penyakit sebelum terjadi. Strategi untuk mencapai
tujuan-tujuan ini termasuk (a) koreksi mutasi genetik yang berkontribusi pada fenotip
ganas dengan mengganti gen yang hilang atau mengubah gen cacat dengan gen
sehat, (b) peningkatan respon imun pasien terhadap kanker (imunoterapi), (c)
penyisipan gen ke dalam sel kanker untuk membuatnya lebih sensitif terhadap
kemoterapi dan radioterapi konvensional atau perawatan lain, (d) pengenalan "Suicide
genes" ke dalam sel kanker pasien yang secara enzimatik dapat mengaktifkan prodrug
dalam sel-sel ini untuk menghancurkannya, dan ( e) langsung membunuh tumor
melalui virus oncolytic.

■ Koreksi Mutasi Genetik

Dalam pendekatan ini, terapi gen digunakan untuk memperbaiki mutasi genetik
yang berkontribusi pada fenotip ganas dengan mengganti gen yang hilang atau
menghilangkan gen cacat. Memahami kanker pada tingkat molekuler adalah dasar
untuk koreksi gen dalam terapi kanker. Inaktivasi atau aktivasi gen tertentu dapat
berkontribusi pada pertumbuhan tumor. Meskipun proses kompleks perkembangan
dan pertumbuhan tumor membatasi kegunaan strategi ini, sekitar 12% uji klinis terapi
gen kanker melibatkan ekspresi berlebih dari gen penekan tumor seperti p53, MDA-7,
dan ARF. Mutasi pada gen p53 paling sering terlihat pada spektrum tumor yang luas.
Pengiriman dan ekspresi gen penekan tumor p53 tipe liar mencegah pertumbuhan sel
kanker manusia dalam kultur, menyebabkan regresi tumor manusia pada tikus, atau
sensitisasi tumor yang ada pada efek terapi kemoterapi konvensional dan radioterapi.

■ Imunoterapi

Dalam pendekatan ini, terapi gen digunakan untuk merangsang kemampuan

alami tubuh untuk menyerang sel kanker. Dalam satu penelitian, limfosit darah perifer
autologis yang direkayasa secara genetika dengan vektor retroviral yang
mengkodekan reseptor sel T spesifik (TCR) melanoma diberikan kepada pasien
dengan melanoma metastasis. Limfosit T yang direkayasa secara genetika kemudian
mengenali antigen pada permukaan sel tumor melalui TCR dan membunuh sel tumor.
Dalam studi klinis lainnya, ekspresi sitokin proinflamasi (IL-2, IL-4, dan IL-12), molekul
co-stimulator (HLA-B7 LFA-3), atau antigen spesifik tumor (musin-1 dan CEA) untuk
merangsang respon imun antitumor juga telah diuji

■ Sensitisasi Tumor

Dalam pendekatan ini, gen dimasukkan ke dalam sel kanker untuk

membuatnya lebih sensitif terhadap kemoterapi konvensional dan radioterapi atau
perawatan lain. Dalam penelitian lain, mekanisme RNAi digunakan untuk mengatasi
multidrug resistance (MDR) dalam sel kanker. MDR, yang biasanya mewakili ekspresi
berlebih dari P glikoprotein, pengangkut eflux obat pada membran sel kanker,
merupakan hambatan yang sering terjadi untuk kemoterapi yang berhasil.
Penghambatan gen MDR1 siRNA atau vektor yang dimediasi secara sintetik secara
luas dilaporkan berhasil mengurangi kemoresistensi jenis kanker tertentu

■ Terapi Enzim-Prodrug yang diarahkan Gen

Pada langkah pertama prosedur ini, gen untuk enzim eksogen dikirim dan
diekspresikan dalam sel tumor. Selanjutnya, prodrug diberikan dan dikonversi menjadi
obat aktif (metabolit toksik) oleh enzim asing yang diekspresikan di dalam atau di
permukaan sel tumor. Suicide genes biasanya berasal dari virus atau prokariotik tanpa
homolog manusia. Namun, ini bukan persyaratan mutlak asalkan prodrug tidak
diaktifkan pada tingkat signifikan oleh enzim seluler asli. Ada beberapa varian terapi
diarahkan-enzim prodrug gen. Virus herpes simpleks virus-timidin kinase (HSV-tk) /
gansiklovir, sistem sitosin deaminase / 5-fluorositosin, sistem nitroreduktase / CB1954,
dan sistem G2 / CMDA karboksipeptidase adalah sistem yang paling populer. Cerepro,
obat gen yang dikembangkan oleh Ark Therapeutics Group PLC, telah diberikan status
obat yatim piatu oleh European Medicines Agency dan FDA. Cerepro adalah
adenovirus yang mengandung herpes simpleks tipe-1 timidin kinase transgen untuk
mengobati glioma ganas bersama dengan gansiklovir.

■ Virus Onkolitik (Viroterapi)

Dalam pendekatan ini, virus oncolytic secara langsung dimasukkan ke dalam

tumor untuk menginduksi kematian sel melalui replikasi virus, ekspresi protein
sitotoksik, dan lisis sel. Virus vaksin, herpes simpleks tipe-I (HSV), virus, virus penyakit
Newcastle, virus polio, dan virus sering dipilih untuk aplikasi ini karena mereka secara
alami menargetkan kanker dan mengandung genom yang dapat dengan mudah
dimanipulasi. Pembersihan virus oleh imunitas seluler dan antibodi penawar yang
sudah ada sebelumnya di sebagian besar populasi juga berdampak negatif terhadap
keefektifan viroterapi. Adenovirus ini mengandung penghapusan di wilayah E1B 55 K
dan hanya bereplikasi dalam sel kanker yang kekurangan p53.

PENYAKIT MONOGENETIK

Tujuan utama terapi gen untuk gangguan monogenetik adalah mengganti gen
yang cacat dengan salinan yang baik untuk mengembalikan fungsi normal dan
membalikkan proses penyakit secara permanen. Hingga saat ini, kombinasi sindrom
imunodefisiensi adalah satu-satunya kelompok penyakit di mana terapi gen telah
bermakna secara klinis manfaat terapinya.

Masalah yang dapat mencegah keberhasilan transfer gen pada penyakit

monogenetik sampai saat ini ialah (a) kurangnya teknologi pengiriman gen yang cocok,
(b) interaksi yang tidak baik antara inang dan vektor transfer gen, (c) biologi dan
patologi kompleks penyakit monogenetik dan organ target, dan (d) kurangnya langkah-
langkah yang relevan untuk menilai efikasi klinis transfer gen. Tantangan terbesar yang
masih ada pada pengobatan penyakit monogenetik adalah untuk menginduksi ekspresi
gen dengan baik untuk memperbaiki fenotipe klinis tanpa presipitasi respon imun inang
dan meminimalkan risiko mutagenesis insersional untuk mengintegrasikan vektor
dalam membagi target seluler.

PENYAKIT KARDIOVASKULAR

Pemahaman mekanisme molekuler penyakit kardiovaskular telah menemukan

sejumlah besar gen yang bisa berfungsi sebagai target potensial untuk terapi
molekuler. Misalnya, ekspresi berlebih dari gen yang terlibat dalam vasodilatasi seperti
endotel nitric oxide synthase (eNOS) dan heme oxygenase-1 (HO-1) atau
penghambatan molekul yang terlibat dalam vasokonstriksi (angiotensin converting
enzyme (ACE), angiotensinogen (AGT)) telah menurunkan tekanan darah pada model
hewan yang hipertensi. Kebanyakan uji klinis pada penyakit kardiovaskular dirancang
untuk mengobati iskemia koroner dan perifer. Ekspresi berlebihan faktor-faktor
proangiogenik seperti sebagai faktor pertumbuhan endotel vaskular (VEGF), faktor
pertumbuhan fibroblast (FGF), dan faktor pertumbuhan hepatosit (HGF) telah efektif
pada miokard dan iskemia perifer dalam studi praklinis.
PENYAKIT INFEKSI

Transfer gen untuk AIDS adalah aplikasi utama dikategori ini. Banyak uji coba
terapi gen untuk AIDS melibatkan pemindahan materi genetik secara ex vivo ke sel T
otonom menggunakan inaktivasi sendiri atau replikasi vektor virus untuk meningkatkan
sistem kekebalan tubuh pasien. Uji coba lain menggunakan ekspresi yang berlebih dari
inhibitor HIV seperti RevM10 untuk meningkatkan kelangsungan hidup sel T CD4 +
pada orang yang terinfeksi HIV.

Pencapaian paling penting dalam studi terapi gen untuk mengobati penyakit
infeksi adalah pengembangan vaksinasi DNA, suatu teknik untuk melindungi host dari
penyakit dengan memproduksi respon imunologis melalui suntikan virus hasil rekayasa
genetika DNA. Studi klinis penggunaan vaksin DNA untuk penyakit infeksi lainnya yang
disebabkan oleh virus hepatitis B (HBV), virus influenza, dan virus Ebola juga
dilaporkan. Saat ini, PENNVAXTM, sebuah produk DNA vaksin untuk HIV yang
dikembangkan oleh Inovio Pharmaceuticals, sedang dalam studi klinis fase I.

PENYAKIT NEUROLOGIS

Dua penyakit saraf yang paling umum ditargetkan oleh terapi gen adalah
penyakit Alzheimer dan penyakit Parkinson. Pada tahun 2005, fase I percobaan ex
vivo pengiriman gen faktor pertumbuhan syaraf (NGF) pada delapan individu dengan
penyakit Alzheimer ringan. Autologous fibroblasts diperoleh dari biopsi kulit kecil pada
setiap individu yang secara genetik telah dimodifikasi untuk memproduksi dan
mengeluarkan NGF menggunakan vektor retroviral dan ditanam kembali pada otak
depan. Hasil penelitian menunjukkan perbaikan dalam tingkat penurunan kognitif,
meningkatkan konsentrasi 18-fluorodeoxyglucose (PET imaging) di kortikal, dan
respon kuat pada pertumbuhan saraf ke NGF.

ISU REGULASI PRODUK TERAPI GEN

Di Amerika Serikat dua organisasi dalam United States Department of Health

and Human Services (DHHS), Office for Human Research Protections (OHRP) dan
Food and Drug Administration (FDA), memiliki kewenangan khusus yang dijelaskan
dalam Code of Federal Regulations (CFR ). OHRP mengamanatkan setiap uji klinis
terapi gen yang melibatkan subyek manusia yang ditinjau, disetujui, dan dipantau oleh
Institutional Review Board (IRB) di setiap situs investigasi. FDA Center for Biologics
Evaluation and Research (CBER) mengawasi uji klinis terapi gen manusia yang
dilakukan oleh produsen. Setiap produk terapi gen harus diuji secara ekstensif untuk
memenuhi persyaratan FDA untuk keamanan dan keampuhan sebelum persetujuan
untuk pemasaran. Semua terapi gen protokol uji klinis harus dilakukan di bawah
Investigational New Drug (IND) . Peraturan yang berkaitan dengan proses ini muncul
dalam Title 21 dari Code of Federal Regulations (CFR), Bagian 312. organisasi DHHS
lain, National Institutes of Health (NIH) mengawasi studi terapi gen dan uji klinis yang
dilakukan oleh peneliti yang didanai pemerintah federal. NIH memonitor kemajuan
ilmiah dalam penelitian genetika manusia melalui Office of Biotechnology Activities
(OBA). Di OBA, Recombinant DNA Advisory Committee (RAC) didirikan pada tahun
1974 sebagai tanggapan atas keprihatinan masyarakat tentang keamanan
memanipulasi materi genetik melalui penggunaan teknik DNA rekombinan. Setiap
penelitian transfer gen manusia menerima dana NIH harus terdaftar OBA dan ditinjau
oleh RAC. Tanggung jawab lain dari RAC adalah untuk bekerja sama dengan
Institutional Biosafety Committees (IBC) untuk mengawasi penelitian DNA rekombinan
di setiap situs investigasi.