Nadilla islami

1704047

Bioteknologi

Resume :

“ RFLP “

Pengertian :
- Marka molekuler yang menggunakan enzim restriksi dalam mengidentifikasi
sekuensi-sekuensi DNA.
- Salah satu teknik pertama yang secara luas digunakan untuk mendeteksi variasi
pada tingkat sekuens DNA.
Fungsi :
Sebagai penduga variasi DNA. RFLP bersifat kodominan sehingga dapat mendeteksi
adanya heterozigositas dan tidak diperlukan informasi sekuens target.
Prinsip :
Enzim restriksi akan memotong DNA pada sekuens yang spesifik dimana hasil
pemotongan tersebut kemudian dianalisa dengan elektoforesis gel agarosa.
Metoda :
1. Isolasi DNA
a. Pelisisan
- Proses perusakan atau penghancuran membran dan dinding sel.
- Dengan cara enzimatik, kimiawi, fisik.
b. Sentrifugasi
Memisahkan substansi berdasarkan berat jenis molekul dengan sehingga
substansi yang lebih berat akan berada di dasar, sedangkan substansi yang
lebih ringan akan terletak di atas.
c. Ekstraksi
- Digunakan chelating agent seperti ethylenediamine tetraacetic acid
(EDTA) yang berperan menginaktivasi enzim DNase yang dapat
mendenaturasi DNA yang diisolasi.
 d. Purifikasi
Bertujuan untuk membersihkan nukleus sel dari kontaminan seperti senyawa
sekunder (fenol) dan polisakarida, RNA dan juga protein.
e. Sentrifugasi
Berfungsi untuk memisahkan senyawa DNA dari campuran material dan
komponen intraceluler yang mengandung larutan kompleks berupa RNA,
protein, lemak dan karbohidrat.
f. Presipitasi
Presipitasi (pemekatan) DNA dilakukan menggunakan isopropanol dingin
yang bertujuan agar DNA tersebut mengendap/mengumpul sekaligus
memisahkannya dari garam-garam mineral sisa.
2. Pemotongan dengan Enzim Restriksi
Enzim restriksi diisolasi dari bakteri. Enzim restriksi biasanya terdapat dalam
kombinasi dengan enzim pemodifikasi lain yang melindungi DNA-nya sendiri
dari pemotongan, yaitu DNA-metil transferase (dnmt).
Hasil pemotongan
Pemotongan enzim restriksi akan menghasilkan potongan yaitu ujung
kohesif (sticky end) dan ujung rata (blunt end).
Faktor yang mempengaruhi kerja enzim restriksi
- Suhu
- pH
- Kekuatan ionik
- Pengaruh kation
- Waktu reaksi
- Komposisi Buffer
- Lama Inkubasi
Elektroforensis Gel
Saat elektroforesis berlangsung, protein akan bergerak dari elektroda negatif
menuju elektroda positif sampai pada jarak tertentu pada gel tergantung pada
berat molekulnya.
Transfer DNA
Salah satu metode tahapan transfer DNA ke membran nitroselulosa yang
berdasarkan pada Prinsip Kapilaritas.
3. Hibridisasi
- Proses identifikasi gen-gen hasil analisis RFLP dengan restriksi enzim yang
sesuai dan diidentifikasi dengan fragmen gen target yang spefisifik yang telah diberi
label baik dengan radioaktif maupun non radioaktif.
- Proses :
a. Proses denaturasi atau pemisahan dua rantai asam nukleat yang
komplementer.
b. Proses denaturasi atau perpaduan kembali dua rantai asam nukleat.
- Prinsip :
Prinsip metode hibridisasi DNA sederhana. Sebelum hibridisasi, dilakukan
prehibridisasi dengan larutan denaturan.
- Deteksi DNA
a. Merupakan tahap lanjutan dari proses hibridisasi DNA yang menggunakan
pelacak/probe.
b. Digunakan Autoradiogram untuk melihat lokasi sinyal DNA.
- Aplikasi RFLP
a. Mendeteksi diversitas genetik, hubungan kekerabatan, sejarah
domestifikasi, asal dan evolusi suatu spesies, aliran gen dan seleksi.
b. Mengidentifikasi perbedaan pada tingkat populasi, spesies, atau individu
A.
c. Pengamanan gen-gen target yang akan diekspresikan