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COLINESTERASE BIOQUÍMICA CLÍNICA

FINALIDADE EQUIPAMENTOS E MATERIAIS


Sistema colorimétrico para determinação da NECESSÁRIOS NÃO FORNECIDOS
colinesterase sérica (pseudocolinesterase) no • Espectrofotômetro ou fotocolorímetro capaz
soro ou plasma (heparina). de medir a absorvância em 410nm ou filtro
Somente para uso diagnóstico in vitro. azul.
• Tubos de ensaio.
PRINCÍPIO • Pipetas graduadas.
A colinesterase sérica hidrolisa Propioniltiocolina, • Pipetas semiautomáticas 10 µL.
com a liberação de grupo sulfidrílico livre ao • Banho maria (370C).
nível de Tiocolina (equação 1). O grupo SH livre • Cronômetro.
reage com DTNB (reagente de cor) levando à • Ponteiras descartáveis.
formação de um composto amarelo, de absorção • Água deionizada ou destilada.
máxima em torno de 410nm (equação 2).
ARMAZENAMENTO E ESTABILIDADE DOS
REAGENTES
colinesterase
S u b s tr ato ( liof ilizad o) : armazenar à
1. Propioniltiocolina + H2O Ácido
temperatura de 2-8oC. Estável até a data de
Propiônico + Tiocolina sérica
vencimento indicada no rótulo do frasco.
Reagente de cor: armazenar à temperatura
2. Tiocolina + DTNB = Ácido 5-tio-2-Nitrobenzóico
de 2-8oC e ao abrigo da luz, pois o reagente é
fotosensível. Estável até a data de vencimento
PARTICULARIDADES DO SISTEMA indicada no rótulo.
Doles Reagentes apresenta um método Solução inibidora: armazenar à temperatura
simples para dosagem da colinesterase sérica, de 2-8oC. Estável até a data de vencimento
realizado em 5 minutos. indicada no rótulo.
Solução padrão 7U.I./mL (liofilizado):
METODOLOGIA armazenar à temperatura de 2-8oC. Estável até
Dietz modificado. a data de vencimento indicada no rótulo.

REAGENTES CUIDADOS E PRECAUÇÕES COM O USO DOS


Substrato: cada frasco contém, sob forma REAGENTES
liofilizada, 67µmol de Iodeto de Propioniltiocolina. Todos os reagentes são somente para uso
Reagente de cor: solução 0,423M de diagnóstico in vitro. Seu manuseio deve ser
5,5-Dithiobis-(Ácido 2-Nitronbenzóico) em cuidadoso, evitando-se contato com pele e
tampão de fosfatos pH 7,6. mucosas. Em caso de contaminação acidental,
Solução inibidora: solução de Sulfato de lavar a parte afetada em água corrente. O
Quinidina a 0,5%. descarte do material utilizado deverá ser feito
Solução padrão 7U.I./mL: 10µL do padrão obedecendo-se aos critérios de biossegurança
corresponde a 7U.I./mL dentro da metodologia estabelecidos pelo laboratório, de acordo com
adotada. as normas locais estaduais ou federais.

Observar a simbologia
APRESENTAÇÃO constante nos rótulos
Substrato 6 x 6,5mL do produto:
Irritante
Reagente de cor 1 x 120mL
Solução inibidora 1 x 110mL AMOSTRA
Solução padrão 7U.I./mL 1 x 3mL Soro ou plasma (heparina). Não usar amostras
hemolisadas, pois as hemácias são ricas
NÚMERO DE TESTES em acetilcolinesterase. Estável por 7 dias,
se armazenada entre 2-8oC.
36 testes 10µL de soro
Todas as amostras biológicas devem

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ser consideradas como potencialmente amostra. A contagem do tempo a partir do
infectantes. último tubo levará a resultados falsamente
elevados. Note que tal ocorrência é
PROCEDIMENTO TÉCNICO diretamente proporcional a quantidade de
Preparo do substrato para uso: amostra da bateria de ensaio.
Adicionar 6,5mL de água destilada ou deionizada
ao frasco que contém o liofilizado. O reagente 3-Após o tempo de incubação e ainda no banho-
é estável por 30 dias, à temperatura de maria adicionar 1,5mL de solução inibidora no
2-8oC. tubo T em intervalos de 30 segundos entre os
Preparo do padrão para uso: tubos.
Reconstituir a solução com a adição de 3mL de
água destilada. O padrão é estável por 30 4-Retirar a estante de tubos do banho-maria e
dias, se mantido congelado. adicionar 1,5mL de solução inibidora e 10µL de
amostra no tubo B.
Determinação do Fator Para o tubo B não há necessidade de
Rotular um tubo de ensaio com B (branco) e cronometrar o intervalo de adição de
3 tubos de ensaio com P (padrão). reagentes, visto que não há atividade da
enzima neste tubo. O mesmo é preparado
Proceder como segue: com a finalidade de eliminar interferentes
de aspecto físico (icterícia, lipemia, entre
B P P P outros) da amostra.

Água destilada 2,0mL 2,0mL 2,0mL 2,0mL 5-Homogeneizar e ler as absorvâncias do T


(teste) em espectrofotômetro ou fotocolorímetro
Solução padrão - 10µL 10µL 10µL em 410nm ou filtro azul, acertando o zero com
o branco. A cor final permanece estável por 15
Reagente de cor 1,5mL 1,5mL 1,5mL 1,5mL
minutos, à temperatura ambiente (20-30oC).

Homogeneizar e ler as absorvâncias do T (teste) CURVA DE CALIBRAÇÃO


em espectrofotômetro ou fotocolorímetro, em Padrão Absorvância Conc.
410nm ou filtro azul, acertando o zero com (U.I./mL)
o branco. 1 0.000 0
absorvância

2 0.187 2

Determinação da Amostra 3 0.351 3.75


4 0.654 7
1- Identificar 2 tubos de ensaio com B (branco)
5 0.818 8.75
e T (teste). 6 1.308 14
7 1.460 17
Proceder como segue:

B T Obs.: Não utilizar esta curva para determinar


Substrato 0,5mL 0,5mL
o resultado de seu ensaio.
• A curva de calibração é a representação gráfica
Reagente de cor 1,5mL 1,5mL da relação entre os valores das absorvâncias
com os valores das concentrações de um
Colocar em banho-maria, 37 oC, durante 3 conjunto de soluções padrão.
minutos. As dosagens para montagem da curva foram
feitas em um espectrofotômetro “Ultrospec
2-Manter a estante dentro do banho maria. III”, Pharmacia Biotec, comprimento de onda
Adicionar 10µL de amostra no tubo T e incubar de 410nm e cubetas com passagem de luz de
durante 2 minutos e 30 segundos. O intervalo 10mm.
de adição e homogeneização deve ser de 30 • A curva de calibração demonstra a linearidade
segundos entre os tubos. da reação até uma determinada concentração,
Atenção! Este tempo deve ser cronometrado na qual pode ser determinado um fator de
a partir do 1° tubo em que foi adicionado a calibração (F) de acordo com a Lei de Beer.

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• A reação é linear até 14 U.I./mL (ver rigorosamente seguido conforme instruções
curva acima). Obtendo-se valores mais de uso. Qualquer alteração poderá levar a
elevados, dilui-se a amostra com solução resultados errôneos.
fisiológica e procede-se à nova dosagem. • Não usar amostras hemolisadas pois os
Multiplicar o valor encontrado pelo fator eritrócitos são ricos em AChE.
de diluição. • O controle de tempo de incubação (2 minutos
• O kit de Colinesterase Doles possui e 30 segundos) deve ser feito com um
padrão no intervalo de linearidade da cronômetro. Uma diferença de 15 segundos
metodologia adotada. O laboratório leva a um erro de 10% na dosagem da
deve realizar o ensaio com o padrão que colinesterase.
acompanha o kit e calcular seu fator de
calibração (F), de acordo com o exemplo CONTROLE DA QUALIDADE DO SISTEMA
estabelecido nos cálculos. 1. A limpeza e a secagem adequada do
• O fator deve ser refeito periodicamente material a ser utilizado são de fundamental
e a cada lote do produto. importância para a estabilidade dos reagentes
• Os padrões utilizados na montagem da curva e obtenção de resultados corretos.
de calibração foram estandardizados seguindo 2. A água utilizada na limpeza do material,
o descrito em: “Colorimetric Determination no preparo dos reagentes e na dosagem,
of Serum Cholinesterase and Its Genetic deve ser de boa qualidade.
Variants by the Propionylthiocholine - Dithiobis 3. Colunas deionizadoras saturadas liberam
(nitrobenzoic Acid) Procedure”, Dietz A.A. íons diversos, aminas e agentes oxidantes,
que deterioram os reagentes.
e colaboradores in “Selected Methods of
4. As pipetagens devem ser precisas.
Clinical Chemistry” vol. 08, 1977 - American
5. O nível da água do banho-maria deve
Association for Clinical Chemistry.
ser superior ao nível dos reagentes nos tubos
de ensaio. A temperatura (37oC) deve ser
CÁLCULOS
rigorosamente observada.
6. O uso de soro controle de referência
7
Fator (F) = deve ser uma prática rotineira do laboratório.
absorvância P(média) Recomenda-se utilizar um soro controle com
valor na faixa de normalidade e outro soro
Colinesterase (U.I./mL) = T x Fator (F) controle de valor elevado.
Exemplo:
Leitura Padrão: 0,651; 0,656; 0,654 VALORES DE REFERÊNCIA
Teste: 0,700 Sexo feminino 5,0 - 10,5 U.I./mL
Sexo masculino 6,1 - 12,1 U.I./mL
0,651 + 0,656 + 0,654
Média padrão = = 0,654
3 SIGNIFICADO CLÍNICO
7 A colinesterase sérica ou pseudo colinesterase,
F= = 10,70 é sintetizada pelo fígado. Tem apreciável
0,654
valor quando dosada no sangue de indivíduos
Colinesterase (U.I./mL) = 0,700 x 10,7 suspeitos de hepatopatia, pelo fato de
encontrar-se diminuída em todas afecções
EXPRESSÃO DOS RESULTADOS EM hepáticas parenquimatosas difusas como:
UNIDADES S.I. hepatite virótica, cirrose, neoplasma maligno
metastático, fígado cardíaco e necrose
Colinesterase (U.I./L) = Colinesterase (U.I./
amebiana do fígado. Não é, porém, método
mL) x 1000
específico, pois pode estar diminuída na
Uma U.I. de Colinesterase é a quantidade
desnutrição, nas anemias, no enfarto do
de enzima que hidrolisa um µmol de
miocárdio, nas infecções ou na gravidez (10-
substrato/minuto/mL de soro, 37oC.
15% abaixo da faixa normal).
Na intoxicação por inseticidas organofosforados,
LIMITAÇÕES DO SISTEMA
a colinesterase sérica encontra-se diminuída,
• Para se obter ótimo desempenho do sistema,
sendo esta a principal indicação clínica para
é necessário que o procedimento técnico seja
sua dosagem.

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CARACTERÍSTICAS DE DESEMPENHO • Gary, P.G.: Cholinesterase determination.
Foram realizados 44 testes em amostras Clin. chem. 17, 1145, 1971.
cujos teores de colinesterase situavam-se • Dietz A.A., Rubinstein, H.M. and Lubrano
no intervalo de 1,3 a 13,5 U.I/mL. Esses T.: Colorimetric determination of serum
ensaios foram realizados em paralelo com uma cholinesterase and its genetic variant by the
metodologia de referência. A comparação do kit propionylthiocholine-dithiobis (nitrobenzoic
de Colinesterase Doles (Y) com a metodologia acid) procedure. Clin. Chem. 19, 1309, 1973.
mencionada (X) deu origem à seguinte equação • Prellwitz, Kapp and M ller: Aktivitats
de regressão linear: Y = 1,213X - 1,46, sendo bestimmung der serum cholinesterase J. Clin.
o coeficiente de correlação 0,999. chem. biochem. 14, 93, 1976.
Testes mostram recuperação entre 96 e 104%. • Bishop M.L.; Dubin - Engelkirk J.L.; Fody E.P.:
O erro da média foi de 2,28%. Clinical chemistry principles, procedures and
correlation, 2a edição, 238-239, 1991.
Repetitividade: foram realizadas 20 dosagens • Lima A. O ., Soares J.B.; Greco J.B.; Galizzi
sucessivas, com 2 amostras, obtendo-se os J.; Cançado J.R.: Métodos de laboratório
seguintes resultados: aplicados à clínica, 7a edição; 3-6, 1992.
• Burtis C.A., Ashwood: Tietz textbook of clinical
Amostra 1 Amostra 2
chemistry, 2a edição, 877-882, 1994.
Concentração (U.I./mL) 1,64 8,51 • Tibúrcio, H.M.: Controle interno da qualidade
analítica, 1aed. março/1995.
Desvio padrão 0,05 0,20
• Doles : dados de arquivo.
Coeficiente de variação (%) 3,04 2,35
TERMOS E CONDIÇÕES DE GARANTIA
Reprodutibilidade: foram realizadas 20 DA QUALIDADE DO PRODUTO
dosagens, durante 20 dias consecutivos, As garantias do fabricante ao consumidor
obtendo-se os seguintes resultados: seguem estritamente as relacionadas na Lei no
8.078, de 11 de setembro de 1.990 - Código de
Amostra 1 Amostra 2 Defesa do Consumidor.
Os reagentes que compõem este sistema para
Concentração (U.I./mL) 1,53 8,98 diagnóstico são garantidos na sua performance,
Desvio padrão 0,05 0,27 reprodutibilidade e qualidade até a data de
vencimento.
Coeficiente de variação (%) 3,27 3,00
Os produtos que apresentarem problemas
técnicos comprovados serão substituídos,
Especificidade: a presente metodologia é sem ônus para o consumidor.
específica para determinação da colinesterase.
Doles Reag. Equip. para Laboratórios Ltda.
Sensibilidade: a absorvância encontrada, CNPJ: 01.085.513/0001-05
de 0,005, corresponde a 0,4U.I./mL de Rodovia BR 153, Km 493, Lt.07
colinesterase, quando realizados os testes em Chácara Retiro, Conjunto Palmares.
espectrofotômetro, a 410nm. A sensibilidade do CEP: 74775-027
sistema está diretamente relacionada com a do Goiânia - GO – Brasil
aparelho utilizado no laboratório. e-mail: doles@doles.com.br

Diluição da matriz: estudos sucessivos M.S.: no 10231810016


de diluição da matriz mostraram que não há
interferência na sensibilidade diagnóstica na Revisão: 13 (03/2010)
metodologia de Dietz modificado.

Substâncias interferentes: não utilizar


amostras hemolisadas pois as hemácias são
ricas AChE.
BIBLIOGRAFIA CONSULTADA

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