Nama : Shelley Rifda Windani

NIM : 4301419097
Rombel : Pendidikan Kimia19C
Dasar Analisis Instrumen (506)

Rangkuman Makalah Kelompok 1 Tentang High Performance Liquid Chromatography

(HPLC)

A. Pengertian Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT)

Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT) atau High Performance Liquid
Chromatography (HPLC) merupakan salah satu metode fisikokimia berdasarkan pada
teknik kromatografi di mana fase geraknya berupa cairan dan fase diam dapat dalam
bentuk cair atau padat. Metode ini sangat bermanfaat di bidang farmasi untuk
menganalisis secara simultan beberapa analit dalam matriks sederhana maupun
kompleks.

B. Jenis Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT)

Pemisahan dengan HPLC dapat dilakukan dengan fase normal (jika fase
diamnya lebih polar dibanding dengan fase geraknya) atau fase terbalik (jika fase
diamnya kurang non polar dibanding dengan fase geraknya). Selain klasifikasi di atas,
HPLC juga dapat dikelompokkan berdasarkan pada sifat fase diam dan atau
berdasarkan pada mekanisme sorpsi solut.
Menurut (Zaitunah dan Hut, 2002) jenis-jenis HPLC dibedakan menjadi
beberapa macam, antara lain Kromatografi Adsorbsi (Prinsip kromatografi adsorpsi
telah diketahui sebagaimana dalam kromatografi kolom dan kromatografi lapis tipis),
Kromatografi fase terikat/Partisi (Kebanyakan fase diam kromatografi ini adalah
silika yang dimodifikasi secara kimiawi atau fase terikat), Kromatografi penikaran ion
(HPLC penukar ion menggunakan fase diam yang dapat menukar kation atau anion
dengan suatu fase gerak), Kromatografi pasangan ion (Kromatografi pasangan ion
juga dapat digunakan untuk pemisahan sampel-sampel ionik dan mengatasi masalah-
masalah yang melekat pada metode penukaran ion), Kromatografi eksklusi ukuran
(Kromatografi ini disebut juga dengan kromatografi permiasi gel dan dapat digunakan
untuk memisahkan atau menganalisis senyawa dengan berat molekul > 2000 dalton.
Fase diam yang digunakan dapat berupa silika atau polimer yang bersifat porus
 sehingga solut dapat melewati porus (lewat di antara partikel), atau berdifusi lewat
fase diam), dan Kromatografi Afinitas (pemisahan terjadi karena interaksi-interaksi
biokimiawi yang sangat spesifik. Fase diam mengandung gugus-gugus molekul yang
hanya dapat menyerap sampel jika ada kondisi-kondisi yang terkait dengan muatan
dan sterik tertentu pada sampel yang sesuai).

C. Instrumen- Instrumen Penyusun Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT)

1. Wadah fase gerak (reservior)
Wadah pelarut kosong ataupun labu laboratorium dapat digunakan sebagai
wadah fase gerak. Wadah ini biasanya dapat menampung fase gerak antara 1
sampai 2 liter pelarut. Fase gerak sebelum digunakan harus dilakukan degassing
(penghilangan gas) yang ada pada fase gerak.
2. Pompa
Pompa yang cocok digunakan untuk HPLC adalah pompa yang mempunyai
syarat sebagaimana syarat wadah pelarut yakni: pompa harus inert terhadap fase
gerak. Bahan yang umum dipakai untuk pompa adalah gelas, baja tahan karat,
Teflon, dan batu nilam. Pompa yang digunakan sebaiknya mampu memberikan
tekanan sampai 5000 psi dan mampu mengalirkan fase gerak dengan kecepatan
alir 3 mL/menit. Terdapat 3 jenis pompa yaitu pompa reciprocating, pompa
displacement, dan pompa pneumatic
3. Tempat Injeksi
Tempat Untum memisahkan sampel. Volume injeksi sangat tepat karena
mempunyai sampel loop dengan variabel volume (misalnya 20 – 500 μL). Adapun
tipe dasar injektor yang dapat digunakan, antara lain Stop-Flow, Septum, dan
Loop Vale). Selain itu, juga ada syarat-syarat injektor yang baik, yaitu dapat
memasukkan sampel ke dalam kolom dalam bentuk sesempit mungkin, mudah
digunakan, keberulangan tinggi, dan dapat bekerja walaupun ada tekanan balik.
4. Kolom
Ada 2 jenis kolom pada HPLC yaitu kolom konvensional dan kolom
mikrobor. Kolom merupakan bagian HPLC yang mana terdapat fase diam untuk
berlangsungnya proses pemisahan solut/analit. Kedua kolom tersebut terdapat
perbadaan, perbedaan tersebut terletak pada tabung kolom, fase diam, fase gerak,
tekanan operasional, dan kinerja.
 5. Detektor
Detektor pada HPLC dikelompokkan menjadi 2 golongan yaitu: detektor
universal (yang mampu mendeteksi zat secara umum, tidak bersifat spesifik, dan
tidak bersifat selektif) seperti detektor indeks bias dan detektor spektrometri
massa; dan golongan detektor yang spesifik yang hanya akan mendeteksi analit
secara spesifik dan selektif, seperti detektor UV-Vis, detektor fluoresensi, dan
elektrokimia.

D. Prinsip kerja
Adapun prinsip kerja dari KCKT adalah suatu teknik yang mana solut atau zat
terlarut terpisah perbedaan kecepatan elusi, dikarenakan solut-solut ini melewati suatu
kolom kromatografi. Pemisahan solut-solut ini diatur oleh distribusi solut dalam fase
gerak dan fase diam. Kerja HPLC pada prinsipnya adalah pemisahan analit-analit
berdasarkan kepolarannya, alatnya terdiri dari kolom (sebagai fasa diam) dan larutan
tertentu sebagai fasa geraknya. Yang paling membedakan HPLC dengan kromatografi
lainnya adalah pada HPLC digunakan tekanan tinggi untuk mendorong fasa gerak.
Campuran analit akan terpisah berdasarkan kepolarannya, dan kecepatannya untuk
sampai ke detektor (waktu retensinya) akan berbeda, hal ini akan teramati pada
spektrum yang puncak-puncaknya terpisah. Urutan skala polaritas : golongan
fluorocarbon < golongan hidrokarbon < senyawa terhalogenasi < golongan eter <
golongan ester < golongan keton < golongan alkohol < golongan asam. Keberhasilan
proses separasi sangat dipengaruhi oleh pemilihan jenis kolom dan juga fasa mobil.
Setelah komponen dalam sample berhasil dipisahkan, tahap selanjutnya adalah proses
identifikasi. Hasil analisa HPLC diperoleh dalam bentuk signal kromatogram.

E. Aplikasi
Aplikasi utama adalah dalam bioteknologi, ilmu hayat, dan industri farmasi.
Aplikasi penggunaan HPLC akan mengacu kepada fase normal dan fase terbalik.
Pada fase normal yang menjadi fase diamnya adalah polar dan fase geraknya adalah
non polar. Sedangkan pada fase terbalik, fase diamnya adalah non polar dan fase
geraknya adalah polar.
F. Kelebihan dan Kekurangan
Kelebihan Kekurangan
Mampu memisahkan molekul- Larutan harus dicari fase diamnya
molekul dari suatu campuran terlebih dahulu.
Hanya bisa digunakan untuk asam
Mudah melaksanakannya
organic.
Harus mengetahui kombinasi yang
Kecepatan analisis dan kepekaan
optimum antara pelarut, analit,
yang tinggi
dan gradient elusi.
Harganya mahal sehingga
Dapat menghindari terjadinya penggunaannya dalam lingkup
dekmposisi penelitian yang terbatas

Dapat digunakan bermacam-

macam detektor
Kolom dapat digunakan kembali
Mudah melakukan “sample
recovery”
Dapat menganalisis senyawa
organik yang terurai
Dapat menganalisis cuplikan yang
berasal dari senyawa anorganik
Dapat menganalisis cuplikan yang
memiliki berat molekul yang
tinggi/titik didihnya yang sangat
tinggi
Dapat memisahkan zat-zat yang
tidak mudah menguap
Ideal untuk zat bermolekul besar
dan beionik
Solvennya dapat dihilangkan
dengan menguapkan kecuali untuk
kromatografi penukar ion
memerlukan prosedur khusus

G. Teknik Pengoperasian Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT)

1. Injeksi sampel
 Injeksi sampel seluruhnya otomatis dan anda tidak akan mengharapkan
bagaimana mengetahui apa yang terjadi pada tingkat dasar. Karena proses ini
meliputi tekanan, tidak sama halnya dengan kromatografi gas.
2. Wadah retensi
Waktu yang dibutuhkan oleh senyawa untuk bergerak melalui kolom menuju
detektor disebut sebagai waktu retensi. Waktu retensi diukur berdasarkan waktu
dimana sampel diinjeksikan sampai sampel menunjukkan ketinggian puncak yang
maksimum dari senyawa itu. Senyawa-senyawa yang berbeda memiliki waktu
retensi yang berbeda.
3. Detektor
Ada beberapa cara untuk mendeteksi substansi yang telah melewati kolom.
Metode umum yang mudah dipakai untuk menjelaskan yaitu penggunaan serapan
ultra-violet.