LAPORAN RESMI

PRAKTIKUM BIOLOGI SEL MOLEKULER

PERCOBAAN I

MERANCANG PROBE

Pengampu : Drs. Ibrahim Arifin, M.Sc., Apt

Asisten Dosen : Avilia Ayu Setyawati

Hari ,tanggal praktikum : Sabtu, 21 Maret 2019

Disusun Oleh :

Nama : Putri Irmawati

NIM : 175010051

Kelas / Golongan : A / II

FAKULTAS FARMASI

UNIVERSITAS WAHID HASYIM

SEMARANG

2019
I. TUJUAN PRAKTIKUM

1. Merancang dan menganalisis probe yang akan digunakan dalam Southern Blot dengan
menggunakan Bioinformatics data base (NCBI)
2. Mengetahui dan memahami cara mendeteksi terjadinya ekspresi gen dengan teknik
hibridisasi metode Southern Blot.

II. DASAR TEORI

Biologi sel molekuler adalah ilmu pengetahuan yang merupakan multi disiplin ilmu dari
biokimia, biologi sel, dan genetika yang mempelajari aktivitas biologi pada level molekuler ,
termasuk interaksi antara perbedaan tipe DNA,RNA,protein dan biosintesisnya. Aktivitas atau
mekanisme yang terjadi pada molekuler sangat penting untuk dipelajari untuk menunjukkan gen
apa yang mempengaruhi suatu penyakit genetika ,identifikasi gen,identifikasi yang
mempengaruhi suatu penyakit genetika, identifikasi DNA, identifikasi DNA forensik, terapi gen
dalam mengobati, mencegah penyakit dan sebagainya. (Rina,2011)

DNA probe adalah suatu fragmen DNA atau RNA atau protein pelacak target gen. DNA
probe yang telah di label akan berkomplementasi dengan target memlalui hibridisasi sehingga
dapat mendeteksi keberadaan gen tertentu. Terdapat dua macam probe, yaitu homologus dan
heterologus. Homologus adalah probe yang diperoleh dari DNA dengan sumber yang sama
dengan DNA yang akan di lacak sehingga ikatan komplemen probe dengan DNA target
cenderung lebih kuat dan presisi. Sedangkan heterologus adalah probe yang di peroleh dari
sumber organisme yang berbedda atau di buat secara sintetik sehingga ikatannya kurang presisi
dengan gen target. (Nellson dan Lehninger, 2000)

DNA merupakan polinukleotida yang terdapat dalam inti sel yang secara kimiawi berupa
asam nukleat yang tersusun secara double helix.Sedangkan kromosom DNA adalah DNA yang
tersusun secara kompak yang diikat oleh protein-protein.bagian dari kromosom adalah gen.Gen
adalah suatu unit DNA yang diturunkan.Setiap GEN terdiri dari suatu rangkaian DNA yang
membawa informasi dari suatu protein (Yuwono, 2005)

Untuk menganalisis RNA yang menyediakan suatu protein dengan DNA probe terhadap
RNA digunakan cara yang disebut northern Blotting. Mula – mula molekul RNA yang masih uth
dari sel – sel suatu organ dipisah menjadi sederet pita pada gel elektroforesis. Selanjutnya agar
molekul – molekul RNA yang telah di pisahkan pada sehelai kertas nitroselulosa atau kertas –
kertas nilon. Molekul – molekul RNA yang telah membentuk hybrid dengan DNA probe yang
radioaktif (karena memiliki sebagian dari rangkaian gen yang normal) kemudian ditentukan
lokasinya dengan menginkubasi kertas tersebut dengan larutan yang mengandung probe dan
probe telah membentuk hybrid dideteksi dengan otoradiografi. Karena molekul – molekul asam
nukleat yang kecil bergerak melintasi gel lebih cepat bila di banding molekul – molekul RNA
dengan ukuran yang di ketahui. (Poedjyadi,2005)
 Asam nukleat merupakan suatu polinukleotida yaitu polimer linier yang tersusun dari
monomer – monomer nukleotida yang berikatan melalui ikatan fosfodiester. Fungsi utama asam
nukleat adalah sebagai tempat penyimpanan dan pemindahan informasi genetic. Informasi ini
diteruskan dari sel induk ke sel anak melalui proses replikasi. Sel memiliki dua jenis asam
deoksiribonukleat (deoxyribonucleic acid / DNA) dan adam ribonukleat (ribonucleic acid/
RNA). Untuk menganalisis RNA yang menyediakan suatu protein dengan DNA probe terhadap
RNA digunakan cara yang disebut northern Blotting. Mula – mula molekul RNA yang masih uth
dari sel – sel suatu organ dipisah menjadi sederet pita pada gel elektroforesis. Selanjutnya agar
molekul – molekul RNA yang telah di pisahkan pada sehelai kertas nitroselulosa atau kertas-
kertas nilon. Molekul – molekul RNA yang telah membentuk hybrid dengan DNA probe yang
radioaktif (karena memiliki sebagian dari rangkaian gen yang normal) kemudian ditentukan
lokasinya dengan menginkubasi kertas tersebut dengan larutan yang mengandung probe dan
probe telah membentuk hybrid dideteksi dengan otoradiografi. Karena molekul – molekul asam
nukleat yang kecil bergerak melintasi gel lebih cepat bila di banding molekul – molekul RNA
dengan ukuran yang di ketahui. (Poedjyadi,2005)

DNA probe sering digunakan bersama dengan elektroforogenesis gel untuk mendeteksi
molekul – molekul asam nukleat dengan rangkaian – rangkaian komplementer dengan semua
atau sebagian dari rangkaian probe. Gen adalah suatu unit DNA yang diturunkan. Setiap gen
terdiri dari suatu rantgkaian DNA yang membawa informasi dari suatu protein. (Pelezar dan
chan,1988).

Ada tiga struktur DNA yang dikenal selama ini yaitu sebagai berikut :

1. STRUKTUR PRIMER
DNA tersusun dari monomer – monomer nukleotida. Setiap nokleotida terdiri dari
satu basa nitrogen berupa senyawa purin dan purimidin, satu gula pentose berupa 2’-
deoksi-D-ribosa dalam bentuk furanosa, dan satu molekul fosfat. Penulisan urutan basa di
mulai dari kiri yaitu ujung 5’ menuju ujung dengan gugus 3’hidroksil bebas atau dengan
arah 5 ’ 3’ (Darnell, et al., dalam T. Milanda. 1994).

2. STRUKTUR SEKUNDER
Salah satu sifat biokimia DNA yang menentukan fungsinya sebagai pembawa
informasi genetik adalah komposisi basa penyusun. Pada tahun 1949 – 1953, Edwin
Chargaff menggunakan metode kromatografi untuk pemisahan dan analisis kuantitatif ke
empat basa DNA, yang di isolasi dari berbagai organism.
Kesimpulan yang diambil dari berbagai data yang terkumpul adalah sebagi berikut :
a) Komposisi basa DNA bervariasi antara spesies yang satu dengan spesies lain.
b) Sampel DNA yang diisolasi dari berbagai jaringan pada spesies yang sama
mempunyai komposisi basa yang sama.
c) Komposisi DNA pada suatu spesies tidak berubah oleh perubahan usia, keadaan
nutrisi maupun perubahan lingkungan.
 Hampir semua DNA yang diteliti mempunyai jumlah residu adenine yang sama dengan
jumlah residu tinin (A=T) dan jumlah residu guanine yang sma dengan jumlah residu
sitonin (G=C) maka A+G = C+T, yang disebut aturan CHARGAFF. DNA yang di
ektraksi dari spesies-spesies dengan hubungan kekerabatan yang dekat mempunyai
komposisi basa yang hamper sama. Pada tahun 1953, James D. Watson dan Francis H.C.
Crick berhasil mengurai struktur sekunder DNA yang berbentuk heliks ganda melalui
analisis pola difraksi sinar X dan menghubungkan model strukturnya. (Darnell, et al.
dalam T. Milanda, 1994).

3. STRUKTUR TERSIER
Kebanyakan DNA virus dan DNA mitokondria merupakan molekul lingkar
Konformasi ini terjadi karena kedua untai polinukleotida membentuk struktur tertutup
yang tidak berujung. Molekul DNA lingkar tertutup yang diidolasi dari bakteri, virus dan
mitokondria seringkali berbentuk superkoil, selain itu DNA dapat berbentuk molekul
linier dengan ujung-ujung rantai yang bebas. RNA hampir sama dengan DNA,
perbedaannya terletak pada:
a) Basa utama RNA adalah Adenin, Guenin, Sitosin, dan Urasil, dengan
panjang molekul 70 dampai 10.000 pb,
b) Unit gula adalah D-ribosa
c) Molekul RNA berupa untai tunggal, kecuali oada beberapa virus.
(Poedjiadi,2005)

III. ALAT DAN BAHAN

A. ALAT :
 Laptop
 Charger

B. BAHAN :
 Situs NCBI
 Gen NM_000125.3

IV. CARA KERJA

A. PROBE PENDEK
1. Buka situs NCBI. Website ini menyediakan gene bank database yang diperlukan
untuk merancang probe.
2. Isi kotak search nucleotide for dengan kode gen NM_000283.3

3. Klik enter akan muncul seperti ini :

4. Pilih gen yang akan di analisis. Dengan mengacu pada sekuen cDNA, dibuat probe
pendek 240 bp dengan mem-block sekuen origin yang masuk dalam region CDS 61-
291. Copy
5. keluar dari halaman tersebut, atau buka lagi situs yang sama. Klik menu BLAST.

6. Pilih nucleotide-nucleotide blast (blasn), klik.

 7. Paste-kan rancangan probe tersebut pada kotak QUERRY untuk mencari
komplemennya. . Isi kolom JOB dengan nama probe pendek, pilih “Human Genomic
+ Transcript”. Lalu tekan BLAST

8. Setelah muncul grafik dan lakukan analisis lenih lanjut apakah probe tersebut spesifik
atau tidak dengan membandingkan presentase komplemen dengan gen target.

B. PROBE SEDANG
1. Buka situs NCBI. Website ini menyediakan gene bank database yang diperlukan
untuk merancang probe.

2. Isi kotak search nucleotide for dengan kode gen NM_000238.3

3. Klik enter akan muncul seperti ini :

4. Pilih gen yang akan di analisis. Dengan mengacu pada sekuen cDNA, dibuat probe
sedang 480 bp dengan mem-block sekuen origin yang masuk dalam region CDS 301-
771. Copy

5. keluar dari halaman tersebut, atau buka lagi situs yang sama. Klik menu BLAST.

6. Pilih nucleotide-nucleotide blast (blasn), klik.

7. Paste-kan rancangan probe tersebut pada kotak QUERRY untuk mencari
komplemennya. . Isi kolom JOB dengan nama probe sedang, pilih “Human Genomic
+ Transcript”. Lalu tekan BLAST

8. Setelah muncul grafik dan lakukan analisis lenih lanjut apakah probe tersebut spesifik
atau tidak dengan membandingkan presentase komplemen dengan gen target.
C. PROBE PANJANG
1. Buka situs NCBI. Website ini menyediakan gene bank database yang diperlukan
untuk merancang probe.

2. Isi kotak search nucleotide for dengan Kode Gen NM_000283.3

3. Klik enter akan muncul seperti ini :

4. Pilih gen yang akan di analisis. Dengan mengacu pada sekuen cDNA, dibuat probe
panjang 1.010 bp dengan mem-block sekuen origin yang masuk dalam region CDS
781-1791. Copy

5. keluar dari halaman tersebut, atau buka lagi situs yang sama. Klik menu BLAST.
6. Pilih nucleotide-nucleotide blast (blasn), klik.

7. Paste-kan rancangan probe tersebut pada kotak QUERRY untuk mencari

komplemennya. . Isi kolom JOB dengan nama probe panjang, pilih “Human Genomic
+ Transcript”. Lalu tekan BLAST

8. Setelah muncul grafik dan lakukan analisis lenih lanjut apakah probe tersebut spesifik
atau tidak dengan membandingkan presentase komplemen dengan gen target.
V. HASIL

a) PROBE PENDEK
Kode gen : NM_000283.3
Nama gen : Homo Sapiens Phosphodiesterase 6B (PDE6B), transcript variant
1, mRNA.
CDS : 54..2618
Querry Length : 61-291 (240 bp)

DESKRIPSI

No Description Max Query Acession

. Skore Cover

1. Homo Sapiens Phosphodiesterase 6B 444 100% NM

(PDE6B), transcript variant 2, mRNA. 001145291.1
2. Homo Sapiens Phosphodiesterase 6B 444 100% NM 000283.3
(PDE6B), transcript variant 1, mRNA.
Genomic sequences
1. Homo Sapiens chromosome 4. GRCh38 p12 444 100% NC 000004.12
primary Assembly

GAMBAR

b) PROBE SEDANG
Kode gen : NM_000283.3
Nama gen : Homo Sapiens Phosphodiesterase 6B (PDE6B), transcript variant
1, mRNA.
CDS : 54..2618
Querry Length : 301-771 (480 bp)

DESKRIPSI
No. Description Max Quer Acession
Skore y
cover
1. Homo Sapiens Phosphodiesterase 6B 887 100% NM 00114529.1
(PDE6B), transcript variant 2, mRNA.
2. Homo Sapiens Phosphodiesterase 6B 887 100 NM 000283.3
(PDE6B), transcript variant 1, mRNA. %
Genomic sequences
1. Homo Sapiens chromosome 4,GRCh38 409 97% NC 000004.12
p12 Primary Assembly

GAMBAR

c) Probe Panjang
Kode gen : NM_000283.3
Nama gen : Homo Sapiens Phosphodiesterase 6B (PDE6B), transcript variant
1, mRNA.
CDS : 54..2618
Querry Length : 781-1791 (1.010 bp)

DESKRIPSI

No Description Max Quer Acession

. Score y
cover
1. Homo Sapiens Phosphodiesterase 6B 1884 100% NM 001145291.1
(PDE6B), transcript variant 2, mRNA.
2. Homo Sapiens Phosphodiesterase 6B 1884 100% NM 000283.3
(PDE6B), transcript variant 1, mRNA.
3. Homo Sapiens Phosphodiesterase 6B 1884 100% NM 001145292.1
 (PDE6B), transcript variant 3, mRNA.
4. Homo Sapiens Phosphodiesterase 6B 1879 100% NM 001350154.1
(PDE6B), transcript variant 4, mRNA.
5. Homo Sapiens Phosphodiesterase 6B 1182 88% NM 001350155.1
(PDE6B), transcript variant 5, mRNA.
Genomic sequences
1. Homo Sapiens chromosome 4,GRCh38 283 97% NC 000004.12
p12 Primary Assembly

GAMBAR

VI. PEMBAHASAN

Merancang probe pada praktikum ini dilakukan untuk menganalisis probe yang akan
digunakan dalam Southern Blot dengan menggunakan Bioinformatics Data Base (NCBI) serta
mengetahui dan memahami cara mendeteksi terjadinya ekspresi gen dengan teknik hibridisasi
metode Southern Blot.

Probe yang di buat dalam praktikum ini ada 3 rancangan yaitu probe pendek, probe
sedang, dan probe panjang. Untuk menganalisis pada percobaan satu saya menggunakan Probe
pendek 240 bp, probe sedang 480 bp, dan probe panjang sebanyak 1.010 bp. Kode gen yang di
gunakan adalah NM_000283.3. Dengan nama gen : Homo Sapiens Phosphodiesterase 6B
(PDE6B), transcript variant 1, mRNA.

Hasil probe pada praktikum ini diperoleh CDS 54..2618. Merangcang probe pengambilan
basa harus diantara region CDS yang sudah ditetapkan diatas agar diperoleh gen yang baik.
Apabila rancangan probe diambil diluar rancangan CDS akan menghasilkan competitor yang
banyak dan memungkinkan basa yang bersesuaian dengan DNA jumlahnya sedikit.
 Rancangan probe pertama dilakukan probe pendek dengan panjang probe 240 bp
didapatkan score maksimal 444, dan selisih 0. Rancangan probe kedua, dilakukan probe sedang
panjang probe 470 bp didapatkan skore maksimal deskripsi 887, kompetitor 409 dengan selisih
478. Rancangan probe ketiga dilakukan probe panjang dengan panjang probe 1.010 bp
didapatkan skore maksimal deskripsi 1884, competitor 283 dengan selisih 1.601. Ketiga jenis
probe tersebut memiliki nilai presentase yang bagus yaitu 100%.

Tiga faktor yang dapat mentukan ke spesifikan suatu probe yaitu score maks, jumlah
kompetitor, dan presentase. Semakin banyak jumlah selisih score maks maka probe semakin
spesifik. Semakin sedikit jumlah kompetitor maka probe semakin spesifik. Presentase probe
akan lebih spesifik apabila nilainya 100% atau mendekati.

VII. KESIMPULAN

Berdasarkan hasil yang didapat probe panjang lebih spesifik dibandingkan dengan probe
pendek dan probe sedang. Karena probe panjang memiliki selisih nilai max score tertinggi yaitu
1.601 bp, jumlah kompetitor 1 dan nilai presentase 100%.

VIII. DAFTAR PUSTAKA

Astikawi,Rina. 2011. Biologi molekular prinsip dasar analisis. PT Erlangga: Yogyakarta.

Darnell J., Lodish H., and Baltimore D., 1990. Molecular Cell Biology, 2nd edition,
Scientific American Book Inc., , p. 99-76: New York.

D. L. Nelson and M. M. Cox. Lehninger Principles of Biochemistry. Worth Publishers,

3rd edition, 2000.

Pelczar, M. J. dan E. C. S. Chan, 1998, Dasar-Dasar Mikrobiologi, Jilid 2, Terjemahan

rATna Sri Hadioetomo, dkk., Penerbit Universitas Indonesia: Jakarta.

Poedjiadi, Anna. 2005. Dasar-Dasar Biokimia. UI Press: Jakarta.

Wolf, L. S., 1993, Molecular and Cellular Biology. Wardsworth Publishing Company:
California

Yuwono, Triwibowo, 2005, Biologi Molekuler, Erlangga: Jakarta.