Dosen Pengampu
Dr. drh. Heru Nurcahyo, M.Kes
Disusun Oleh
Kelompok 1
2013
BAB I
PENDAHULUAN
mengandung zat gizi yang berkualitas tinggi dibandingkan tanaman biasa, serta lebih
tahan terhadap hama penyakit dan tekanan lingkungan. Teknologi DNA rekombinan
diperolehnya produk gen tertentu dalam waktu lebih cepat dan jumlah lebih besar
isolasi DNA vektor, penyisipan fragmen DNA ke dalam vektor untuk menghasilkan
reisolasi molekul DNA rekombinan dari sel inang, dan analisis DNA rekombinan.
Pada makalah ini secara khusus akan membahas mengenai prinsip dasar dalam
1. Generasi fragmen DNA dan pemilihan bagian yang diinginkan dari DNA
transfer gen, dan strategi dalam kloning gen (Chakrapani dan Satyanarayana,
2007).
2
1. Bahan Molekuler dalam Rekayasa Genetika
yang ditemukan oleh Werner Arber dan Hamilton Smith tahun 1960 dari
mikroba yang memotong DNA untai ganda. Enzim restriksi memotong DNA
pada tempat yang tepat (bukan sembarang tempat). Bagian yang dipotong oleh
enzim ini dinamakan sekuens pengenal. Suatu sekuens pengenal adalah urutan
nukleotida (urutan basa) tertentu yang dikenal oleh enzim restriksi sebagai
tempat atau bagian yang akan dipotongnya (Tjahjoleksono, 2010). Berikut ini
....G
C-T-T-A-A
....G
....C-C-T-A-G
....*G-G
.... C-C
...A
....T-T-C-G-A
3
Noti 5’....G-C-G-G-C-C-G-C....3’ G-G-C-C-G-C...
(Nocardia otitidis) C-G...
3’....C-G-C-C-G-G-C-G....5’
...G-C
...C-G-C-C-G-G...
Catatan:tanda(-) merupakan daerah yang dipotong. Tanda (*) adalah produk dengan ujung tumpul
sedangkan yang lainnya adalah produk dengan ujung lancip/lengket
Salah satu enzim restriksi ini adalah enzim EcoRI yang telah diisolasi
pertama kali oleh Herbert Boyer pada tahun 1969 dari bakteri Escherichia coli
bagian yang urutan basanya GAATTC (sekuens pengenal bagi EcoRI). Pada
DNA untai ganda, sekuens GAATTC ini akan berpasangan dengan sekuens
yang sama tetapi berlawanan arah. Enzim EcoRI ini memotong setiap untai
dari untai ganda tersebut pada bagian antara G dan A. Potongan-potongan atau
setiap untainya akan memiliki ujung beruntai tunggal. Ujung ini dikenal
dengan istilah sticky ends atau cohesive ends (ujung kohesif) dan blunt ends
adalah partikel yang digunakan untuk eksperimen DNA rekombinan. Hal ini
Satyanarayana, 2007).
sumber bakteri yang diisolasi. Huruf pertama pada enzim yang ditulis miring
menunjukkan nama genus, diikuti dua huruf berikutnya juga ditulis miring
enzim seperti berikut ini. EcoRI adalah enzim yang berasal dari Escherichia
(E) coli (co), strain Ry13 (R), dan merupakan endonuklease pertama (I) yang
ditemukan. HindIII adalah Haemophilus (H) influenzae (in), strain Rd (d), dan
4
Enzim DNA ligase digunakan untuk menyambung atau menyisipkan
DNA. Pada tahun 1972, David Jackson, Robert Simon, dan Paul Berg berhasil
fragmen DNA dengan cara memasangkan (anneal) ujung sticky ends dari satu
potongan DNA asing. Selain kedua enzim tersebut enzim (restriksi dan enzim
DNA ligase), terdapat beberapa enzim yang ikut berperan dalam teknologi
Enzim Kegunaan/Reaksi
Enzim restriksi Memotong untai ganda DNA pada urutan basa yang
spesifik
Transkriptase balik Membuat salinan DNA dari molekul RNA
Tabel 2. Beberapa enzim yang biasa digunakan dalam teknologi DNA rekombinan/rekayasa
genetika (Chakrapani dan Satyanarayana, 2007).
5
2. Sel Inang
molekul DNA rekombinan. Jenis sel inang pada prokariotik (bakteri) berbeda
dengan sel inang pada eukariotik (jamur, hewan dan tumbuhan). Beberapa
contoh sel inang yang digunakan dalam rekayasa genetika dapat dilihat pada
Kelompok Contoh
Prokariotik
Bakteri Escherichia coli
Bacillus subtilis
Streptomyces sp
Eukariotik
Fungi Saccharomyces cerevisiae
Aspergillus nidulans
Tumbuhan Protoplasts
lntact ells
Whole plants
Tabel 3. Beberapa contoh sel inang yang digunakan dalam rekayasa genetika
Selain efektif menggabungkan materi genetik vektor, sel inang juga mudah
inang pilihan oleh para ilmuwan. Bacillus subtilis adalah bakteri non-patogen
berbentuk batang. Bakteri ini telah digunakan sebagai sel inang dalam bidang
6
Sel inang eukariotik. Organisme eukariotik merupakan sel inang yang
cerevisiae). Selain ragi, sel inang yang dapat digunakan dalam teknologi DNA
menggunakan sel mamalia sebagai sel inang adalah beberapa protein komplek
yang tidak dapat disintesis oleh bakteri dapat diproduksi oleh sel mamalia
seperti jaringan aktivator plasminogen. Hal ini karena sel-sel mamalia memiliki
proses translasi).
3. Vektor/Pembawa
a. Plasmid
diri. Hampir semua bakteri memiliki plasmid baik dalam jumlah yang
sedikit (1-4 per sel) bahkan memiliki jumlah yang banyak (10-100 per sel).
(2) Mempunyai bentuk DNA sirkuler sehingga tetap stabil pada saat
diisolasi.
sel.
(5) Berisi sisi pengenal tunggal untuk satu atau lebih enzim restriksi.
deteksi dan seleksi terhadap plasmid yang berisi gen yang diinginkan.
7
Plasmid yang memenuhi kriteria sifat tersebut yang paling banyak
digunakan sebagai vektor adalah pBR322 (untai DNA 4,361 bp). pBR322
membawa gen yang resisten untuk ampicilin (Amp′) dan tetracycline (Tel′)
Plasmid pBR322 ini memiliki pengenalan yang baik pada reaksi enzim
(2) Stabil, bertahan pada sel inang (host) dengan jumlah 1 – 0 copy/sel.
(3) Dapat diperbanyak jumlahnya sampai 1.000 – 3.000 copy tiap sel
(6) Mempunyai sisi pemutus tunggal untuk enzim restriksi PstI, SaII,
8
Jenis plasmid lain adalah pUC19 (2,686 bp) memiliki gen yang
b. Bakteriofag
plasmid. Oleh karena itu, fag lebih disukai untuk rekayasa genom sel
c. Cosmid
untuk mengemas DNA ke dalam kepala fag. Kata yang kedua adalah “mid”
termasuk cos site ke dalam plasmid. DNA asing dapat disisipkan ke dalam
cosmid DNA menjadi DNA rekombinan yang bisa dikemas dalam bentuk
9
pBR322-plasmid dapat dimodifikasi menjadi cosmid. Sebagai
diri dengan rentang ukuran 1/10 – 1/5 bagian dari kromosom manusia.
gen manusia yang ukurannya cukup panjang. Lebih jauh lagi HAC
besar dari plasmid lain yang difungsikan sebagi vektor. BACs dapat
e. Vektor Khusus
Salah satu faktor utama yang mempengaruhi pemilihan suatu vektor adalah
ukuran dari fragmen DNA asing yang akan disisipkan. Efisiensi proses ini
10
Vetor Inang Ukuran DNA asing
yang disisipkan
Tabel 4. Contoh berbagai Ukuran fragmen DNA yang disisip dan vektor
a. Transformasi
asing) dapat berupa potongan DNA atau fragmen DNA yang berasal dari
sel bakteri lainnya atau dari organisme lainnya. Masuknya DNA dari
lingkungan ke dalam sel bakteri ini dapat terjadi secara alami. Fenomena
transformasi ini telah diamati oleh Griffith (1928) dan kelompok Avery
(1944). Griffith (1928) telah menemukan bahwa strain bakteri yang tidak
ini disebabkan karena strain yanng tidak virulen (strain kasar) dicampuran
dengan sel-sel bakteri strain virulen (strain halus) yang telah dimatikan.
Gambar 5. Bagan Transformasi Gen
perubahan sifat atau transformasi dari bakteri kasar menjadi bakteri halus
11
atau perubahan dari tidak virulen menjadi virulen tersebut disebabkan oleh
adanya DNA dari sel bakteri halus yang masuk ke dalam sel bakteri kasar.
b. Konjugasi
dalam sel bakteri lainnya (sel resipien) melalui kontak fisik antara kedua
sel. Sel donor (sel jantan) memasukkan sebagian DNA-nya ke dalam sel
resipien (sel betina). Transfer DNA ini melalui pili seks yang dimiliki oleh
sel jantan. Sel betina tidak memiliki pili seks. DNA dari sel jantan
berpindah ke dalam sel betina secara replikatif. Oleh karena itu, setelah
konjugasi selesai kedua sel berpisah kembali dan jumlah sel tidak
bertambah (setelah konjugasi tidak dihasilkan anak sel). Oleh karena itu,
proses konjugasi ini disebut juga sebagai proses atau mekanisme seksual
12
Gambar 7. Konjugasi, Transformasi, Transduksi Gen
c. Elektroporasi
memiliki risiko kematian sel bakteri yang lebih besar serta biayanya
pun relatif mahal. Tingkat keberhasilan dari metode ini juga tergantung
13
pada kandungan garam yang ada di lingkungan. Selain elektroporasi,
dengan menyisipkan gen yang dapat menambat nitrogen bebas. Selain itu
DNA bisa dikemas dalam liposom. Liposom ini dapat melekat pada
nukleus.
e. Transfer langsung
14
5. Strategi Pengkloningan Gen
sebuah gen yang mungkin sangat dibutuhkan bagi kehidupan manusia. Kloning
molekul DNA rekombinan, dan ekspresi gen target dalam sel inang.
memastikan fragmen DNA yang diisolasi adalah gen target sesuai dengan
sebuah vektor (plasmid, fag, atau cosmid) melalui teknologi DNA rekombinan
sel bakteri, misalnya strain E. coli) untuk diproduksi lebih banyak. Gen-Gen
target yang ada di dalam sel inang jika diekspresikan akan menghasilkan
spesifik penyandi insulin diisolasi dan diklon dalam suatu vektor membentuk
tersebut
c. Vektors
d. Inang (Host)
sel inang.
b. DNA yang akan digunakan sebagai inang, misalnya plasmid bakteri E. coli,
diisolasi dan dipotong pula oleh enzim yang sama. Plasmid ini biasanya
gennya.
Gambar 9. Mekanisme Kloning Gen
16
C. Teknik DNA Rekombinan
Molekul DNA dalam suatu sel dapat diisolasi atau diekstraksi untuk
DNA dari bahan lain seperti protein, lemak, dan karbohidrat. Prisnsip utama
dalam isolasi DNA ada tiga yakni penghancuran (lisis), ektraksi atau
pemisahan DNA dari bahan padat seperti selulosa dan protein, serta
dalam proses isolasi DNA antara lain harus menghasilkan DNA tanpa adanya
kontaminan seperti protein dan RNA; metodenya harus efektif dan bisa
mengubah struktur dan fungsi molekul DNA; dan metodenya harus sederhana
dan cepat.
Prinsip isolasi DNA pada berbagai jenis sel atau jaringan pada
hal teknik dan bahan yang digunakan. Bahkan beberapa teknik menjadi lebih
sebagai contoh kit yang digunakan untuk isolasi DNA pada tumbuhan seperti
Kit Nucleon Phytopure sedangkan untuk isolasi DNA pada hewan digunakan
tahapan dari awal isolasi DNA yang bertujuan untuk mengeluarkan isi sel.
Tahap penghancuran sel atau jaringan memiliki beberapa cara yakni dengan
17
cara fisik seperti menggerus sampel dengan menggunakan mortar dan pestle
seperti penggunaan detergen yang dapat melarutkan lipid pada membran sel
membran pada sel darah serta mendegradasi protein globular maupun rantai
dan kalsium yang dibutuhkan sebagai kofaktor enzim DNAse (Corkill dan
Rapley, 2008).
sentrifugasi akan terbentuk 2 fase yang terpisah yakni fase organik pada
lapisan bawah dan fase aquoeus (air) pada lapisan atas sedangkan DNA dan
RNA akan berada pada fase aquoeus setelah sentrifugasi sedangkan protein
yang terdenaturasi akan berada pada interfase dan lipid akan berada pada fase
organik. Selain fenol, dapat pula digunakan campuran fenol dan kloroform
protein. Ekstrak DNA yang didapat seringkali juga terkontaminasi oleh RNA
sehingga RNA dapat dipisahkan dari DNA ekstrak dengan cara pemberian
RNAse.
18
Gambar 10. Proses Pemurnian DNA
ekstrak sel dengan menggunakan salah satu kemikalia seperti berikut ini:
menggunakan RNase. Pemisahan DNA dari molekul RNA dan protein dapat
Chlorida (CsCl), dengan cara ini DNA akan terpisah pada band yang berbeda
dengan protein dan RNA bahkan antara linier DNA dan sirkuler DNA. Selain
(Juniarka, 2011)
19
Teknik blotting pada dasarnya ada tiga macam yaitu southern blotting
(untuk blotting DNA), northen blotting (untuk RNA), dan dot blotting (untuk
eastern blotting, dan sebagainya, tetapi intinya sama yaitu teknik untuk
terpisah secara elektroforesis dari gel ke membran. Metode ini diambil dari
20
nama penemunya yaitu Edward M. Southern. Prinsipnya adalah kapilaritas,
fragmen DNA dari gel ke membran. Karena muatan DNA negatif sedangkan
muatan membran positif maka fragmen DNA akan menempel (blot) pada
diletakkan pada bagian bawah gel. Tekanan diberikan secara merata pada gel
untuk memastikan terjadi kontak antara gel dengan membran. Proses transfer
dengan probe (pelacak) yang telah dilabeli radioaktif, tetapi dapat juga
adalah DNA untai tunggal yang memiliki sekuen yang akan dideteksi. Probe
diinkubasi dengan membran agar dapat berhibridisasi dengan DNA yang ada
pada membran. Setelah proses hibridisasi, probe yang tidak terikat dicuci dari
membran sehingga yang tinggal hanya probe yang hibrid dengan DNA di
21
membran. Pola hibridisasi kemudian dideteksi dengan visualisasi pada
menganalisis penyusunan klon dari gen T-cell receptor penyakit luka yang
1989: 626-629)
Metode ini memerlukan label radioaktif pada satu ujung dan pemurnian
pemutusan pada proporsi yang kecil satu atau dua dari empat basa
sebuah seri dari fragmen yang dilabel dihasilkan dari ujung yang
b. Metode Dideoxynucleotid
yang tidak memiliki gugus hidroksil pada karbon no-3 dari gula,
22
yang sudah ada. Tetapi jika yang berikatan adalah dideoxynucleotide,
Teknik dideoxynucleotide
dideoxi-ATP.
harus diatur dengan baik agar dapat terjadi pemisahan dengan panjang
ujung 3’. Fluorochrome yang berbeda dapat digunakan untuk tiap di-
(microarray).
(Sudah dijelaskan)
jenis DNA spesifik dalam jumlah besar secara in vitro. PCR dipakai untuk
menghasilkan fragmen DNA dan RNA yang ingin dianalisis. Teknik ini
(untai primer).
kerja optimum enzim DNA polymerase, biasanya 70-72°C. Pada tahap ini
dNTP, dan seterusnya. Enzim akan memperpanjang rantai baru ini hingga
akan diamplifikasi, secara kasarnya adalah 1 menit untuk setiap 1000 bp.
24
6. Produksi Antibodi Monoklonal
tunggal atau sel klona yang hanya mengenal satu jenis antigen. Pembentukan
7. Pustaka Genom
dipotong dalam bentuk fragmen dan diklon pada vektor yang sesuai. Pustaka
fragmen DNA.
25
banyak. Saat ini, dengan adanya mesin PCR sangat membantu proses
tersebut.
Fragment LengthPolymorphism
Gambar 14. Pustaka Genom (MFLP).
adalah Tissue Plasminogen Activator (tPA) dan Hirudin. Protein yang sudah
fisiologis protein. Sifat fisiologis ini bisa dengan cara mengubah aktivitas
atau fungsinya.
26
Teknik rekayasa protein dilakukan dengan cara: (a) pointmutan:
dan struktur; (e) menghasilkan protein minimal berbentuk satu jenis protein
medis.
27
BAB V
PENUTUP
1. Kesimpulan
b. Proses pemotongan dan penyisipan gen melibatkan berbagai aspek yaitu: (1)
bahan molekular dalam TDR (enzim restriksi dan enzim ligase); (2) sel inang;
(3) Vektor; (4) metode transfer gen; (5) strategi pengkloningan gen
cara yang pada prinsipnya selalu melibatkan pemotongan dan penyisipan gen.
2. Saran
baru banyak ditemukan. Perlu bagi pembaca untuk memperluas wawasan dengan
Avery, McCleod, dan McCarty. 1944. Studi on The Chemical Nature of The
Substance Incuding Transformation of Pneumococcal Types. J. Exp. Med. 79:
137-158
Corkill, G., Rapley, R. 2008. The Manipulation of Nucleic Acids: Basic Tools
andTechniques. In: Molecular Biomethods Handbook Second Edition. Ed:
Walker, J.M., Rapley, R. Humana Press, NJ, USA.
Gerald Carp. 2008. Cell and Molecular Biology: Conceps and Experiment.
Michigan: Universitas Michigan
Gunther E, Wurst W, Wonigeit K, Epplen JT. 1989. Analysis of the rat major
histocompatibility system by Southern blot hybridization. Journal of
Immunol 143(2);1257-1261.
I Gede Agus Juniarka. 2011. Westernblot Untuk IgG dan IgM. Program
Pasacasarjana Farmasi UGM
IPGRI and Cornell University. 2003. Using Molecular Marker Technology in Studies
on Plant Genetic Diversity DNA Based Technologies PCR-based,
Technologies PCR basics.
http://www.bioversityinternational.org/fileadmin/bioversityDocs/Training/mo
lecular_markers_volume_1/english/MolMarkers%20Vol1%20III%20PCR%2
0basics.pdf
29
James R. Griffith. 1928. Reinforced Concrete Design Simplified. Virginia: University
of Virginia
Madigan MT, Martinko JM, Dunlap PV, Clark DP. 2009. Brock Biology of
Microorganisms. San Fransisco: Pearson Education, Inc.
Seidman CE, Struhl K, Sheen J, Jessen T. 2001. Introduction of plasmid DNA into
cells. Curr Protoc Mol Biol. 1 : 1.8.
Watson JD, Baker TA, Bell SP, Gann A, Levine M, Losick R. 2004. Molecular
Biology of The Gene 5th ed. San Fransisco : Benjamin Cummings.
Wells KE, McMahon J, Foster H, Ferrer A, Wells DJ. 2008. Gene Delivery to
Dystrophic Muscle. Methods Mol Biol 423:421-31.
Zuppaedo AB, Siebeling RJ. 1998. An Epimerase Gene Essential for Capsule
Synthesis in Vibrio vulnificus. Infect Immun 66(6): 2601–2606
31