BAB I

PENDAHULUAN
1.1 Latar Belakang
Kromatografi lapis tipis (KLT) dikembangkan tahun 1938 oleh Ismailoff dan
Schraiber. Adsorben dilapiskan pada lempeng kaca yang bertindak sebagai
peunjang fase diam. Fase bergerak akan merayap sepanjang fase diam dan
terbentuklah kromatogram.Metode ini sederhana, cepat dalam pemisahan tinggi
dan mudah untuk memperoleh kembali senyawa-senyawa yang terpisahkan.Pada
dasarnya kromatografi lapis tipis (KLT atau TLC = Thin layer Chromatography)
sangat mirip dengan kromatografi kertas, terutama pada cara melakukannya.
Perbedaan nyata terlihat pada media pemisahannya, yakni digunakan lapisan tipis
adsorben halus yang tersangga pada papan kaca, aluminium atau plastic sebagai
pengganti kertas. Lapisan tipis adsorben ini pada pross pemisahan berlaku sebagai
fasa diam.
Kromatografi digunakan sebagai untuk memisahkan substansi campuran
menjadi komponen-komponennya, misalnya senyawa Flavonoida dan
isoflavonoida yang terdapat pada tahu, tempe, bubuk kedelai dan tauco serta
Scoparia dulcis, Lindernia anagalis, dan Torenia violacea. Yang pada senyawa
isoflavon memiliki banyak manfaat. Beberapa kelebihan senyawa isoflavon yang
potensial bagi kesehatan manusia, di antaranya adalah sebagai antioksidan,
antitumor / antikanker, antikolesterol, antivirus, antialergi, dan dapat mencegah
osteoporosis. Dan semua kromatografi bekerja berdasarkan metode
kromatografi.Kromatografi juga merupakan pemisahan campuran senyawa
menjadi senyawa murninya dan mengetahui kuantitasnya. Untuk itu, kemurnian
bahan atau komposisi campuran dengan kandungan yang berbeda dapat dianalisis
dengan benar. Tidak hanya kontrol kualitas, analisis bahan makanan dan
lingkungan, tetapi juga kontrol dan optimasi reaksi kimia dan proses berdasarkan
penentuan analitik dari kuantitas material. Teknologi yang penting untuk analisis
dan pemisahan preparatif pada campuran bahan adalah prinsip dasar kromatografi.
Pemisahan senyawa biasanya menggunakan beberapa tekhnik kromatografi.

1
 Pemilihan teknik kromatografi sebagian besar bergantung pada sifat
kelarutan senyawa yang akan dipisahkan.Pemisahan senyawa biasanya
menggunakan beberapa teknik kromatografi. Pemilihan teknik kromatografi
sebagian besar bergantung pada sifat kelarutan senyawa yang akan dipisahkan.
Semua kromatografi memiliki fase diam (dapat berupa padatan, atau
kombinasi cairan-padatan) dan fase gerak (berupa cairan atau gas). Fase gerak
mengalir melalui fase diam dan membawa komponen-komponen suatu senyawa
yang dipisahkan dengan kromatografi lapis tipis tergantung pada jenis pelarut, zat
penyerap dengan sifat daya serap masing-masing komponen. Komponen yang
terlarut akan terbawa oleh fase diam (penyerap) dengan membandingkannya
dengan standar yang sangat memakan waktu dan harus dilakukan terpisah pada
kondisi eluen yang sama. Dalam hal ini untuk mendapatkan resolusi yang baik,
penting untuk memilih dua campuran pelarut yang berbeda, meskipun dengan
kekuatan pelarut yang sama.
1.2 Perumusan Masalah
Adapun rumusan masalah dalam makalah ini antara lain:
1. Apa pengertian kromatografi lapis tipis?
2. Bagaimana prinsip kerja kromatografi lapis tipis?
3. Bagaimana prosedur kerja pada pemisahan sampel menggunakan
kromatografi lapis tipis?
4. Apa saja fase diam dan fase gerak dalam kromatografi lapis tipis?
5. Apa saja kelebihan dari kromatografi lapis tipis?
6. Bagaimana aplikasi kromatografi lapis tipis dalam dunia farmasi?
1.3 Tujuan Masalah
Adapun tujuan dari makalah ini adalah sebagai berikut: Tujuan dari
penulisan makalah ini adalah agar mahasiswa dapat memahami mengenai
kromatografi lapis tipis sehingga dapat mengaplikasikannya.

2
 BAB II
PEMBAHASAN
2.1. Pengertian Kromatografi Lapis Tipis (KLT)
Pengertian dari Kromatografi adalah cara pemisahan zat berkhasiat dan zat
yang lain yang ada dalam bahan atau sediaan dengan jalan penyarian
berfraksi, penyerapan atau penukaran ion pada zat berpori, menggunakan cairan
atau gas yang mengalir. Zat yang diperoleh dapat digunakan untuk uji identifikasi
atau penetapan kadar.
Kromatografi lapis tipis (KLT) adalah suatu metode analisis yang digunakan
untuk memisahkan suatu campuran senyawa secara cepat dan sederhana.
Prinsipnya didasarkan atas partisi dan adsorpsi. Zat penjerap merupakan fase
stasioner, berupa bubuk halus dibuat serba rata dan tipis diatas lempeng kaca. Fase
diam yang umum digunakan adalah silika gel, baik yang normal fase maupun
reversed fase.
Suatu metode pemisahan komponen kimia berdasarkan prinsip partisi dan
adsorpsi antara fase diam (adsorben) dan fase gerak (eluen), komponen kimia
bergerak naik mengikuti cairan pengembang karena daya serap adsorben (silika
gel) terhadap komponen-komponen kimia tidak sama sehingga komponen dapat
bergerak dengan kecepatan yang berbeda-beda berdasarkan tingkat kepolarannya
dan hal inilah yang menyebabkan terjadinya pemisahan.
Mekanisme panampakan noda pada UV yaitu suatu molekul yang
mengabsorbsi cahaya ultraviolet akan mencapai suatu keadaan tereksitasi dan
kemudian memancarkan cahaya ultraviolet atau cahaya tampak pada waktu
kembali ketingkat dasar (emisi), emisi inilah yang digambarkan sebagai
fluoresensi.

3
2.2. Prinsip Kerja Kromatografi Lapis Tipis (KLT)
Pada proses pemisahan dengan kromatografi lapis tipis, terjadi hubungan
kesetimbangan antara fase diam dan fase gerak, dimana ada interaksi antara
permukaan fase diam dengan gugus fungsi senyawa organik yang akan
diidentifikasi yang telah berinteraksi dengan fasa geraknya. Kesetimbangan ini
dipengaruhi oleh 3 faktor, yaitu : kepolaran fase diam, kepolaran fase gerak, serta
kepolaran dan ukuran molekul.

Prinsip kerjanya memisahkan sampel berdasarkan perbedaan kepolaran

antara sampel dengan pelarut yang digunakan. Teknik ini biasanya menggunakan
fase diam dari bentuk plat silika dan fase geraknya disesuaikan dengan jenis
sampel yang ingin dipisahkan. Larutan atau campuran larutan yang digunakan
dinamakan eluen Semakin dekat kepolaran antara sampel dengan eluen maka
sampel akan semakin terbawa oleh fase gerak tersebut.
Pada kromatografi lapis tipis, eluent adalah fase gerak yang berperan
penting pada proses elusi bagi larutan umpan (feed) untuk melewati fase diam
(adsorbent). Interaksi antara adsorbent dengan eluent sangat menentukan
terjadinya pemisahan komponen. Oleh sebab itu pemisahan komponen
secara kromatografi dipengaruhi oleh laju alir eluent dan jumlah
umpan. Eluent dapat digolongkan menurut ukuran kekuatan teradsorpsinya
pelarut atau campuran pelarut tersebut pada adsorben dan dalam hal ini yang
banyak digunakan adalah jenis adsorben alumina atau sebuah lapis tipis silika.
Suatu pelarut yang bersifat larutan relatif polar, dapat mengusir pelarut yang tak
polar dari ikatannya dengan alumina (gel silika). Semakin dekat kepolaran antara
senyawa dengan eluen maka senyawa akan semakin terbawa oleh fase gerak
tersebut. Hal ini berdasarkan prinsip “like dissolved like”.

4
 Ada beberapa hal yag perlu diperhatikan dalam mempelajari materi KLT
antara lain:
a.    Alat Lempeng Kaca
Lempeng kaca dengan tebal serba rata seluruh permukaan berukuran 20 cm
x 20 cm ; sebagai lempeng tapi digunakan lempeng kaca berukuran 5 cm x 20 cm.
b.    Baki Lempeng
Umunya baki lempeng berukuran 122 cm x 23 cm  dengan satu sisi panjang
dan satu sisi pendek yang berbingkai untuk menahan lempeng kaca. Baki yang
digunakan untuk meleatkkan dan mengatur lempeng kaca pada waktu membuat
lapisan zat penjerap hingga diperloeh permukaan yang rata.
c.    Rak penyimpanan
Rak penyimpanan dipergunakan untuk menempatkan lempeng yang telah
dilapisi zat penjerap selam pengeringan atau untuk membawa lempeng. Rak
mempunyai ukuran yang cocok sehingga dapat masuk kedalam lemari pengering.
Dapat memuat lebih kurang 10 lempeng dengan jarak tertentu.
d.    Zat penjerap
Zat penjerap dapat terdiri dari zat penjerap kromatografi yang halus. Fosfor
dapat ditambahkan untuk melihat respan UV senyawa yang meresap UV. Zat
penjerap dapat dilapiskan langsung pada lempeng kaca dengan pertolongan zat
perekat, misalnya kalsium sulfat anhidrat 5%-15% atau kanji. Kalsium sulfat tidak
dapat memberikan permukaan yang keras seperti kanji, tetapi tidak terpengaruh
pereaksi semprot yang bersifat oksidator kuat.
e.    Alat Pembuat Lapisan
Alat pembuat lapisan berupa bak panjang yang dibuat dengan teliti,
mempunyai cela yang memanjang pada dasarnaya. Alat karena bonotnya jika
digerakkan diatas lempeng kaca akan memberikan lapisan zat penjerap serba rata
pada seluruh permukaan lempengan setebal 0,25 mikrometer untuk memperoleh
tebal lapisan lain dibuatkan alat lapisan yang dapat diatur.

5
f.    Bejana Kromatografi
Bejana kromatografi umunya dapat membuat 2 lempeng kaca dan dapat
tertutup rapat. Kedalam bejana dapat dimasukkan sebuah rak penyangga terbuat
dari bejana tahan karat yang dapat memuat 2 lempeng kaca adalah menyeblah.
g.    Sablon-sablon
Umunya dibuat dari plastik digunakan untuk membantu memberi tanda pada
lempeng, misalnya untuk memberi tanda pada tempat penotolan dengan jarak
tertentu dan untuk membantu memberi tanda lain pada lempeng.
h.    Pipet Mikro
Pipet mikro berskala 10 µl untuk memindahkan cairan. Jumlah larutan zat
yang diperiksa dan larutan baku yang harus ditotolkan, tertera pada masing-
masing monografi.
i.     Alat Penyemprot Pereaksi 
Alat penyemprot tahan terhadap pereaksi dan dapat menyemprotkan peraksi
daalm bentuk butiran halus.
j.     Lampu UV
Lampu UV yang cocok untuk pengataman dEngan panjang gelombang
pendek (254 µm) dan dengan panjang gelombang panjang 336 µm.
2.3. Pelaksanaan kromatografi Kerja Kromatografi Lapis Tipis (KLT)
Pelaksaanan kromatografi lapis tipis menggunakan sebuah lapis tipis silika
atau alumina yang seragam pada sebuah lempeng gelas atau logam atau plastik
yang keras. Jel silika (atau alumina) merupakan fase diam. Fase diam untuk
kromatografi lapis tipis seringkali juga mengandung substansi yang mana dapat
berpendarflour dalam sinar ultra violet. Fase gerak merupakan pelarut atau
campuran pelarut yang sesuai.Pelaksanaan ini biasanya dalam pemisahan warna
yang merupakan gabungan dari beberapa zat pewarna atau pemisahan dan isolasi
pigment tanaman yang berwarna hijau dan kuning
1. Kromatogram
Pelaksanaan kromatografi biasanya digunakan dalam pemisahan pewarna
yang merupakan sebuah campuran dari beberapa zat pewarna. Contoh
pelaksanaan kromatografi lapis tipis:Sebuah garis menggunakan pinsil digambar

6
dekat bagian bawah lempengan dan setetes pelarut dari campuran pewarna
ditempatkan pada garis itu. Diberikan penandaan pada garis di lempengan untuk
menunjukkan posisi awal dari tetesan. Jika ini dilakukan menggunakan tinta,
pewarna dari tinta akan bergerak selayaknya kromatogramdibentuk.Ketika bercak
dari campuran itu mengering, lempengan ditempatkan dalam sebuah gelas kimia
bertutup berisi pelarut dalam jumlah yang tidak terlalu banyak. Perlu diperhatikan
bahwa batas pelarut berada di bawah garis dimana posisi bercak berada.
Alasan untuk menutup gelas kimia adalah untuk meyakinkan bawah kondisi
dalam gelas kimia terjenuhkan oleh uap dari pelarut. Untuk mendapatkan kondisi
ini, dalam gelas kimia biasanya ditempatkan beberapa kertas saring yang terbasahi
oleh pelarut. Kondisi jenuh dalam gelas kimia dengan uap mencegah penguapan
pelarut. Karena pelarut bergerak lambat pada lempengan, komponen-komponen
yang berbeda dari campuran pewarna akan bergerak pada kecepatan yang berbeda
dan akan tampak sebagai perbedaan bercak warna.
2. Perhitungan nilai Rf
Perbedaan warna yang telah terbentuk dari campuran, pengukuran diperoleh
dari lempengan untuk memudahkan identifikasi senyawa-senyawa yang
muncul.Pengukuran ini berdasarkan pada jarak yang ditempuh oleh pelarut dan
jarak yang tempuh oleh bercak warna masing - masing. Ketika pelarut mendekati
bagian atas lempengan, lempengan dipindahkan dari gelas kimia dan posisi
pelarut ditandai dengan sebuah garis, sebelum mengalami proses penguapan.
Pengukuran berlangsung sebagai berikut:
Rf = 

Jarak titik pusat bercak dari titik awal Jarak garis depan dari titik awalAngka Rf
berjangka antara 0,00 dan 1,00 dan hanya dapat ditentukan dua desimal.
hRf adalah angka Rf dikalikan faktor 100 (h), menghasilkan nilai berjangka 0-
100. Jika keadaan luar misalnya sifat penjerap yang agak menyimpang,
menghasilkan kromatogram yang agak menyimpang, menghasilkan kromatogram
yang secara umum menunjukkan angka Rf lebih rendah atau lebih tinggi, maka
sistem pelarut harus diganti dengan yang lebih sesuai. Jika angka hRf lebih tinggi

7
 dari hRf yang dinyatakan, kepolaran pelarut harus dikurangi, jika hRf lebih
rendah maka komponen polar pelarut harus dinaikkan (Stahl, 1985).
Faktor-faktor yang mempengaruhi gerakan noda dalam kromatrografi lapis
tipis yang juga mempengaruhi harga Rf:
1. Struktur kimia dari senyawa yang sedang dipisahkan
2. Sifat dari penyerap dan derajat aktivitasnya
Biasanya aktifitas dicapai dengan pemanasan dalam oven, hal ini akan
mengeringkan molekul-molekul air yang menempati pusat-pusat serapan dari
penyerap. Perbedaan penyerap akan memberikan perbedaan yang besar terhadap
harga Rf meskipun menggunakan fase bergerak dan zat terlarut yang sama tetapi
hasil akan dapat diulang dengan hasil yang sama,   jika menggunakan penyerap
yang sama, ukuran partikel tetap  dan jika pengikat (kalau ada) dicampur hingga
homogen.
3. Tebal dan kerataan dari lapisan penyerap
Pada prakteknya tebal lapisan tidak dapat dilihat pengaruhnya, tetapi perlu
diusahakan tebal lapisan yang rata. Ketidakrataan akan menyebabkan aliran
pelarut menjadi tak rata pula dalam daerah yang kecil dari plat.
4. Pelarut (dan derajat kemurniannya) fase bergerak
Kemurnian dari pelarut yang digunakan sebagai fase bergerak dalam
kromatografi lapisan tipis adalah sangat penting dan bila campuran pelarut
digunakan maka perbandingan yang dipakai harus betul-betul diperhatikan.
Derajat kejenuhan dan uap dalam bejana pengembangan yang digunakan.
5. Teknik percobaan
Arah pelarut bergerak di atas plat. (Metoda aliran penaikan yang hanya
diperhatikan, karena cara ini yang paling umum meskipun teknik aliran penurunan
dan mendatar juga digunakan.
6. Jumlah cuplikan yang digunakan
Penetesan cuplikan dalam jumlah yang berlebihan memberikan hasil
penyebaran noda-noda dengan kemungkinan terbentuknya ekor dan efek tak
kesetimbangan lainnya, hingga akan mengakibatkan kesalahan-kesalahan pada
harga-harga Rf.

8
 7. Suhu
Pemisahan-pemisahan sebaiknya dikerjakan pada suhu tetap, hal ini
terutama untuk mencegah perubahan-perubahan dalam komposisi pelarut yang
disebabkan oleh penguapan atau perubahan-perubahan fase
8. Kesetimbangan
Ternyata bahwa kesetimbangan dalam lapisan tipis lebih penting dalam
kromatografi kertas, hingga perlu mengusahakan atmosfer dalam bejana jenuh
dengan uap pelarut. Suatu gejala bila atmosfer dalam bejana tidak jenuh dengan
uap pelarut, bila digunakan pelarut campuran, akan terjadi pengembangan dengan
permukaan pelarut yang berbentuk cekung dan fase bergerak lebih cepat pada
bagian tepi-tepi  dan keadaan ini harus dicegah. digunakan pelarut campuran, akan
terjadi pengembangan dengan permukaan pelarut yang berbentuk cekung dan fase
bergerak lebih cepat pada bagian tepi-tepi  dan keadaan ini harus dicegah.
Semua kromatografi memiliki fase diam (dapat berupa padatan, atau
kombinasi cairan-padatan) dan fase gerak (berupa cairan atau gas). Fase gerak
mengalir melalui fase diam dan membawa komponen-komponen yang terdapat
dalam campuran. Komponen-komponen yang berbeda bergerak pada laju yang
berbeda.Sedangkan fase diam untuk kromatografi lapis tipis seringkali juga
mengandung substansi yang mana dapat berpendar flour dalam sinar ultra violet.
Pendaran ini ditutupi pada posisi dimana bercak pada kromatogram berada,
meskipun bercak-bercak itu tidak tampak berwarna jika dilihat dengan mata.
Namun, apabila di sinarkan dengan sinar UV pada lempengan, akan timbul
pendaran dari posisi yang berbeda dengan posisi bercak-bercak. Bercak tampak
sebagai bidang kecil yang gelap.Sementara UV tetap di sinarkan pada lempengan,
harus dilakukan penandaan posisi-posisi dari bercak-bercak dengan menggunakan
pensil dan melingkari daerah bercak-bercak itu. Ketika sinar UV dimatikan,
bercak-bercak tidak tampak kembali.
Prinsip pemisahan noda adalah berdasarkan kepolarannya sehingga
menghasilkan kecepatan yang berbeda-beda saat terpartisi dan terjadilah
pemisahan.Untuk memisahkan noda dengan sebaik-baiknya maka digunakan
kombinasi eluen non polar dengan polar. Apabila noda yang diperoleh terlalu

9
tinggi, maka kecepatannya dapat dikurangi dengan mengurangi kepolaran. Namun
apabila nodanya lambat bergerak atau hanya ditempat, maka kepolaran dapat
ditambah.
a) Mengidentifikasi senyawa-senyawa
Dimisalkan campuran asam amino yang ingin diketahui senyawa. Caranya :
Setetes campuran ditempatkan pada garis dasar lempengan lapis tipis dan bercak-
bercak kecil yang serupa dari asam amino yang telah diketahui juga ditempatkan
pada disamping tetesan yang akan diidentifikasi. Lempengan lalu ditempatkan
pada posisi berdiri dalam pelarut yang sesuai dan dibiarkan seperti sebelumnya.
Dalam gambar, campuran adalah M dan asam amino yang telah diketahui ditandai
1-5.Bagian kiri gambar menunjukkan lempengan setelah pelarut hampir mencapai
bagian atas dari lempengan. Bercak-bercak masih belum tampak. Gambar kedua
menunjukkan apa yang terjadi setelah lempengan disemprotkan ninhidrin.Tidak
diperlukan menghitung nilai Rf karena anda dengan mudah dapat
membandingkan bercak-bercak pada campuran dengan bercak dari asam amino
2.4 Kromatografi Lapis Tipis Pada Substansi Tidak Berwarna
a. Menggunakan pendarflourfase
diam pada sebuah lempengan lapis tipis seringkali memiliki substansi
yang ditambahkan kedalamnya, supaya menghasilkan pendaran flour ketika
diberikan sinar ultraviolet (UV). Itu berarti jika menyinarkannya dengan
sinar UV, akan berpendar.Pendaran ini ditutupi pada posisi dimana bercak
pada kromatogram berada, meskipun bercak-bercak itu tidak tampak
berwarna jika dilihat dengan mata. Itu berarti bahwa menyinarkan sinar UV
pada lempengan, akan timbul pendaran dari posisi yang berbeda dengan
posisi bercak-bercak. Bercak tampak sebagai bidang kecil yang
gelap.Sementara UV tetap disinarkan pada lempengan, dan tandai posisi-
posisi dari bercak-bercak dengan menggunakan pinsil dan melingkari
daerah bercak-bercak itu. Seketika anda mematikan sinar UV, bercak-bercak
tersebut tidak tampak kembali.

10
 b. Menggunakan bercak secara kimia
Untuk membuat bercak-bercak menjadi tampak dengan jalan
mereaksikannya dengan zat kimia sehingga menghasilkan produk yang
berwarna. Sebuah contoh yang baik adalah kromatogram yang dihasilkan
dari campuran asam amino. Kromatogram dapat dikeringkan dan
disemprotkan dengan larutan ninhidrin. Ninhidrin bereaksi dengan asam
amino menghasilkan senyawa-senyawa berwarna, umumnya coklat atau
ungu.Dalam metode lain, kromatogram dikeringkan kembali dan kemudian
ditempatkan pada wadah bertutup (seperti gelas kimia dengan tutupan gelas
arloji) bersama dengan Kristal iodium. Uap iodium dalam wadah dapat
berekasi dengan bercak pada kromatogram, atau dapat dilekatkan lebih
dekat pada bercak daripada lempengan. Substansi yang dianalisis tampak
sebagai bercak-bercak kecoklatan.
2.5. Hal-Hal Kromatografi Lapis Tipis (KLT)
b) Lempeng yang akan digunakan harus diaktifkan terlebih dahulu agar pada
proses elusi lempeng silica gel dapat menyerap dan berikatan dengan
sampel. Pengaktifan lempeng dilakukan dalam oven pada suhu 1100C
selama 30 menit.
c) Chamber harus dijenuhkan untuk menghilangkan uap air atau gas lain yang
mengisi fase penjerap yang akan menghalangi laju eluen.
d)  Pada saat penotolan, hendaknya sampel jangan terlalu pekat sebab
pemisahannya akan sulit sehingga didapat noda berekor.
e) Penotolan harus tepat sehingga didapatkan jumlah noda yang baik.
f) Eluen yang digunakan harus murni sehingga tidak menghasilkan noda lain.
Noda-noda yang diperoleh biasanya berekor disebabkan karena :
1. Penotolan yang berulang-ulang dan letaknya tidak tepat
2. Kandungan senyawa yang terlalu asam atau basa
3. Lempeng yang tidak rata.
2.6. Prosedur Kerja Pemisahan dengan KLT
Gel silika adalah bentuk dari silikon dioksida (silika). Atom silikon
dihubungkan oleh atom oksigen dalam struktur kovalen yang besar. Namun, pada

11
permukaan gel silika, atom silikon berlekatan pada gugus -OH. Permukaan gel
silika sangat polar dan karenanya gugus -OH dapat membentuk ikatan hidrogen
dengan senyawa-senyawa yang sesuai di sekitarnya, sebagaimana halnya gaya van
der Waals dan atraksi dipol-dipol.
Pada kromatografi lapis tipis, fase diam berupa plat yang biasanya disi
dengansilica gel. Sebuah garis pensil di gambar dekat bagian bawah fase diam dan
setetes larutan campuran ditempatkan di atasnya. Garis pada fase diam berguna
untuk menunjukkan posisi asli campuran.  Pembuatan garis harus menggunakan
pensil karena jika semua ini dilakukan dengan tinta, pewarna dari tinta juga akan
bergerak sebagai kromatogram berkembang. Ketika titik campuran kering, fasa
diam diletakkan berdiri dalam gelas tertutup yang telah berisi fasa gerak dengan
posisi fase gerak di bawah garis. Digunakan gelas tertutup untuk memastikan
bahwa suasana dalam gelas jenuh dengan uap pelarut.
2.7 Cara Kerja Kromatografi Lapis Tipis
a. Fase diam-jel silika
Jel silika adalah bentuk dari silikon dioksida (silika). Atom silikon
dihubungkan oleh atom oksigen dalam struktur kovalen yang besar. Namun, pada
permukaan jel silika, atom silikon berlekatan pada gugus -OH.Jadi, pada
permukaan jel silika terdapat ikatan Si-O-H selain Si-O-Si. Gambar ini
menunjukkan bagian kecil dari permukaan silika.
Permukaan jel silika sangat polar dan karenanya gugus -OH dapat
membentuk ikatan hidrogen dengan senyawa-senyawa yang sesuai disekitarnya,
sebagaimana halnya gaya van der Waals dan atraksi dipol-dipol.. Fase diam
lainnya yang biasa digunakan adalah alumina-aluminium oksida. Atom aluminium
pada permukaan juga memiliki gugus -OH. Apa yang kita sebutkan tentang jel
silika kemudian digunakan serupa untuk alumina.
b. Senyawa-senyawa pemisah dari Kromatogram
Ketika pelarut mulai membasahi lempengan, pelarut pertama akan
melarutkan senyawa-senyawa dalam bercak yang telah ditempatkan pada garis
dasar. Senyawa-senyawa akan cenderung bergerak pada lempengan kromatografi
sebagaimana halnya pergerakan pelarut.

12
 Bagaimana cepatnya senyawa - senyawa dibawa bergerak ke atas pada
lempengan, tergantung pada : Kelarutan senyawa dalam pelarut. Tergantung pada
besar atraksi antara molekul-molekul senyawa dengan pelarut. Dan senyawa
melekat pada fase diam, misalnya jel silika. Tergantung pada bagaimana besar
atraksi antara senyawa dengan jel silika.
Senyawa yang dapat membentuk ikatan hidrogen akan melekat pada jel
silika lebih kuat dibanding senyawa lainnya hanya dapat mengambil bagian
interaksi van der Waals yang lemah. Kita mengatakan bahwa senyawa ini terjerap
lebih kuat dari senyawa yang lainnya. Penjerapan merupakan pembentukan suatu
ikatan dari satu substansi pada permukaan. Terdapat perbedaan bahwa ikatan
hidrogen pada tingkatan yang sama dan dapat larut dalam pelarut pada tingkatan
yang sama pula. Ini tidak hanya merupakan atraksi antara senyawa dengan jel
silika.
Atraksi antara senyawa dan pelarut juga merupakan hal yang penting-hal ini
akan mempengaruhi bagaimana mudahnya senyawa ditarik pada larutan keluar
dari permukaan silika. Penyerapan pada kromatografi lapis tipisbersifat tidak
permanen, terdapat pergerakan yang tetap dari molekul antara yang terjerap pada
permukaan jel silika dan yang kembali pada larutan dalam pelarut.
Dengan jelas senyawa hanya dapat bergerak ke atas pada lempengan selama
waktu terlarut dalam pelarut. Ketika senyawa dijerap pada jel silika-untuk
sementara waktu proses penjerapan berhenti-dimana pelarut bergerak tanpa
senyawa. Itu berarti bahwa semakin kuat senyawa dijerap, semakin kurang jarak
yang ditempuh ke atas lempengan. Bagaimanapun, hal ini memungkinkan
senyawa-senyawa tidak terpisahkan dengan baik ketika anda membuat
kromatogram. Dalam kasus itu, perubahan pelarut dapat membantu dengan baik
termasuk memungkinkan perubahan pH pelarut.
1. Fase Diam dan Fase Gerak KLT
Pada kromatografi, komponen-komponennya akan dipisahkan antara
dua buah fase yaitu fase diam dan fase gerak. Fase diam akan menahan
komponen campuran sedangkan fase gerak akan melarutkan zat komponen
campuran. Komponen yang mudah tertahan pada fase diam akan tertinggal.

13
Sedangkan komponen yang mudah larut dalam fase gerak akan bergerak
lebih cepat. Semua kromatografi memiliki fase diam (dapat berupa padatan,
atau kombinasi cairan-padatan) dan fase gerak (berupa cairan atau gas).
Fase gerak mengalir melalui fase diam dan membawa komponen-komponen
yang terdapat dalam campuran. Komponen-komponen yang berbeda
bergerak pada laju yang berbeda.
2. Fase Diam
Pelaksanaan kromatografi lapis tipis menggunakan sebuah lapis tipis
silika gel atau alumina yang seragam pada sebuah lempeng gelas atau logam
atau plastik yang keras. Gel silika (atau alumina) merupakan fase diam. Fase
diam untuk kromatografi lapis tipis seringkali juga mengandung substansi
yang mana dapat berpendar flour dalam sinar ultra violet. Fase diam lainnya
yang biasa digunakan adalah alumina-aluminium oksida. Atom aluminium
pada permukaan juga memiliki gugus -OH.
3. Fase Gerak
Dalam kromatografi, eluent adalah fase gerak yang berperan penting
pada proses elusi bagi larutan umpan (feed) untuk melewati fase diam
(adsorbent). Interaksi antara adsorbentdengan eluent sangat menentukan
terjadinya pemisahan komponen.
Eluent dapat digolongkan menurut ukuran kekuatan teradsorpsinya
pelarut atau campuran pelarut tersebut pada adsorben dan dalam hal ini yang
banyak digunakan adalah jenis adsorben alumina atau sebuah lapis tipis
silika. Penggolongan ini dikenal sebagai deret eluotropik pelarut. Suatu
pelarut yang bersifat larutan relatif polar, dapat mengusir pelarut yang relatif
tak polar dari ikatannya dengan alumina (gel silika). Kecepatan gerak
senyawa-senyawa ke atas pada lempengan tergantung pada:
1. Bagaimana kelarutan senyawa dalam pelarut, Hal ini bergantung
pada bagaimana besar atraksi antara molekul-molekul senyawa
dengan pelarut.

14
 2. Bagaimana senyawa melekat pada fase diam, misalnya gel
silika. Hal ini tergantung pada bagaimana besar atraksi antara
senyawa dengan gel silica
2.8. Aplikasi Metode KLT Dalam Bidang Farmasi
         Contoh penggunaan metode pemisahan secara Kromatografi Lapis Tipis
(KLT) dapat diterapkan dalam menganalisis adanya senyawa paracetamol dan
kafein dalam sediaan obat paten seperti poldanmig yang beredar di pasaran
apakah memenuhi persyaratan mutu obat atau tidak. Sehingga dengan kadar yang
tepat obat dapat memberikan efek terapi yang dikehendaki.
Setiap komponen memiliki harga Rf sendiri-sendiri, dengan bantuan dari
sinar ultraviolet maka dapat ditentukan noda yang tidak tampak oleh kasat mata.
Cara yang biasa dilakukan dengan menyemprotkan KMNO4 dalam H2SO4 yang
kemudian akan berinteraksi dengan komponen-komponen sampel baik secara
kimia maupun berdasarkan kelarutan membentuk warna-warna tertentu.
Noda kemudian dihitung harga Rf-nya. Harga Rf dihitung dengan
menggunakan perbandingan jarak yang ditempuh solut dengan jarak yang
ditempuh fase gerak. Nilai maksimum Rf adalah 1 dan nilai minimumnya 0.
Dengan menggunakan silika gel sebagai fase diam, harga Rf 1 menunjukkan jika
senyawa tersebut sangat nonpolar sedangkan harga Rf 0 menunjukkan bahwa
senyawa tersebut sangat polar.
Adapun manfaat dari Kromatografi Lapis Tipis (KLT) yaitu :
1.     Pemeriksaan kualitatif dan kemurnian senyawa obat.
2.     Pemeriksaan simplisia hewan dan tanaman.
3.     Pemeriksaan komposisi dan komponen aktif sediaan obat.
4.    Penentuan kualitatif masing-masing senyawa aktif campuran senyawa
obat.
Keburukan dari teknik ini mungkin hanya pada prosedur pembuatan
lempengnya yang memerlukan tambahan waktu, kecuali bila telah tersedia
lempeng yang diproduksi secara komersial.

15
2.9 Kelebihan dan Kekurangan Kromatografi Lapis Tipis
Beberapa kelebihan KLT yaitu:
1.       KLT lebih banyak digunakan untuk tujuan analisis.
2. Identifikasi pemisahan komponen dapat dilakukan dengan pereaksi
warna, fluoresensi, atau dengan radiasi menggunakan sinar ultraviolet.
3. Dapat dilakukan elusi secara mekanik (ascending), menurun
(descending), atau dengan cara elusi 2 dimensi.
4. Ketepatan penentuan kadar akan lebih baik karena komponen yang
akan ditentukan merupakan bercak yang tidak bergerak.
5. Hanya membutuhkan sedikit pelarut.
6. Biaya yang dibutuhkan terjangkau.
7. Jumlah perlengkapan sedikit.
8. Preparasi sample yang mudah
9. Dapat untuk memisahkan senyawa hidrofobik (lipid dan hidrokarbon)
yang dengan metode kertas tidak bisa (Gandjar dan Rohman, 2007).
Adapun kekurangan KLT  yaitu:
1.      Butuh ketekunan dan kesabaran yang ekstra untuk mendapatkan
bercak/noda yang diharapkan.
2.      Butuh sistem trial and eror untuk menentukan sistem eluen yang
cocok.
3.      Memerlukan waktu yang cukup lama jika dilakukan secara tidak tekun

16
 BAB III
PENUTUP
3.1. Kesimpulan
1. Kromatografi biasanya juga di artikan sebagai teknik pemisahan campuran
berdasarkan perbedaan kecepatan perambatan komponen dalam medium
tertentu. Kromatografi lapis tipis merupakan salah satu metode
analisis kualitatif dari suatu sampel yang ingin dideteksi dengan memisahkan
komponen - komponen sampel berdasarkan perbedaan kepolaran
2. Prinsip kerja kromatografi lapis tipis adalah terjadinya hubungan
kesetimbangan antara fase diam dan fasa gerak, dimana ada interaksi antara
permukaan fase diam dengan gugus fungsi senyawa organik yang akan
diidentifikasi yang telah berinteraksi dengan fasa geraknya. Semakin dekat
kepolaran antara senyawa dengan eluent maka senyawa akan semakin terbawa
oleh fase gerak tersebut, sesuai dengan prinsip “like dissolve like”.
3. Pada prosedur pengerjaannya Pelarut (fase gerak) perlahan-lahan bergerak
naik, komponen-komponen yang berbeda dari campuran berjalanan pada tingkat
yang berbeda dan campuran dipisahkan memiliki warna yang berbeda.Pada
kromatografi, komponen-komponennya akan dipisahkan antara dua buah fase
yaitu fase diam dan fase gerak.Identifikasi pemisahan komponen dapat dilakukan
dengan pereaksi warna, fluorosensi atau dengan radiasi menggunakan sinar
ultraviolet, Dapat untuk memisahkan senyawa hidrofobik (lipid dan hidrokarbon)
yang dengan metode kertas tidak bisa, dan masih banyak lagi keuntungan lainnya.
4. Kromatografi Lapis Tipis (KLT) dapat diterapkan dalam menganalisis
adanya senyawa paracetamol dan kafein dalam sediaan obat paten seperti
poldanmig.
3.2 Saran
Diharapkan agar seluruh praktikan mematuhi tata tertib yang telah
ditentukan dan selalu menerapkan kedisiplinan dalam melakukan pengamatan
agar hasil dapat sesuai dengan yang diharapkan

17
 DAFTAR PUSTAKA

Gandjar, Ibnu Gholib dan Abdul Rahman. 2008. Kimia Farmasi Analisis. Pustaka

Pelajar : Yogyakarta.

Gritter J.R., James, M.B., (1991), “Pengantar Kromatografi”, Penerbit ITB,

Bandung.

Harborne.1987.”Metode Fitokimia”. Bandung : Penerbit ITB.

Kantasubrata, Julia. 1993. Warta Kimia Analitik Edisi Juli. Situs Web Resmi
Kimia Analitik : Pusat Penelitian Kimia LIPI

Khopkar. 2007. “Konsep Dasar Kimia Analitik”. Jakarta : UI-Press.

Lide, David. 2001. Handbook of Chemistry And Physic. Copyright CRC Press
LLCRudi,L. 2010.Penuntun Dasar-Dasar Pemisahan Analitik. Universitas
Haluoleo. Kendari

Lipsy, P. 2010. Thin Layer Chromatography Characterization of the Active

Ingredients in Excedrin and Anacin. USA: Departement of Chemistry and
Chemical Biology, Stevens Institute of Technology.

Munson, James,W. 1991. “Analisis Farmasi”. Airlangga University Press:

Surabaya.

Roy J. Gritter, James M. Bobbit, Arthur E. S., 1991. Pengantar Kromatografi.

Penerbit ITB. Bandung.

Roth, Herman, J., Blaschike, G., 1988. “Analisis Farmasi”. Gadjah Mada
University Press: Yogyakarta.

Rohman, Abdul. 2009. “Kromatografi untuk Analisis Obat”. Graha Ilmu : Jakarta.

Sudarmadji, S., dkk, 2007. Analisa Bahan Makanan dan Pertanian. Penerbit

Liberty: Yogyakarta.

18
Sofia, Lenny. 2006. Isolasi dan Uji Bioaktifitas Kandungan Kimia Utama Puding
Merah denganMetoda Uji Brine Shrimp. USU Repository. Sumatera
Utara.

Speight, James. G. 2006. The Chemistry and Technology of Petroleum. Taylor &
Francis Group: LLC.

Soebagio. 2002. “Kimia Analitik II”. Malang : JICA.

Sienko, Plane and Marcus, 1984, “Experimental Chemistry 6th Edition”. Mc Graw
Hill Book Co: Singapore.

Sudjadi. 1986. “Metode Pemisahan”. UGM Press: Yogyakarta.

Surmono, Rb. 1986. “Proses Aproasi”. Universitas Pancasila: Jakarta.

Sastrohamidjojo, Dr.H. 1985. ”Kromatografi”. Penerbit Liberty: Yogyakarta.

19