Perbedaan dasar antara bakteri gram positif dan negatif adalah pada komponen dinding selnya.

Kompleks zat iodin terperangkap antara dinding sel dan membran sitoplasma organisme gram
positif, sedangkan penyingkiran zat lipida dari dinding sel organisme gram negatif dengan
pencucian alkohol memungkinkan hilang dari sel. Bakteri gram positif memiliki membran
tunggal yang dilapisi peptidohlikan yang tebal (25-50nm) sedangkan bakteri negatif lapisan
peptidoglikogennya tipis (1-3 nm).

Sifat Gram positif Gram Negatif

Komposisi dinding sel Kandungan lipid rendah Lipid tinggi
Ketahanan terhadap Lebih sensitif Lebih tahan
penisilin
Penghambatan warna basa Lebih dihambat Kurang dihambat
Kebutuhan nutrien Kompleks Relatif sederhana
Ketahanan terhadap Lebih tahan Kurang tahan
perlakuan fisik

Genus bakteri yang termasuk gram negatif adalah Enterobactericeae, Salmonella spp,
Shigella spp, E. Coli, Yersinia enterolitica. Sedangkan bakteri gram positif adalah
Staphylococci, Streptococci, Enterococci, Clostridium, Bacillus.

Reagen-reagen yang digunakan dalam pengecatan gram adalah:

1. Larutan violet kristal hucker (1 tetes) sebagai cat utama yang akan diikat oleh peptidoglikan
bakteri.

2. Iodin (1 tetes) sebagai mordan untuk mengintensifkan cat utama

3. Ethanol 95% (secukupnya sampai cat utama luntur), sebagai bahan peluntur untukk
melunturkan cat utama

4. Safranin (1 tetes) sebagai cat penutup untuk mewarnai kembali sel-sel yang sudah kehilangan
warna cat utamanya

Pada saat pemberian larutan cat kristal violet, bakteri gram positif dan negatif sama-sama
berwarna ungu. Saat ditetesi iodin, pada gram positif terbentuk kompleks iodin kristal violet
sehingga sel berwarna biru, demikian juga gram negatif. Namun setelah pencucian dengan etanol
warna ungu yang diikat oleh bakteri gram negatif luntur, sedangkan pada bakteri gram negatif
tidak. Pada gram negatif lemak terekstraksi dari dinding sel sehingga pori membesar dan
kompleks violet kristal-iodin keluar sel, sedangkan pada gram posotif dinding sel dehidrasi, pori
berkerut dan permeabilitas rendah sehingga kompleks violet kristal-iodin terperangkap antara
dinding sel dan membran sitoplasm sehingga sel tetap biru/ungu. Saat penambahan safranin,
bakteri gram negatif mengikatnya sedangkan gram negatif melewatkannya.
 BAB I

PENDAHULUAN

1.1 Latar Belakang

Bakteri memiliki beberapa bentuk yaitu basil (tongkat), kokus, dan spirilum. Bakteri yang
berbentuk tongkat maupun kokus dibagi menjadi beberapa macam. Pada bentuk basil
pembagiannya yaitu basil tunggal, diplobasil, dan tripobasil. Sedangkan pada kokus dibagi
monokokus (satu buah bakteri berbentuk kotak), diplococcus, sampai staphylococcus (bentuknya
mirip buah anggur. Khusus pada spirul hanya dibagi 2 yaitu setengah melengkung dan tidak
melengkung.

Bakteri juga dapat dibedakan melalui teknik pewarnaan gram. Teknik pewarnaan gram
tersebut dapat menghasilkan warna merah dan ungu. Bakteri gram negatif ditandai dengan
pewarnaan ungu sedangkan yang positif berwarna merah (Textbook, 2008). Hal ini bertujuan
untuk memberikan warna pada bakteri pada akhirnya dapat diidentifikasi dengan mudah. Selain
itu, ada endospore yang bisa diwarnai. Endospora adalah organisme yang dibentuk dalam kondisi
yang stres karena kurang nutrisi, yang memiliki kemungkinan untuk tetap berlanjut di
lingkungan sampai kondisi menjadi baik (Ncbi, 2008).

Teknik pewarnaan gram haruslah sesuai prosedur karena dapat mengakibatkan kesalahan
identifikasi data apakah gram positif atau gram negatif sehingga diperlukan adanya praktikum ini
dilakukan agar mengetahui jalannya mekanisme pewarnaan gram.

1.2 Perumusan Masalah

Rumusan masalah adalah faktor-faktor apa sajakah yang berpengaruh terhadap

keberlangsungan pewarnaan pada bakteri dan endospora, bagaimanakah karakteristik dari ketiga
spesimen, serta bagaimana teknik pengecatan

1.3 Tujuan

Tujuan praktikum adalah mempelajari proses pewarnaan struktur sel bakteri, mempelajari
bentuk-bentuk dan struktur sel bakteri dan memahami pentingnya setiap langkah dalam prosedur
pewarnaan dan memahami reaksi kimia di dalam prosedur tersebut

BAB II

TINJAUAN PUSTAKA

Metode pengecatan pertama kali ditemukan oleh Christian gram pada tahun 1884. Dengan
metode ini, bakteri dapat dikelompokkan menjadi dua, yaitu bakteri gram positif dan gram
negatif yang didasarkan dari reaksi atau sifat bakteri terhadap cat tersebut. Reaksi atau sifat
bakteri tersebut ditentukan oleh komposisi dinding selnya sehingga pengecatan gram tidak bisa
dilakukan pada mikroorganisme yang tidak mempunyai dinding sel seperti Mycoplasma sp.
(Tryana, S.T, 2008).

Struktur bakteri terbagi menjadi dua yaitu:

1. Struktur dasar (dimiliki oleh hampir semua jenis bakteri)

Meliputi: dinding sel, membran plasma, sitoplasma, ribosom, DNA, dan granula
penyimpanan

2. Struktur tambahan (dimiliki oleh jenis bakteri tertentu)

Meliputi kapsul, flagelum, pilus, fimbria, klorosom, Vakuola gas dan endospora

Gambar Struktur Dasar Bakteri

Gambar Bakteri Gram Positip dan Bakteri Gram Negatif

(Edukasi, 2008).

Staphylococcus adalah bakteri Gram-positif yang berbentuk bola. Bakteri ini ada yang
berkoloni dan berbentu seperti buah buah anggur. Pada tahun 1884, Rosenbach menjelaskan ada
dua jenis warna staphylococci yaitu: Staphylococcus Aureus yang berwarna kuning dan
Staphylococcus albus yang berwarna putih. Beberapa karakterististik yang dimiliki
Staphylococcus Aureus diantaranya hemolytic pada darah agar, catalase-oxidase-positif dan
negatif, dapat tumbuh pada suhu berkisar 15 sampai 45 derajat dan lingkungan NaCl pada
konsentrasi tinggi hingga 15 persen dan menghasilkan enzim coagulase. Selain itu,biasanya S.
Aureus merupakan patogen seperti bisul, styes dan furunculosis beberapa infeksi (radang paru-
paru, radang kelenjar dada, radang urat darah, meningitis, saluran kencing osteomyelitis dan
endocarditis serta menyebabkan keracunan makanan yaitu dengan melepakan enterotoxins
menjadi makanan sehingga menjadi toksik dengan melepasan superantigens ke dalam aliran
darah (Kenneath, 2008).

Bacillus subtilis merupakan bakteri gram-positif yang berbentuk batang,dan secara alami
sering ditemukan di tanah dan vegetasi. Bacillus subtilis tumbuh di berbagai mesophilic suhu
berkisar 25-35 derajat Celsius. Bacillus subtilis juga telah berevolusi sehingga dapat hidup
walaupun di bawah kondisi keras dan lebih cepat mendapatkan perlindungan terhadap stres
situasi seperti kondisi pH rendah (asam), bersifat alkali, osmosa, atau oxidative kondisi, dan
panas atau etanol Bakteri ini hanya memilikin satu molekul DNA yang berisi seperangkat set
kromosom. DNAnya berukuran BP 4214814 (4,2 Mbp) (TIGR CMR). 4,100 kode gen protein.
Beberapa keunggulan dari bakteri ini adalah mampu mensekresikan antibiotik dalam jumlah
besar ke luar dari sel (Scetzer, 2006).

Menurut Kenneath tahun (2008), Escherichia coli termasuk dalam famili Enterobacteraceae
yang termasuk gram negatif dan berbentuk batang yang fermentatif. E. coli hidup dalam jumlah
besar di dalam usus manusia, yaitu membantu sistem pencernaan manusia dan melindunginya
dari bakteri patogen. Akan tetapi pada strain baru dari E.coli merupakan patogen berbahaya yang
menyebabkan penyakit diare dan sindrom diare lanjutan serta hemolitik uremic (hus). Peranan
yang mengguntungkan adalah dapat dijadikan percobaan limbah di air, indikator pada level
pencemaran air serta mendeteksi patogen pada feses manusia yang disebabkan oleh Salmonella
typhi. (Mikrolibrary, 2008). Endospore adalah organisme yang dibentuk dalam kondisi yang
stres karena kurang nutrisi, yang memiliki kemungkinan untuk tetap berlanjut di lingkungan
sampai kondisi menjadi baik (Ncbi, 2008).

Bakteri juga dapat dibedakan melalui teknik pewarnaan gram. Teknik pewarnaan gram
tersebut dapat menghasilkan warna merah dan ungu. Bakteri gram negatif ditandai dengan
pewarnaan ungu sedangkan yang positif berwarna merah (Textbook, 2008).

BAB III

METODE PENELITIAN

3.1 Waktu dan Tempat

Praktikum “Pewarnaan Sel (Bakteri dan Jamur) dan Pewarnaan dan Endospora”
dilaksanakan pada hari Rabu 24 September 2008 pukul 13.00-16.00 WIB di Laboratorium
Mikrobiologi, Jurusan Biologi, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Universitas
Brawijaya, Malang.

3.2 Cara Kerja

3.2.1 Pewarnaan Bakteri

Gelas objek dan gelas penutup dibersihkan dengan alkohol 70% kemudian ditetesi dengan
aquades steril. Kemudian dibuat apusan dari biakan miring dan disuspensikan sampel sampai
homogen, lalu difiksasi di atas api bunsen. Apusan bakteri yang telah jadi ditetesi gram A selama
1 menit, dicuci denan air mengalir, dan dikeringanginkan. Kemudian ditetesi gram B selama 1
menit, dicuci dengan air mengalir, dan dikeringanginkan. Kemudian ditetesi gram D selama 30
detik, dicuci dengan air mengalir, dan dikeringanginkan. Lalu diamati dengan mikroskop dengan
perbesaran 1000 x, kemudian dicatat bentuk dan warna sel bakteri

3.2.2 Pewarnaan Endospora

Gelas objek dan gelas penutup dibersihkan dengan alkohol 70% kemudian ditetesi dengan
aquades steril. Kemudian dibuat apusan dari biakan miring dan disuspensikan sampel sampai
homogen, lalu difiksasi di atas api bunsen. Apusan bakteri digenangi dengan pewarna malakit
hijau lalu dipanaskan preparat di atas penangas air mendidih sampai muncul uap air (10 menit)
dan dijaga jangan sampai pewarna kering. Kemudian dicuci dengan air mengalir,
dikeringanginkan, diwarnai dengan safranin (1-2 menit) lalu dicuci dengan air mengalir dan
dikeringanginkan lagi. Kemudian diamati ada tidaknya spora dalam sel (bentuk, letak, ukuran
terhadap sel vegetatif) menggunakan mikroskop dengan perbesaran.
 BAB IV

HASIL DAN PEMBAHASAN

4.1 Analisis Prosedur

Pewarnaan Bakteri an Endospora dilakukan dengan menggunakan 8 isolat bakteri untuk 8

kelompok yang bertujuan untuk mengidentifikasi bentuk kedelapa bakteri tersebut dan termasuk
dalam bakteri gram positif atau negatif dan letak endosporanya. Proses perwarnaan dilakukan
dengan membersihkan gelas objek dan gelas penutup dengan alkohol 70% untuk sterilisasi agar
tidak kontaminasi. Kemudian ditetesi aquades steril untuk meletakkan bakteri dan dibuat
preparat apusan dari biakan miring agar mudah diamati dan difiksasi. Sampel disuspensikan
sampai homogen agar bakteri dapat menyebar di gelas objek dan tidak menumpuk. Kemudian
difiksasi di atas api bunsen yang bertujuan untuk membunuh bakteri secara cepat dengan tidak
merubah bentuk dan struktur bakteri, melekatkan bakteri di atas objek gelas dan meningkatkan
sifat salinitas pewarna (Tortora, 2002). Proses pewarnaan bakteri dengan cara apusan bakteri
yang telah dibuat kemudian ditetesi dengan gram A selama 1 menit, gram B selama 1 menit,
gram C selama 1 menit, dan gram D selama 30 detik. Setelah perlakuan pewarnaan, preparat
selalu dicuci dengan air mengalir dan dikeringanginkan, kecuali setelah pewarnaan gram B
preparat dicuci dengan gram C kemudian dikeringanginkan. Hal ini dilakukan karena gram C
mengandung alkohol yang bertujuan untuk melunturkan cat sebelumnya. Gram A mengandung
kristal violet yang berwarna ungu merupakan cat primer yang akan mewarnai bakteri, pewarnaan
dilakukan 1 menit agar cat ini dapat melekat sempurna pada dinding bakteri. Gram B
mengandung garam iodin merupakan cat mordan yang berfungsi melekatkan atau memfiksasi cat
primer yang diserap bakteri, dilakukan selama 1 menit agar pengikatan warna oleh bakteri
menjadi lebih kuat. Gram C mengandung alkohol sehingga tidak berwarna dan berfungsi untuk
melunturkan cat sebelumnya, dilakukan selama 1 menit agar cat dapat luntur secara sempurna
dan tidak ada yang tersisa. Gram D mengandung safranin sehingga bewarna merah yang
merupakan cat sekunder atau kontras berfungsi untuk memberikan warna bakteri non target,
dilakukan selama 30 detik agar bakteri yang catnya telah luntur dapat terwarnai (Heritage, 2000).
Pencucian dengan air mengalir dimaksudkan agar cat dapat hilang secara sempurna dan tidak
tersisa, dikeringanginkan bertujuan agar warna melekat pada bakteri dan segera kering sehingga
bila diwarnai lagi warna sebelumnya tidak tercampur dengan warna yang baru. Kemudian dilihat
di bawah mikroskop dengan perbesaran 1000 x agar dapat mengamati bentuk dan warna sel
bakteri. Bakteri gram positif akan berwarna ungu, sedangkan bakteri gram negatif akan berwarna
merah.

Proses pewarnaan endospora dilakukan setelah fiksasi dan setelah dibuat apusan preparat.
Kemudian preparat digenangi malakit hijau yang berfungsi sebagai pewarna primer yang
digunakan untuk melumuri fiksasi panas dan dipanaskan sampai menggepul. Preparat
dipanaskan di atas penangas air mendidih sampai timbul uap air (10 menit) bertujuan membantu
warna menembus dinding endospora dan dijaga jangan sampai pewarna kering. Kemudian dicuci
dengan air mengalir dan dikeringanginkan bertujuan menghilangkan malakit hijau dari seluruh
bagian sel endospora. Pewarnaaan dengan safrani (1-2 menit) bertujuan sebagai counterstain
yang digunakan untuk melumuri bagian warna dari sel yang lain daripada endospora (Prescot,
2002). Kemudian dicuci dengan air mengalir agar warna safranin luntur dan dikeringanginkan
agar warna cepat kering.

4.2 Data Hasil Penelitian

No.

Nama dan Gambar

Karakteristik

Gram

1.

Staphlococcus aereus

2.

Bacillus subtilis

3.

Escherichia coli

4.3 Analisis Hasil

Pewarnaan bakteri dilakukan pada isolat staphylococcus aereus adalah gram positif yang
berbentuk kokus atau lingkaran sterik dengan diameter sel mencapai 1µm, koloninya berbentuk
seperti buah anggur (Textbook, 2008). Pada bacillus subtilis, koloninya bergerombol sedikit
erpisah-pisah bahkan membentuk rantai panjang (hasil pengamatan). Pada Eschericia coli,
koloninya tersusun rantai memanjang. Pada bakteri ini tidak ditemukan endospora, pada saat
diwarnai menunujukkan warna merah.

1.Staphylococcus aureus.

Gambar. Staphylococcus aerreus

Staphylococcus aereus pada pewarnaan gram diketahui berwarna ungu sehingga termasuk
bakteri gram positif. Bakteri ini berbentuk basil. Koloninya tersususn berjajar seperti rantai
memenjang. Jenis ini memiliki endospora yang terletak pada sentral. Staphylacoccus aereus
adalah gram positif yang berbentuk kokus atau lingkaran seperti sterik dengan diameter sel
mencapai 1 µm, dan koloninya seperti buah anggur. Perananya adalah dapat menghasilkan racun
sebagai penyebab sindrom trauma yang diderita oleh pria, wanita dan anak-anak. Sindrom racun
trauma tersebut berupa kejang, pingsan, turunnnya tekanan darah (Textbook, 2008).
 Klasifikasi Staphylococcus aureus.

Kingdom : Bakteri

Filum : Firmicutes

Kelas : Cocci

Famili : Staphylococcaaceae

Genus : Staphylacoccus

Spesies : Staphylacoccus aereus (it is, 2008)

2.Bacillus subtilis

Gambar Pengamatan Bacillus subtilis (1000 x)

Pada pengamatan dengan menggunakan mikroskop nampak Bacillus subtilis berbentuk

basil (batang) dan merupakan bakteri gram positif. Jenis ini memiliki endospora yang letaknya di
tengah. Bacillus subtilis merupakan bakteri yang berbentuk batang yang Gram-positif (Perez
2000). Bakteri ini tersusun atas peptidoglycan, yang merupakan polimer dari sugars dan asam
amino. Peptidoglycan yang yang ditemukan di bakteri yang dikenal sebagai murein. Sel
membentuk tembok penghalang antara lingkungan dan bakteri sel yang berguna untuk
mempertahankan bentuk sel dan withstanding sel yang tinggi internal tekanan turgor (Schaechter
2006).

Habitat endospora bakteri ini adalah tanah. Mikroba tersebut dalam bentuk spora yang
kekurangan nutrisi. Organisme ini dapat menghasilkan antibiotik selama sporulation. Contohnya
polymyxin, difficidin, subtilin, dan mycobacillin. Banyak dari mikroba Bacillus dapat
menurunkan Polymers seperti protein, pati, dan pektin, sehingga bakteri ini merupakan
penyumbang penting kepada siklus karbon dan nitrogen. Akan tetapi apabila terkontaminasi,
dapat menyebabkan pembusukan. Berdasarkan pewarnaan sel vegetatif didapatkan warna
kemerahan dan warna endosporanya adalah hijau (Schaechter 2006).

Klasifikasi Bacillus subtilis.

Kingdom : Bakteri

Filum : Firmicutes

Kelas : Bacilli

Order : Bacillales

Famili : Bacillaceae
 Genus : Bacillus

Spesies : Bacillus subtilis (itis, 2008)

3.Escherichia coli

Gambar 5. Pengamatan Escherichia coli. (1000 x)

Berdasarkan hasil pengamatan bakteri Eschericia coli. Berbentuk basil (batang) yang
pendek. Bakteri tersebut pada saat diwarnai menunjukkan warna merah. Koloninya tersusun
seperti rantai memanjang. Pada bakteri ini tidak ditemukan endospora. Menurut Kenneath tahun
(2008), Escherichia coli termasuk dalam famili Enterobacteraceae yang termasuk gram negatif
dan berbentuk batang yang fermentatif. E. coli hidup dalam jumlah besar di dalam usus manusia,
yaitu membantu sistem pencernaan manusia dan melindunginya dari bakteri patogen. Akan tetapi
pada strain baru dari E.coli merupakan patogen berbahaya yang menyebabkan penyakit diare dan
sindrom diare lanjutan serta hemolitik uremic (hus). Peranan yang mengguntungkan adalah dapat
dijadikan percobaan limbah di air, indikator pada level pencemaran air serta mendeteksi patogen
pada feses manusia yang disebabkan oleh Salmonella typhi. (Mikrolibrary, 2008).

Klasifikasi Escherichia coli.

Kingdom : Bakteria

Filum : Proteobacteria

Kelas : Gamma Proteobacteria

Order : Enterobacteriales

Famili : Enterobacteriaceae

Genus : Escheriachia

Spesies : E. coli (itis, 2008)

4.Pewarnaaan endospora

Komponen endospora mempunyai resistan terhadap agen kimia yang kuat pada spore coat,
yang terdiri dari cross-linked keratin. Identifikasi dapat dilakukan dengan melihat morfologi,
lokasi, dan ukuran endospora. Beberapa endospora mempunyai diameter lebih besar daripada sel,
dimana sel tersebut akan nampak menggembang pada letak endosporanya (Ncbi, 2008).

Letak endospora yang berbeda diantara spesies bakteri dapat digunakan untuk identifikasi.
Tipe utama diantara terminal, subterminal dan sentral. Tipe sentral atau tengah merupakan lokasi
dari sel vegetatif yang letaknya tepat di tengah. Tipe terminal memiliki penngertian letak el
vegetatif diantara ujung dan pinggir dari sel vegetatif. Tipe subterminal berarti lokasi
endosporanya diantara tengah dan pinggir dari sel vegetatif. Endospora dapat berukuran lebih
besar ataupunkecil dari sel vegetatif yang terdiri dari lapisan protein yang terbuat dari keratin.
Spora ini memiliki resistensi yang tinggi terhadap pewarnaan, prosedur pewarnaan dengan
malakit hijau adalah dengan pemanasan. Endospora merupakan metode pertahanan hidup yang
bukan bertujuan untuk reproduksi. Contohnya Bacillus subtilis memiliki endospora yang terletk
di subterminal (Ncbi, 2008). Hasil pengamatan pada endospora Bacillus subtilis berbeda dengan
literatur karena terdapat kesalahan pengamatan dan pengidentifikasian.

Ada beberapa faktor yang mempengaruhi pewarnaan bakteri yaitu fiksasi, peluntur warna,
subtrat, intensifikasi pewarnaan dan penggunaan zat warna penutup. Prinsip yang selalu harus
diingat dan dipatuhi adalah (Edukasi, 2008) :

Selalu mensterilkan ose, pada saat akan dipakai dan setelah dipakai.

Letakkan ose pada tempatnya, jangan diletakkan di sembarang tempat (misal di atas meja)

Jangan memegang mata (ujung) ose dengan tangan.

Usahakan tidak banyak bicara pada saat kerja

BAB V

KESIMPULAN DAN SARAN

5.1 Kesimpulan

Teknik pembuatan sediaan apusan (preparat) dapat dilakukan dengan mensuspesikan

biakan bakteri dengan aquades, kemudian difiksasi. Pewarnaan struktur sel bakteri dilakukan
dengan cat gram A, gram B, gram C, dan gram D. pewarnaan endospora dengan menggunakan
malakit. Bentuk sel bakteri yang ditemukan adalah basil (Bacillus subtilis., Escherichia coli.,
Staphylococcus aereus), dan kokus (tidak ada). Bakteri yang termasuk gram positif adalah
Bacillus subtillis. dan gram negartif Eschericia coli dan Staphylococcus aereus. Lama pewarnaan
dan langkah-langkah urutan pewarnaan harus diperhatikan. Etanol terhindin adap bakteri dapat
menyebabkan tereksistasinya lapisan lipid sehingga memperbesar daya serap atau permiabilitas
dinding sel gram negatif. Jadi kompleks ungu kristal iodium yang telah memasuki dinding sel
selama langkah awal dalam proses pewarnaan dapat tereksistasi. Karena itu organisme gram
negatif pewarnaan kehilangan warna tersebut, disebabkan kandungan lipidnya yang lebih rendah,
dinding sel bakteri gram positif menjadi terdehidrasi selama perlakuan dengan etanol.

5.2 Saran

Sebaiknya pada saat praktikum benar-benar diperhatikan prosedur pewarnaan terutama

pada lama waktu dan urutan pewarnaan agar tidak terjadi kesalahan dan warna yang terlalu tebal.
Pada saat pengembalian isolat juga diperhatikan apakah isolat tersebut benar-benar sudah
diangkat sehingga preparat apusan yang dihasilkan baik.