ELEKTROFORESIS PROTEIN

OLEH : D.A.N. APITULEY

Elektroforesis merupakan proses bergeraknya

molekul bermuatan pada suatu medan listrik.

Menurut Pomeranz dan Maloan (1978), muatan ion atau kelompok ion

tersebut akan berpindah jika berada pada suatu medan listrik. Kecepatan

molekul yang bergerak pada medan listrik tergantung pada muatan,

bentuk dan ukuran. Posisi molekul yang terseparasi pada gel dapat

dideteksi dengan pewarnaan atau autoradiografi, ataupun dilakukan

kuantifikasi dengan densitometer.

Dengan demikian elektroforesis dapat digunakan untuk separasi

makromolekul seperti protein dan asam nukleat. Sebagai contoh protein

mengandung muatan pada pH selain titik isoelektriknya sehingga protein

juga akan berpindah dimana kecepatan perpindahannya tergantung pada

densitas muatannya yaitu rasio muatan terhadap massanya. Semakin

besar rasio muatan terhadap massanya, molekul tersebut akan semakin

cepat berpindah (Hames,1981).

 Elektroforesis untuk makromolekul memerlukan matriks penyangga

untuk mencegah terjadinya difusi karena timbulnya panas dari arus

listrik yang digunakan. Gel poliakrilamid dan agarosa merupakan

matriks penyangga yang banyak dipakai untuk separasi protein dan

asam nukleat.

Elektroforesis yang dibahas di bawah ini menggunakan matriks

berupa gel poliakrilamida (PAGE = polyacrilamida gel electrophoresis)

untuk separasi sampel protein. Gel poliacrilamid ini dapat berfungsi

sebagai penyaring karena ukuran porinya yang dapat diatur. Jadi

pemisahannya terjadi berdasarkan perbedaan muatan dan ukuran molekul

(Hames, 1981). Keunggulan teknik PAGE dibanding dengan teknik

elektroforesis lainnya adalah ukuran porinya yang dapat diatur dan metode

ini relatif stabil terhadap perubahan kimiawi. Pada metoda SDS-PAGE,

protein akan terdenaturasi karena adanya senyawa thiol (β-

mercaptoethanol) sehingga struktur kuarterner protein terurai menjadi sub-

unit rantai polipeptida. Rantai polipeptida ini akan bermuatan negatif

dengan mengikat SDS. Kompleks SDS-polipeptida ini akan bergerak ke

katoda yang kecepatannya tergantung pada ukuran polipeptida tersebut

(Wongsosupantio,1992).
 Banyak molekul biologi bermuatan listrik yang besarnya tergantung

pada pH dan komposisi medium dimana molekul biologi tersebut terlarut.

Bila berada dalam suatu medan listrik, molekul biologi yang bermuatan

positif akan bermigrasi ke elektroda negatif dan sebaliknya. Prinsip inilah

yang dipakai dalam elektroforesis untuk memisahkan molekul – molekul

berdasarkan muatannya.

Gambar 1. Peralatan Elektroforesis dan kelengkapannya

Contoh Proses Elektroforesis Protein Ikan
 “Penentuan Profil Protein Daging Ikan Dengan PAGE (Non SDS)”
(Metode Laemli, 1970)

A. Persiapan Bahan

1. Acrylamid dan Bisacrylamid (30 : 0,8)

olarutkan 30 gr acrylamid dan 0,8 gr bisacrylamid dengan
50 – 60 ml akuades, kemudian tambahkan sampai
volume 100 ml dan aduk hingga homogen. Simpan
larutan ini pada lemari pendingin (4oC) dan larutan ini
bisa digunakan 1 – 2 bulan.
2. TEMED (N,N,N’,N’ tetrametiletilendiamin) yang diperoleh
secara komersil dan di simpan pada lemari pendingin.
3. Amoniumpersulfat (1,5%)
olarutkan 0,15 g amoniumpersulfat dalam 10 ml air dan
disimpan pada lemari pendingin dan larutan ini bisa
digunakan 1 – 2 hari.
4. Buffer stock untuk Stacking Gel (Tris-HCl 0,5M: pH6,6)
olarutkan 3 g Tris dengan 20 ml akuades, tambahkan HCl
1M hingga pH larutan mencapai 6,6 kemudian tambahkan
akuades sampai volume 50 ml dan disimpan dalam
lemari pendingin.
5. Buffer stock untuk Resolving Gel (Tris-HCl 1,5M: pH 8,8)
olarutkan 9,065 g Tris dengan 30 ml akuades, tambahkan
HCl 1M hingga tercapai pH 8,8 dan kemudian
ditambahkan akuades hingga volume 50 ml dan simpan
pada lemari pendingin
6. .......
7. Buffer stock untuk Running Buffer (Tris 0,25M : Glisin 1,92M;pH
8,3) :
olarutkan 3,03 g Tris, 14,4 g Glisin dengan 700 – 800 ml
akuades, kemudian jadikan volume larutan tersebut 1000
ml dan simpan pada lemari pendingin.

B. Pembuatan Larutan Staining dan Destaining

1. Larutan Staining dibuat dengan melarutkan 1 g Coommasie
Blue R250 dalam 1 L campuran larutan (akuades:
metanol:asam asetat glasial/ 5 : 5: 2)
 2. Larutan Destaining adalah merupakan campuran larutan
akuades: metanol:asam asetat glasial dengan perbandingan
5 : 5: 2.
C. Pembuatan Sampel Buffer : Sampel buffer terbuat dari Tris 52,5
mM-HCl:pH 6,8 yang mengandung 2-mercaptoetanol 5%, gliserol
10% dan Bromfenol blue 0.004%

D. Pembuatan Campuran Larutan Untuk Pembuatan Gel

Stock Stacking Konsentrasi Acrylamide dalam Running

Larutan Gel (%) Resolving Gel (%) Buffer
4 15 10 7,5
Larutan 1 1,33 10,00 6,67 5,00 -
Larutan 5 2,50 - - - -
Larutan 6 - 5,00 5,00 5,00
Larutan 7 - - - - 1000
Larutan 4 0,10 0,20 0,20 0,20 -
Larutan 3 0,50 1,00 1,00 1,00 -
Akuades 5,57 3,80 7,13 8,80 -
Larutan 2 0,015 0,015 0,015 0,015

E. Preparasi Gel

Dua buah plat kaca ( 7 x 10 cm, tebal 0,2 cm) dibersihkan

dengan air dan dikeringkan dengan alkohol. Sisi kiri, kanan dan
bawah plat laca dipasang karet dan dijepit dengan penjepit.
Larutan Resolving Gel 10% disiapkan dengan mencampur
stock larutan yang ada (point D). Setelah campuran larutan
tersebut homogen segera dimasukan ke dalam plat kaca. Agar
tidak cepat menjendal maka pada larutan campuran tersebut di
tambahkan TEMED dan segera dimasukan ke air dingin. Dalam
memasukkan larutan ke dalam plat kaca haruslah berhati-hati
agar tidak terbentuk gelembung udara pada bidang gelnya.
Pengambilan larutan dilakukan dengan menggunakan
mikropipet. Tinggi bidang gel kurang lebih 10 cm. Agar
permukaan gel tidak cekung maka pada bagian atas
ditambahkan butanol di atas permukaan gel tersebut. Setelah
terbentuk gel maka butanol yang ada dikeringkan dengan
 menggunakan kertas tissue. Setelah itu pada permukaan
bagian atas segera dimasukkan larutan Stacking Gel 4% (lihat
point D). Kemudian pada bagian atas tersebut dipasangkan
sisir untuk membentuk cekungan sebagai tempat memasukan
sampel.

F. Preparasi Sampel
1.
G. Proses Elektroforesis