Inhibitor Pentavalen Berbasis Protein dari Sub Unit Cholera Toxin B-

Abstrak

Racun protein yang dihasilkan oleh bakteri merupakan penyebab dari banyak penyakit diare
yang mengancam jiwa. Banyak dari racun ini, termasuk toksin kolera (CT), masuk ke sel
dengan terlebih dahulu mengikat glikolipid di dalam membran sel, lalu menghambat interaksi
protein / karbohidrat multivalen ini dan akan mencegah racun memasuki sel dan
menyebabkan diare. Di jurnal ini, menjelaskan bahwa modifikasi spesifik protein sangat
cocok dalam ukuran dan valensi untuk target toksin, dan menyediakan rute yang sesuai ke
multivalen inhibitor sehingga menjadi efektif. Jurnal ini juga menampilkan neoglikoprotein
pentavalen yang menghasilkan potensi penghambatan (IC50) dari 104 pm untuk CT B-
subunit (CTB), yang merupakan inhibitor pentavalen paling kuat untuk target yang
dilaporkan. Kompleksasi inhibitor dan CTB menghasilkan heterodimer protein. Strategi
penghambatan ini dapat berpotensi dan banyak diterapkan ke banyak reseptor multivalen dan
juga membuka peluang baru untuk strategi perakitan protein.

Introduction
Banyak virus, bakteri, dan racun dari protein melekat pada sel target dengan
mengikat karbohidrat yang ada pada permukaan sel yang spesifik. Penyakit diare yang
diinisiasi dengan cara seperti ini sekitar dua juta kematian setiap tahun [1]. Misalnya, kolera
yang disebabkan oleh racun protein AB5 yang memiliki racun tunggal sub unit A yang terkait
dengan lima B-subunit tidak beracun (CTB), yang merupakan reseptor pentamerik untuk
GM1 glikolipid dan ditemukan di permukaan sel-sel epitel usus. [2] Pengikatan multivalen
antara CTB dan lima salinan ligan GM1 memfasilitasi masuknya toksin ke dalam sel
endocytosis. Multivalensi adalah fitur umum dari adhesi permukaan sel dan dengan demikian
menyediakan fokus utama untuk menciptakan inhibitor protein pengikat karbohidrat,
termasuk CTB. [3] Struktur polimer dan dendrimers dengan kedua residu galactosyl atau
GM1 yang lebih kuat mengikat ligan oligosakarida (GM1) telah menunjukkan peningkatan
potensial dalam kegiatan yang multivalensi. [4] Struktur berbentuk bintang Pentavalent yang
cocok dengan valensi dan posisi kelompok ligan untuk CTB terbukti menjadi beberapa
inhibitor yang paling sukses. Sebuah inti pentacyclen dengan ligan galaktosa digunakan oleh
Fan et al untuk menghasilkan inhibitor dengan nilai IC50 yang dilaporkan dari 1,4 µm. [5]
Pendekatan modular mereka menunjukkan kecocokan, karena tepatnya ukuran dan jarak
ligan untuk mengikat situs CTB dapat mengoptimalkan potensi penghambatan. [5b, 6]. Studi
terbaru lainnya telah menggunakan ligan GM1os pada kedua corannulene [7] dan calixarene
core. [8] Struktur pentavalen memberi nilai IC50 hingga 5 nm dan 450 pm. Sebuah inti
karbohidrat pentamerik juga telah digunakan dalam ligan Starfish yang sangat efektif untuk
shiga-like toksin. [9] Sementara ligan pentavalent sintetis telah terbukti sebagai inhibitor
yang efektif, sintesis sebesar (diameter> 5 nm), scaffolds multivalen menghambat aplikasi
dalam skala besar. Di sini kami melaporkan inhibitor multivalen untuk toksin kolera,
berdasarkan protein CTB mutan yang tidak aktif yang dimodifikasi dengan ligan GM1os
(Gambar 1). Upaya sebelumnya untuk memperkenalkan gula di lokasi yang ditentukan pada
pengulangan ankyrin protein [10] dan protein barstar [11] menyebabkan ligan dan inhibitor
dari lektin tumbuhan. Namun, karena tidak ada upaya yang dibuat untuk mencocokkan
ukuran dan jarak dari ligan untuk mengikat situs, senyawa multivalen ini hanya menyebabkan
perangkat tambahan yang sederhana dalam aktivitas / agregasi lectin, yang mungkin tidak
diinginkan. Dalam contoh yang dilaporkan di sini, inhibitor pentavalen dicocokkan dengan
ukuran dan valensi dari target protein CTB, yang mengarah ke kompleks dan penghambatan
yang kuat. Kami menggunakan CTB mutan protein yang tidak aktif sebagai perancah, setelah
dimodifikasi dengan karbohidrat, ligan pentavalen yang dihasilkan harus memberikan
kecocokan yang tepat pada kelompok ligan dengan jarak dan konfigurasi pengikatan situs
pada tipe CTB (Gambar 1).

Gambar 1. Persiapan strategi untuk rekayasa ulang protein CTB

inhibitor neoglikoprotein pentavalen untuk toksin kolera. N termini dari mutan CTB tak
berikat W88E dioksidasi untuk menghasilkan aldehida menjalani ligasi oksime dengan ligan
karbohidrat yang mengandung fungsi aminooxy. Neoglikoprotein yang dihasilkan memiliki
kelompok ligan selanjutnya disusun dengan jarak optimal untuk mengikat protein toksin
kolera. Struktur 3D CTB (kode PDB: 3CHB), [24] situs pengikatannya ditandai dengan putih,
dan residu treonin N-terminal ditandai dengan panah hitam.

CTB homopentamer memiliki lima residu treonin N-terminal yang terletak pada
permukaan protein ke arah ligand-binding face dan jarak yang sama sekitar protein antara
situs pengikatan GM1. Dalam hal ini, residu mengandung kelompok alkohol amino vicinal
yang unik, yang bisa secara selektif dikonversi oleh oksidasi ke aldehida sebelumnya melalui
reaksi dengan oxyamine. [12] Modifikasi protein perancah di situs-situs ini dengan lima ligan
GM1os akan menghasilkan ligan pentavalent. Ligan GM1os disiapkan dengan terlebih
dahulu mensintesis Bocprotected aminooxy alkyne 3 (Skema 1) menurut prosedur yang
dilaporkan. [14] GM1 azide 2 disiapkan menggunakan pendekatan chemo-enzymatic [15]
sebelum ligasi terhadap aminooxy alkuna (3) menggunakan siklikal alkuna azik tembaga-
katalis (CuAAC) pada suhu kamar dengan waktu pengadukan 48 jam. Upaya dilakukan untuk
menggunakan bantuan gelombang mikro CuAAC untuk sintesis, [16] tetapi dalam kasus ini
terbukti tidak berhasil. Setelah pemurnian dengan kolom kromatografi fase balik, GM1os
ligan 4 diisolasi. Kelompok Boc dihapus dengan TFA untuk membentuk oxyamine 5,
langsung sebelum tanpa pemurnian lebih lanjut (supaya gugus aminooksi yang sangat reaktif
tetap ada). Untuk menciptakan perancah protein, mutan yang tidak mengikat CTB diperlukan.
Berdasarkan penelitian Jobling dan Holmes, [17] residu triptofan (W88) dalam pengikatan
GM1 diubah menjadi residu asam glutamat oleh situs-diarahkan mutagenesis. Protein mutan
CTB yang dihasilkan (W88E) tidak lagi mampu mengikat ke GM1OS (Gambar S3 dalam
Informasi pendukung). Kelima vicinal amino N-terminal kelompok alkohol di W88E
kemudian dioksidasi dengan NaIO4 (Skema 1) untuk memberikan aldehida, yang diamati
dalam bentuk terhidrasi W88E oleh ESI-MS (ditemukan: 11557.8 Da; calcd: 11 557.9 Da).
Protein teroksidasi kemudian dibiarkan bereaksi dengan oxyamine 5 yang terlindungi dengan
kehadiran anilin pada pH 7. Aniline dikenal sebagai katalis oksit yang efektif pada pH 4,5,
[18] namun, sebagai penyangkalan protein CTB dalam kondisi asam, nilai pH netral
digunakan dan reaksinya masih berlanjut sampai 24 jam.
 Skema 1. a) Sintesis oligosakarida
GM1 yang dimodifikasi dengan
oksime ligan 5; b) Oksidasi N-
terminal dari protein CTB W88E
dan ligasi dengan ligan 5.

Ligan Pentavalent W88E (GM1)

dimurnikan dengan Kromatografi
eksklusi (SEC) dan ESI-MS yang
mengkonfirmasi bahwa protein
yang dimodifikasi memiliki
massa 12844,5 Da (calcd:
12844.4 Da; Gambar S1). SDS-
PAGE menegaskan bahwa
modifikasi tidak mengganggu
bentuk pentameric dari protein
dan tidak ada agregasi protein
yang diamati (Gambar S1). Uji
lektin terkait-enzim (ELLA)
dilakukan untuk menentukan potensi penghambatan neoglikoprotein. [7,8]. Kemampuan
CTB untuk mengikat ke plat mikrotiter berlapis-GM1 dinilai di berbagai konsentrasi
inhibitor. Ligan Pentavalent W88E (GM1) mempunyai nilai IC50 rendah dari 104 pm
(Gambar 2 dan Tabel 1), sehingga menjadikannya ligan pentavalent paling kuat dilaporkan
sejauh ini. Nilai IC50 ini sesuai dengan peningkatan 5100 kali lipat dibandingkan monovalent
GM1os 1, atau peningkatan 14300 kali lipat dibandingkan ke monovalen GM1 azide 2.
Protein W88E yang tidak dimodifikasi sebagai kontrol menunjukkan tidak ada penghambatan
pengikatan CTB ke GM1- microtiter yang dilapisi.

Kalorimetri titrasi isotermal (ITC) digunakan untuk menganalisis interaksi

antara inhibitor berbasis protein pentavalent W88E (GM1) dan CTB tipe liar. W88E (GM1)
dititrasi menjadi larutan CTB dan stoikiometri mengikat yang diharapkan dari satu ligan
GM1os per situs pengikatan diamati, yang konsisten dengan model pengikatan di mana
W88E (GM1) membentuk kompleks heterodimer protein dengan CTB. Namun, Kd jelas 30
nm terdeteksi, mirip dengan yang dari GM1 azide monovalen 2, yang memiliki K d dari 56 nm
(Gambar S3 dan Tabel S1), dan bahwa dari GM1os 1 (43 nm), yang digunakan dalam
penelitian sebelumnya. [20] Kesamaan antara afinitas ligand mono dan pentavalent kontras
dengan peningkatan afinitas yang dilaporkan untuk sistem multivalen lainnya. [21] Namun,
hasilnya sejalan dengan penelitian kami sebelumnya dendrimers berbasis GM1, [22] di mana
disimpulkan bahwa ketidakcocokan dalam valensi antara inhibitor dimer atau tetrameric dan
protein pentavalent menghasilkan mekanisme agregasi inhibisi. Sebaliknya, Fan dan rekan
kerja melaporkan bahwa ligan pentavalent mereka hanya memberikan 1: 1 kompleks dalam
dynamic light scattering (DLS) dan studi kristalisasi, dan tidak ada agregat yang lebih besar
yang diamati. [23] Oleh karena itu, DLS dan analitik ultrasentrifugasi (AUC) percobaan
digunakan untuk menentukan apakah 1: 1 kompleks atau agregat yang lebih besar telah
terbentuk antara CTB dan W88E (GM1).
DLS pertama kali digunakan untuk menentukan ukuran rakitan (Gambar 3 a). Struktur
kristal CTB menunjukkan pentamer memiliki diameter 6,5 nm dan kedalaman 3,5 nm. [24]
Pengukuran ini konsisten dengan diameter hidrodinamika eksperimental 5,6 nm. Pada rasio
1: 1 CTB dan W88E (GM1), DLS menunjukkan puncak tunggal pada 8,4 nm. Dimer wajah-
toface akan memiliki dimensi 6,5 nm setidaknya 7 nm, yang sesuai dengan hasil dari DLS.
Meningkatkan rasio CTB ke W88E (GM1) menjadi 5: 1 memberikan hasil yang serupa tanpa
agregat yang lebih besar. Pengamatan dari eksperimen DLS menunjukkan bahwa hanya
protein heterodimer dari pentamers yang terbentuk.
Kecepatan sedimentasi AUC digunakan untuk mempelajari lebih lanjut keadaan
oligomerisasi kompleks protein yang dibentuk oleh ikatan ligan. Pada rasio 1: 1 CTB dan
W88E (GM1), AUC menunjukkan dua puncak dengan koefisien sedimentasi 6,3 S dan 3,6 S,
sesuai dengan massa sekitar 110 kDa dan 50 kDa, masing-masing (Gambar 3 b), yang
konsisten dengan prediksi massa dari dimer dari pentamers protein dan pentamer tunggal.
Puncak yang lebih kecil pada 3,6 S kemungkinan karena konsentrasi dari dua komponen
tidak persis sama. Ketika konsentrasi ligan W88E (GM1) menurun, sehingga CTB sekarang
berlebih pada rasio 5: 1, puncak untuk protein pentamer mendominasi, tetapi puncak untuk
dimer dari pentamer masih terlihat. Hasil ini menunjukkan bahwa bahkan dengan kelebihan
CTB, satu-satunya kompleks protein yang diamati adalah heterodimer dari pentamers protein.
Tidak ada puncak yang lebih besar yang diamati dalam percobaan AUC dan ada perubahan
yang dapat diabaikan dalam absorbansi protein setelah percobaan AUC, menunjukkan bahwa
tidak ada protein yang hilang melalui formasi dan pelleting dari agregat besar. [22] Namun
demikian, masih mungkin bahwa pada konsentrasi inhibitor yang digunakan dalam percobaan
biofisik ini (sekitar 50 000 kali lebih tinggi daripada konsentrasi IC50 untuk W88E (GM1)
dalam ELLA), agregat acak awalnya dapat terbentuk dengan afinitas pengikatan sederhana,
seperti yang diamati pada percobaan ITC kami. [25] Jika agregat tersebut diatur ulang lebih
lambat untuk membentuk kompleks 1: 1 termodinamika yang lebih disukai yang diamati oleh
DLS dan AUC, [26] maka proses terakhir ini mungkin akan tidak terdeteksi selama
percobaan ITC, karena perubahan entalpi net untuk reorganisasi agregat akan mungkin sangat
kecil. Diharapkan bahwa 1: 1 kompleks harus terbentuk langsung pada konsentrasi yang lebih
rendah dari inhibitor W88E (GM1) yang digunakan dalam ELLA.
SDS-PAGE dilakukan pada sampel AUC menunjukkan band untuk protein
pentameric dan dimer dari pentamers dalam rasio yang sama diamati dalam percobaan AUC
untuk 1: 1 dan 5: 1 campuran CTB dan W88E (GM1) (Gambar S1). Oleh karena itu, interaksi
membentuk heterodimer protein cukup kuat untuk bertahan hidup kondisi denaturasi SDS-
PAGE
Kesimpulannya, kombinasi DLS, AUC, dan SDSPAGE menegaskan bahwa ligan
pentavalent berbasis protein W88E (GM1) terikat ke CTB dalam rasio 1: 1, membentuk
heterodimer protein. Dengan nilai IC50 dari 104 pm, inhibitor ini adalah struktur pentavalent
paling kuat yang dijelaskan sejauh ini. Dengan menggunakan perancah protein yang sesuai
dengan ukuran dan jarak antara situs pengikatan dan ligan, adalah mungkin untuk
mengendalikan struktur kompleks yang terbentuk. [3c] Dengan meningkatnya minat pada
perakitan protein yang dimediasi ligan, adalah mungkin bahwa glikoprotein yang disesuaikan
dari jenis ini juga dapat digunakan untuk persiapan bahan protein berstrukturnano. [27]
Selanjutnya, inhibitor berbasis protein yang dilaporkan di sini juga memiliki keuntungan
yang relatif mudah untuk disintesis. Protein jenis ini dapat diproduksi pada skala industri [13]
dan reaksi untuk memodifikasi protein itu sederhana. Sementara sintesis dari bagian
karbohidrat itu sendiri tidak sepele, [15] kombinasi penggunaan modifikasi protein dan
sintesis oligosakarida enzimatik menyediakan strategi yang menarik untuk sintesis
biofarmasi. Pekerjaan ini menunjukkan strategi umum untuk penciptaan inhibitor multivalen
interaksi protein / karbohidrat.
Tabel 1. Hasil Potensial Penghambat Enzit Lectin-Linked Enzyme (ELLA).
[a] Saat fitting kurva dilakukan dengan log [inhibitor] sebagai nilai x, kesalahan pemasangan
untuk nilai IC50 menjadi asimetris tentang mean dan dihilangkan untuk kesederhanaan.
[b] Potensi diukur relatif terhadap monovalen GM1 azide 2.
[c] Tidak ada hambatan yang terdeteksi

Figure 2. Enzyme-linked lectin assay (ELLA) indicates the inhibitory potential of

W88E(GM1) and analogous monovalent ligands 1 and 2. Error bars indicate the standard
error of three measurements.