HPLC,

High Performance
Liquid Chromatography
By:
Nur Wahid, ST.
Kenapa harus HPLC?
 Definisi
• Teknik pemisahan berdsarkan sifat fisika dan kimia
(kepolaran, ukuran partikel, titik didih) disebabkan
interaksi antara fasa diam (padat), fasa gerak (cair), dan
sampel.
• Perbedaan distribusi komponen antara fase diam dan
fase gerak menyebabkan terjadinya pemisahan.
Semakin lama terdistribusi dalam fase diam semakin
lama waktu retensinya.
• Untuk penetapan kadar senyawa non volatile dan
senyawa yang mempunyai berat molekul tinggi dari
campuran dengan senyawa-senyawa lain tanpa
dilakukan pemisahan terlebih dulu.
Dasar Prinsip
 Dasar Prinsip

Fase
Gerak
instrumentasi
instrumentasi
 Fase Gerak
• Berupa cairan yaitu campuran 2 atau lebih
pelarut sehingga dapat terjadi pemisahan zat-
zat dalam campuran senyawa berdasarkan
koefisien partisi dari zat-zat dalam campuran
senyawa tersebut dalam pelarut.

• Berdasarkan komposisi fasa geraknya:

- isokratik → komposisi fasa gerak selama
analisa tidak berubah
- gradient → komposisi fasa gerak selama
berubah-ubah selama analisa
 Fase gerak
• Water/buffer
- buffer phosphate
- buffer acetat

• Pelarut organik
- methanol
- Acetonitrile
- dll
Pengaruh Pemilihan Fase gerak yang berbeda
Pengaruh Pemilihan Fase gerak yang berbeda
 Fase gerak
• Syarat Fase Gerak.
Bisa melarutkan sampel.
Kemurnian tinggi(mendekati 100%)
Viscositasnya rendah
Sesuai dengan detektor
Tidak bereaksi dengan sampel dan fase diam
Tidak merusak sampel dan fase diam
Mudah didapatkan
Tidak beracun
Titik didihnya sedang
Mudah dipisahkan dari sampel
Memiliki perbedaan koefisien distribusi dalam sampel
 Pompa
• Mendorong fase gerak masuk ke sistem
dan menaikkan tekanan sistem
Pompa
Pompa
Double piston
• Menggunakan 2 piston kanan
dan kiri dengan flow line
parallel

• Fluktuasi pressure sangat

rendah

• Umum digunakan untuk high

pressure gradient
Tandem Piston

• Terdapat 2 piston dengan

flow line seri

• Kestabilan tidak sebaik

double piston

• Biasa digunakan untuk

analisa rutin
 Injektor
• Berfungsi sebagai tempat masuk sampel ke
dalam sistem HPLC
• Sampel harus berbentuk cair atau larutan
• Sampel berupa senyawa yang akan dipisahkan
dan ditentukan kadarnya dimasukkan kedalam
lubang injektor pada suhu ruang
• Sampel yang di injeksikan harus disaring dulu
dengan penyaring miliphore dengan ukuran 0,2-
0,45µm yang dipasang pada spuit injeksi
• Sampel yang di injeksikan biasanya konsentrasi
antara 10-100µg/ml dengan volume yang di
injeksikan 20-30µl
 Manual Injektor
• Atur injektor pada posisi load
• Masukkan syringe
• Injek sampel
• Putar ke posisi inject
• Lepaskan syringe
• Cuci tempat untuk injeksi
Injector Rheodhyne
• Biasanya ukurannya 20-30uL
 Manual Injektor

Injector Rheodhyne
 Manual Injektor
• Injeksi menggunakan microsyringe
• Ujung microsyringe tidak runcing(tumpul)
• Ukuran microsyringe 50-250 uL
Manual Injektor
Auto Injektor
 Kolom Oven
• Temperature kolom
mempengaruhi waktu
retensi suatu peak

• Syarat:
~ keseragaman
temperature yang baik
~ mempunyai kestabilan
suhu yang baik
~ ketepatan suhu yang
baik
Suhu bisa diatur 40-85 oC
 Kolom
• Penampang terbuat
dari stainless steel
dan teflon

• tahan tekanan tinggi

• Ukuran partikel
kolom 3-10µm
 Syarat Fase Diam
• Inert (Tidak bereaksi dengan sampel/fase gerak)
• Tidak larut dalam fase gerak
• Tidak berwarna
• Memiliki gugus fungsi aktif
• Memberikan aliran yang baik terhadap fase gerak.
• Stabil dan tidak mudah rusak
• Tahan tekanan tinggi
• Memberikan interaksi terhadap komponen dalam
sampel
 Mode pemisahan
1. Reverse phase
• Fase diam yang digunakan umumnya bersifat non polar
(misal C18, C8, C3, phenyl,dll).
• Fase gerak lebih polar daripada fase diamnya, misal air
(buffer) + air-pelarut organic (methanol, acetonitrile)
• Metode pemisahan yang paling banyak digunakan,
mencapai 90% dari keseluruhan metode analisa HPLC.
• Dapat digunakan untuk analisa senyawa polar, non
polar, ionizable, dan molekul ion.
 Mode pemisahan
2. Normal phase / Adsorption
• Fase gerak nonpolar (misal hexane, iso-
octane, methylene chloride, ethyl acetate
• Fase diam polar, misal silica gel,
cyanopropyl-bonded, amino-bonded
• Teknik Ini Jarang digunakan, hanya
sekitar 10% analisa HPLC yang memakai
teknik ini.
• Cocok untuk analisa senyawa sejenis
isomer Tocopherol
 Mode pemisahan
3. Ion Exchange
• Kolom mempunyai gugus ion, contoh:
sulfonic, tetraalkylammonium.
• Dan fase gerak biasanya adalah larutan
buffer, contoh:phosphate, formate,dll.
• Cocok untuk pemisahan anion dan kation
organik/anorganik dalam pelarut air,
protein dan asam amino
 Mode pemisahan
4. Size Exclusion
Tidak ada interaksi sampel dengan fase diam, komponen
dalam sampel terpisah berdasarkan ukuran karena
melewati pori dalam fase diam.
 Detector
• Detector Ultraviolet/Visible (UV-VIS)
• Detector Photodiode Array (PDA)
• Detector Fluorescence (RF)
• Detector Konduktivitas (CDD)
• Detector Refractive Indeks (RID)
• Detector Elektrokimia (ECD)
• Detector Spektromassa (MS)
 Detector UV-VIS
• Mendeteksi pada panjang gelombang tertentu, dimana
pada panjang gelombang tersebut pelarut sedikit sekali
atau tidak dapat menyerap sinar, sedangkan senyawa
yang dipisahkan dapat menyerap sinar dengan kuat
• Sampel melewati sebuah flow cell yang transparan
kemudian dilewati sinar UV dengan panjang gelombang
spesifik
• 2 jenis detector UV:
~ Photodiode
Detector UV dengan 1atau 2 panjang gelombang
pada range 190-700nm
~ Photodiode Array
Analisa dapat dilakukan pada beberapa panjang
gelombang dalam range 190-700nm
 Detector UV-VIS
~ Photodiode
detector UV dengan 1atau 2 panjang gelombang
pada range 190-700nm
 Detector UV-VIS
~ Photodiode Array
Analisa dapat dilakukan pada beberapa panjang
gelombang dalam range 190-700nm
 Detector Fluoresensi
• Untuk analisa zat yang membutuhkan
sensitivitas tinggi yang tidak terbaca oleh
detector UV-Vis (ppb level)
• Menggunakan lampu Xenon dan detector
Photomultiplier
• Contoh analisa: residu antibiotik, residu
pestisida, dll
Detector Fluoresensi
 Detector Refractive Indeks (RID)
• Untuk analisa karbohidrat
• Menggunakan Detector Silicon Photocell
• Contoh analisa: sukrosa, fruktosa, dll
 Analisa Kualitatif
• Untuk menentukan jenis komponen dalam
suatu sampel.
• Perbandingan waktu retensi antara larutan
standar dan sampel dengan metode
analisa yang sama (parameter HPLC yang
sama)
Analisa Kualitatif
Analisa Kualitatif
 Analisa Kuantitatif
• Menentukan kadar suatu target dalam
sampel
• Perbandingan luas area atau tinggi
puncak dari kromatogram sample
terhadap standard
Analisa Kuantitatif
 Eksternal Standar
• Menggunakan satu deret standar untuk
menentukan target dalam sampel
• Menggunakan deret standar dan harus
memenuhi hukum lambert beer
conc std 10 ppm luas area 10000
luas area spl 5000 conc spl 5 ppm

Conc Spl [Xspl] = Luas Area Spl [Yspl]

X Conc Std [Xstd]
Luas Area Std [Ystd]
 Internal Standar
• Menggunakan larutan internal standar untuk
menentukan kadar target dalam sampel
• Internal standar harus mempunyai sifat yang mirip
dengan target
• Membandingkan interaksi ISTD terhadap sampel
dengan interaksi ISTD terhadap larutan standar.
• Kesalahan volume penyuntikan dapat diketahui
• Contoh: analisa methyl paraben, internal standar etil
paraben
Conc Spl [Xspl] = Luas Area Spl [Yspl] / Luas Area ISTD [Yistd]
X Conc Std [Xstd]
Luas Area Std [Ystd] / Luas Area ISTD [Yistd]
 Area Normalisasi
• Perbandingan luas area target dengan
semua luas area yang terdeteksi
• Semua komponen harus terbaca sebagai
peak
• Contoh: analisa minyak atsiri
Conc Spl [Xspl] = Luas Area Target
X 100%
Luas Area Total Peak yang terdeteksi
Pemilihan Methode Dalam HPLC
Preparasi dalam
Analisa HPLC
Preparasi Sampel
 Preparasi Fase Gerak/Eluen
• High Quality
• Buffer
• Filtrasi
• Degassing
Preparasi Sampel
Preparasi Sampel
Preparasi Sampel
Preparasi Sampel
Preparasi Sampel
Preparasi Sampel