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TÉCNICAS DE COAGULAÇÃO

INTRODUÇÃO
As provas de coagulação exigem cuidados de ordem técnica para que os resultados obtidos
sejam os mais exatos e reprodutíveis possíveis:
a) a lesão tecidual decorrente da punção venosa deve ser mínima;
b) as seringas e os frascos de acondicionamento de sangue e plasma devem ser
plásticos ou siliconizados;
c) os coagulantes de escolha são o CITRATO DE SÓDIO usado na proporção de
uma parte de anticoagulante para nove partes de sangue;
d) o plasma deve ser separado em até 30 minutos após a coleta e, dependendo da
prova a ser executada, pode ser congelado por 4 horas, no máximo;
e) realizar os testes em duplicata e em paralelo, com um controle normal de
plasma.

1. PROVA DO LAÇO (Fragilidade Capilar)

PRINCÍPIO
A Prova do Laço ou Prova de Fragilidade Capilar, é um teste que procura avaliar a
capacidade dos vasos de resistirem a uma pressão. Em última análise, a prova avalia uma
das funções pertinentes à parte vascular da hemostasia.

TÉCNICA
a) delimitar uma área de aproximadamente 5 cm2 no antebraço do paciente,
marcando-se os sinais e manchas existentes (pintas, petéquias existentes, etc.);
b) determinar a pressão arterial do paciente (máxima e mínima) e manter o
manguito do aparelho no valor médio entre as pressões máxima e mínima, desde
que esse valor não ultrapasse a 100 mm de Hg. Caso isso ocorra, a pressão deve
ser mantida em 100 mm de Hg;
c) o manguito do aparelho deve ser mantido na pressão obtida em b), por 5
minutos;
d) retirar o aparelho e contar as petéquias (apresentam-se em forma de pontos
vermelhos-rutilante);
e) a prova é considerada POSITIVA quando forem contadas mais de 4 petéquias na
área delimitada
2. TEMPO DE SANGRAMENTO (Método de Duke)
PRINCÍPIO

O Tempo de Sangramento (T.S.) avalia a capacidade de se processar a hemostasia


após o vaso ter sido lesado. O T.S. depende da função plaquetária e da integridade
funcional do vaso. O método mais comumente utilizado é o de Duke, em que é feita uma
incisão, de tamanho padronizado, medindo-se a seguir o tempo decorrido até que cessar o
sangramento, intervindo apenas os fatores plaquetário e vascular.

TÉCNICA
a) realizar assepsia do lóbulo da orelha (pode-se usar também a polpa digital) com
algodão embebido em álcool e deixar evaporar;
b) com auxílio de uma lanceta específica e de um só golpe, fazer uma incisão local,
com cerca de 2 mm de profundidade; disparar o cronômetro;
c) a cada 30 segundos recolher a gota de sangue em papel de filtro (tendo o
cuidado de que o mesmo não toque o lóbulo ou a polpa), até que a última gota
deixe apenas um sinal puntiforme no papel;
d) anotar o tempo decorrido entre a primeira e a última gota recolhidas.

Valor Normal: de 1 a 3 minutos.

INTERPRETAÇÃO
O Tempo de Sangramento é um teste indicativo de distúrbios plaquetários ( em
relação ao número à funcionalidade das mesmas) e de alterações da integridade vascular.
As alterações mais evidentes do Tempo de Sangramento são encontradas nas
púrpuras trombocitopênicas e trombopáticas.
3. TEMPO DE COAGULAÇÃO DO SANGUE TOTAL
(Método de Lee-White)

PRINCÍPIO

O Tempo de Coagulação (T.C.) mede o tempo necessário para que o sangue


coagule “in vitro”.

TÉCNICA
a) proceder à punção venosa, procurando lesar os tecidos, o mínimo possível ;
b) disparar o cronômetro, assim que o sangue entrar na seringa;
c) separar 3 tubos de ensaio (10 x 120 mm), colocar 1 ml de sangue em cada um e
levá-los imediatamente em banho à 37ºC;
d) 3 minutos após a coleta, iniciar a observação do tubo 1, inclinando-o
suavemente; repetir essa observação a cada 30 segundos até que o sangue
coagule. Marcar o tempo transcorrido desde a coleta até a formação do coágulo;
e) proceder do mesmo modo com os tubos 2 e 3;
f) o Tempo de Coagulação será o obtido pela média dos tempos encontrados nos
3 tubos,

Valor Normal: de 4 a 9 minutos.

INTERPRETAÇÃO
O Tempo de Coagulação é uma prova pouco sensível para detectarem-se alterações
no sistema global da coagulação.
Um prolongamento do Tempo de Coagulação pode ser causado por
Hipofibrinogenemia, por deficiência de alguns dos fatores do sistema intrínseco e pela
presença de anticoagulantes circulantes.
O T.C. é largamente empregado como método de controle de terapia com
anticoagulantes, especialmente no caso da heparina.

4. RETRAÇÃO DO COÁGULO (Método de Mac-Farlane)


PRINCÍPIO
Após a coagulação do sangue, o coágulo formado retrai-se ou mais precisamente,
retrai-se a rede de fibrina, retendo os elementos figurados do sangue e liberando a parte
líquida, o soro. A retração do coágulo é devida à liberação de substâncias, pelas plaquetas
localizadas nos pontos de intersecção das malhas da rede de fibrina, O volume de soro
liberado, é expresso percentualmente em relação ao volume inicial do sangue que se deixou
coagular. A retração de coágulo está relacionada diretamente ao número e à funcionalidade
das plaquetas e inversamente proporcional ao grau de anemia.

TÉCNICA

a) transferir cerca de 5 ml de sangue, sem anticoagulantes para um tubo cônico


graduado, cujas paredes foram previamente umedecidas com solução
fisiológica;
b) fechar o tubo com uma rolha provida de um fio de arame com a ponta retorcida
“em anzol”;
c) após a coagulação do sangue, colocar o tubo em banho à 37ºC por 1 hora;
d) ler, a seguir, o volume total ( coágulo e soro). Com o auxílio do fio de arame,
retirar cuidadosamente o coágulo retraído; ler o volume final do soro.

CÁLCULO:

% de retração = Vol. soro x Hematócrito do paciente


Vol. total x Hematócrito normal (*)
(*)
Consultar tabela.

Valor Normal: de 45 a 55%


5. TEMPO DE PROTROMBINA
(Tempo de Quick de um estágio)
O teste do Tempo de Protrombina avalia a atividade coagulante do sistema
extrínseco, incluindo a protrombina (ou seja, todo o “complexo da protrombina”) e o
fibrinogênio.

TÉCNICA
a) a um tubo de 12 x 75 mm, previamente mantido a 37ºC, pipetar 0,1 ml de
tromboplastina e 0,1 ml de plasma (a tromboplastina é ativada, mantendo-se à
37ºC por 5 minutos);
b) homogeneizar delicadamente, deixando por cerca de 20 segundos no banho a
37ºC;
c) adicionar 0,1 ml de CaCl2 M/40, disparando simultaneamente o cronômetro;
d) deixar em repouso cerca de 8 segundos e a seguir iniciar a observação do
desenvolvimento da rede de fibrina (indica o ponto final da retração).

Valor Normal: de 10 a 14 segundos ( 70 a 100% de atividade).

OBSERVAÇÃO
Pode-se usar, alternativamente, tromboplastina a que foi adicionado previamente
cálcio e, nesse caso, colocam-se 0,2 ml de tromboplastina-cálcica e 0,1 ml do plasma.
Os reagentes (Tromboplastina, CaCl2) e tubos, devem estar à 37ºC.

INTERPRETAÇÃO
O reagente tromboplástico tissular utilizado no teste não contém os fatores V, VII e
X, que devem ser fornecidos pelo plasma do paciente, juntamente com a protrombina e o
fibrinogênio. Assim, a deficiência ou ausência de qualquer um desses fatores, resulta em
um prolongamento do Tempo de Protrombina.
Admitindo-se que o fibrinogênio esteja em concentração normal, o prolongamento
do Tempo de Protrombina deve-se à deficiência de alguns dos fatores do complexo da
Protrombina,
O Tempo de Protrombina pode encontrar-se alongado nos seguintes casos: presença
de anticoagulantes circulantes, na deficiência de vitamina K e nas hepatopatias de um modo
geral.
5.1 ATIVIDADE PROTROMBÍNICA
A atividade protrombínica do material é avaliada através do tempo (em segundos) e
de uma curva de atividade (previamente preparada para cada lote da tromboplastina
utilizada).

PREPARO DA CURVA DE ATIVIDADE


Faz-se uma mistura (pool) de pelo menos 3 plasmas normais obtidos do mesmo
modo; distribui-se em 10 tubos da seguinte maneira:

Tubos = 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
“Pool” plasma (ml) = 1,0 0,9 0,8 0,7 0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1
Sol. Fisiológica (ml) = 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8 0,9 1,0
Atividade (%) = 100 90 80 70 60 50 40 30 20 10

Com a mesma tromboplastina determina-se o Tempo de Protrombina de cada um


dos tubos; o tempo do tubo l corresponde à 100% de atividade (*).

Valor Normal: 70 a 100% de atividade.

Obs.: O sangue não deve ter mais do que 4 horas de coleta (fatores, como o V,
degradam-se, mesmo mantendo-se o sangue em congelador).

(*) Uma preparação de tromboplastina é considerada de boa qualidade, quando o seu 100%
de atividade, frente a um “pool” de plasmas normais, corresponder a um Tempo de
Protrombina entre 12 e 14 segundos.
6. TEMPO DE RECALCIFICAÇÃO DO PLASMA (T.R.P.)
PRINCÍPIO
A adição de íons cálcio ao plasma (ou sangue) citratado, desencadeia o processo da
coagulação, visto que, com exceção dos íons cálcio (complexados pelo citrato), o plasma
deve conter todos os fatores plasmáticos da coagulação.
O teste avalia todo o sistema de coagulação, principalmente o sistema intrínseco.

TÉCNICA

a) a um tubo mantido previamente a 37 C adicionar 0,2 ml de plasma e 0,2 ml de


CaCl 2 M/40. Disparar o cronômetro, homogenizar;
b) deixar em repouso em banho à 37 C, por 30 segundos e a seguir iniciar a
observação da formação de fibrina, inclinando-se levemente o tubo;
c) marcar o tempo decorrido até a formação da fibrina.

Valor Normal: 80 a 120 segundos.

INTERPRETAÇÃO
O TRP encontra-se alterado nos casos de deficiência de um ou mais dos fatores V,
VIII, IX, X, XI e XII, avaliando ainda a Protrombina (II), o Fibrinogênio (I) e a presença
de anticoagulantes.
O resultado é altamente influenciável pelo número de plaquetas existentes no
plasma
7. TEMPO DE CEFALINA OU TEMPO DE TROMBOPLASTINA
PARCIAL (T.T.P.)

Trata-se de uma prova de recalcificação na qual, a fim de eliminar-se a influências das


plaquetas (visto que o número das mesmas interfere no TRP), adiciona-se uma quantidade
ótima de fosfolipídeos ( cefalina ou tromboplastina, por ex.).

Técnica

a. pipetar para um tubo de ensaio, 0,l ml de plasma (pobre em plaquetas) e 0,l ml de


cefalina. Homogenizar;
b. incubar por l20 segundos em banho à 37 C, agitando a mistura a cada l0
segundos;
c. adicionar 0,l ml de CaCl 2 M / 40 ; disparar o cronômetro:
d. marcar o tempo de coagulação ( tempo de formação da fibrina).
Valor normal: 40 a 60 segundos.

INTERPRETAÇÃO

O TTPA é uma prova sensível para avaliar alterações no processo da coagulação.


O alongamento do TTPA, é indicativo de alteração dos fatores V, VII, IX, X, II e I,
ou ainda, de quando existirem anticoagulantes circulantes.
8. TEMPO DE TROMBOPLASTINAPARCIAL ATIVADA
(TTPA) OU TEMPO DE KAOLIN-CEFALINA
O TTPA também consiste em uma prova de recalcificação em que as variáveis
constituídas pelo número de plaquetas e pelo grau de ativação dos fatores XI e XII são
eliminadas através da adição de um fosfolípede e de um ativador (celite ou caolin, por
exemplo). Com a adição dessas substâncias, conseguem-se resultados mais reprodutíveis e
uma sensibilidade maior do que nas determinações do T.R.P. e T.T.P.

TÉCNICA
a) em um tubo de ensaio, previamente aquecido a 37ºC, pipetar 1 ml de cefalina;
incubar a 37ºC por 1 minuto;
b) a seguir, adicionar 0,1 ml de caolin; após 2 minutos recalcificar com 0,1 ml de
CaCl2 e disparar o cronômetro;
c) marcar o tempo de formação de fibrina;
d) colocar 0,1 ml de plasma a um tubo mantido previamente a 37º C. Incubar por 1
minuto.
e) adicionar 0,2 ml da mistura cefalina-caolin; incubar por 3 minutos;
f) adicionar 0,1 ml de CaCl2 M / 40; disparar o cronômetro;
g) marcar o tempo de formação da fibrina.

INTERPRETAÇÃO
O TTPA é uma prova sensível para avaliar alterações no processo de coagulação.
O alongamento do TTPA é indicativo de alteração dos fatores V, VII, IX, X, II e I,
ou ainda, de quando existirem anticoagulantes circulantes.
9. FIBRINOGÊNIO (Método de Ratnoff-Menzie)
PRINCÍPIO
O fibrinogênio do plasma pode ser separado das demais proteínas plasmáticas pela
sua transformação em fibrina: submete-se a fibrina à digestão em meio alcalino, havendo
liberação de aminoácidos, entre os quais, a tirosina. Esta pode ser dosada através da medida
de intensidade da cor azul que se desenvolve com o reativo de Folin-Ciocalteau.

TÉCNICA
a) colocar em tubo de ensaio de 20 x 200mm;
1- 10 ml de solução fisiológica
2- 0,5 ml de plasma
3- 0,05 ml de trombina (25 U/ml)
4- bastão de vidro;
b) girar o bastão mergulhado na solução. Utilizando-se a trombina, a coagulação se
processa em 2 ou 3 minutos. Com o decorrer da coagulação, os fios de fibrina
aderem ao bastão.
Embora a reação possa se desenvolver à temperatura ambiente, a mesma se
processa mais eficientemente quando realizada à 37ºC; assim, deve-se manter o
tubo da reação em banho à 37ºC, por 30 minutos, girando-se o bastão a cada 5-
10 minutos, de tal forma que a fibrina se enovele no bastão.
c) desprezar a solução contida no tubo e lavá-lo 3 vezes com solução fisiológica
para eliminar qualquer interferente. O bastão deve ser retirado e lavado 3 vezes
com jatos de solução fisiológica; o coágulo aderido deve ser comprimido
cuidadosamente em papel de filtro, após cada lavagem.
d) recolocar o bastão no tubo, com a fibrina aderida ; adicionar ao tubo 1,0 ml de
NaOH a 10%. Colocar o tubo em Banho-Maria por 10 minutos, tomando-se o
cuidado de cobrí-lo com papel alumínio, para evitar evaporação.
e) após o resfriamento do tubo em temperatura ambiente, adicionar sucessivamente
e na ordem:
1- 7,0 ml de H2O destilada
2- 3,0 ml de Na2CO3 a 20%. Agitar
3- 1,0 ml de reativo de Folin (diluído 1/3 em H2O). Agitar;
f) deixar em repouso à temperatura ambiente por 30 minutos. Ler em
espectrofotômetro à 650 nm contra um branco, preparando da seguinte maneira:

Branco:
- 1,0 ml de NaOH 10%
- 7,0 ml de água destilada
- 2,0 ml deNa2CO3 20%
- agitar
- 1,0 ml de Reativo de Folin
Deixar em repouso à temperatura ambiente por 30 minutos;
g) a D.O. da cor desenvolvida no sistema a dosar, é diretamente proporcional à
concentração de fibrinogênio ou tirosina, até a quantidade de 0,35 mg de tirosina
(caso a intensidade da cor obtida for superior àquela obtida com 0,35 mg, diluir
a solução e fazer o cálculo proporcional);
h) a quantidade de tirosina correspondente à leitura é determinada em uma curva
padrão de tirosina. Para a conversão da quantidade de tirosina em fibrina,
multiplica-se o valor obtido, pela constante que é a quantidade de tirosina
contida na fibrina, em função do teor de Nitrogênio. Faz-se o cálculo de mg% de
fibrinogênio em função da quantidade de plasma usada para a dosagem (ex.: se
usarmos 0,5 ml de plasma, multiplicamos por 200).

Valor Normal: 165 a 485 mg%

Padrão
1- preparar, a partir da solução estoque de tirosina (20 mg% em HCl 0,1N), uma
solução de uso ¼ (uma parte de solução padrão e 3 partes de água destilada);
2- pipetar para um tubo:
- 1,0 ml da solução de tirosina ¼
- 6,0 ml de água destilada
- 1 ml de NaOH 10%
- 3,0 ml de Na2CO3 20%
- agitar
- 1 ml de Folin
- agitar.
RECOMENDAÇÕES DOS LIMITES TERAPÊUTICOS DA
ANTICOAGULAÇÃO ORAL (8)

INR
INDICAÇÃO VALOR ALVO VALORES LIMITES

Profilaxia do tromboelismo 2,5 2-3


venoso (cirurgia de alto risco)

Tratamento de trombose venosa 3 2-4


profunda – prevenção da embolia
em pacientes com fibrilação atrial,
doença cardíaca valvular ou
válvulas biológicas. Profilaxia de
tromboelismo venoso (cirurgia de
quadril)

Embolismo sistêmico recorrente. 3,5 3 - 4, 5


Prótese valvular cardíaca.