ONLINE WORKSHOP PEMERIKSAAN

POLYMERASE CHAIN REACTION (PCR) BAGI TENAGA ATLM

PRINSIP DASAR POLYMERASE CHAIN

REACTION (PCR)
Arie A. Nugraha, S.Si
Triyani Soekarso, S.Si

Jakarta, 15 - 19 Juni 2020

 METODE PEMERIKSAAN
• Rapid Test
• Nucleic Acid Amplification Test (NAAT)
• Tes Serologi
• Kultur Virus
 NUCLEIC ACID AMPLIFICATION TEST (NAAT)

• Mendeteksi antigen atau materi genetik

virus
• Sensitif dan spesifik
• Cepat
• Memerlukan tahapan persiapan sampel
• Perlu peralatan khusus
• Memerlukan fasilitas lab khusus BSL 2
• PCR
• Sequencing
 SEJARAH
• Teknologi PCR ditemukan Kary
Mullis pada era 1980an
• Tahun 1993 menerima Nobel
prize bidang kimia sebagai
penemu PCR

Dr. Kary B. Mullis

https://www.bonhams.com/auctions/23255/lot/93/
 PCR
• Polmerase Chain Reaction
• Perbanyakan DNA spesifik dengan
metode in vitro dan enzimatis
• Template: DNA
• Manfaat: Viral Load (HIV), Forensik, Mutasi
dan Deteksi/diagnosa penyakit)
 PCR / RT-PCR / qRT-PCR

PCR = Polmerase Chain Reaction

RT–PCR = Reverse Transcriptase–PCR

qRT-PCR = Realtime RT-PCR

 KOMPONEN REAGEN PCR
Taq Polymerase
Enzim yang berfungsi untuk membentuk untai
DNA komplementer pada template DNA
MgCl2
Menyediakan ion yang diperlukan untuk reaksi
enzimatis
dNTP’s (Deoxynucleotide triphosphates)
Nukleotida untuk membentuk strands DNA
(Adenine, Cytosine, Guanine, Thymine)
Buffer
Memelihara pH optimal untuk kerja enzim
 KOMPONEN REAGEN PCR
Primers
Menempel pada single-stranded template
DNA
Memulai reaksi pembentukan DNA utas baru
1. Forward primer
Menempel pada DNA anti-sense
2. Reverse primer
Menempel pada DNA sense

Template DNA/RNA
Template yang akan diperbanyak/diamplifikasi
 KOMPONEN REAGEN RT-PCR
PCR RT-PCR
• dNTP • dNTP
• Taq DNA polimerase • Taq DNA polimerase
• Ion Mg2+ • Ion Mg2+
• Buffer • Buffer
• Primer Forward • enzim Reverse
• Primer Reverse Transcriptase
• Template : DNA • Primer Forward
• Primer Reverse
• Template : RNA
PROSES PCR
Tahap 1: Denaturasi
ds DNA  ss DNA
60 detik, 90°-95°C

Tahap 2: Annealing
Penempelan Primer F dan
R , 30-45 detik, 50°-60°C

Tahap 3: Elongasi
Perpanjangan untai DNA baru
oleh Taq Polymerase
1-2 menit, 72°C
 PROSES PCR

David Rodriguez-
Lazaro/https://www.researchgate.net/

• Kemampuan PCR untuk menghasilkan jutaan copi DNA (amplikon) dalam

waktu yang sangat singkat menjadikan metoda tersebut sangat sensitif
• Tetapi, kemampuan tersebut bisa mengakibatkan timbulnya kontaminasi
sebagai hasil positif palsu (false positive)
 PROSES RT-PCR
1. Reverse Transcriptase

Denaturasi 2. PCR

Denaturasi
Annealing

Annealing

Elongasi

Elongasi
Proses PCR
 METODE PCR
KONVENSIONAL (gel based) REAL TIME

Kelebihan dan Kekurangan: Kelebihan dan Kekurangan:

• Murah • Mahal
• Lama • Cepat
• Memiliki sensitifitas tinggi
 KOMPONEN REAGEN qRT-PCR
Konvensional Real Time
• PCR Buffer (ion Mg) • PCR Buffer (ion Mg)
• dNTPs • dNTPs
• Enzim Reverse Transcriptase • Enzim Reverse Transcriptase
• Enzim Taq Polymerase • Enzim Taq Polymerase
• Primer Forward
• Primer Forward
• Primer Reverse
• Primer Reverse
• Probe

Probe: Sekuen oligonukleotida pendek yang didesain untuk

berhibridisasi dengan sekuen target

5’ 3’
KONVENSIONAL (gel based)
Specimen Thermal
Elektroforesis
Preparation Cycling
 qRT-PCR
Specimen Thermal Fluorescence Analysis by
Preparation Cycling detection Computer
 PROSES RT-PCR
Konvensional Real Time
1. Reverse Transciption 1. Reverse Transcripsion
2. PCR
2. PCR
- Denaturasi
- Annealing - Denaturasi
- Elongasi - Annealing
3. Elektroforesis (koleksi - Elongasi (koleksi data)
data) band 3. Nilai Ct
 Fasilitas Laboratorium PCR
Lay out untukLab PCR
Pre-PCR PCR

1 2 3
Area Reagensia Area proses Area Perbanyakan
spesimen dan analisa hasil

Alur kerja searah

Setiap area memiliki alat lab, reagen, bahan habis pakai, danAPD
masing-masing. TIDAK untuk dipindahkan ke ruangan lain
 Fasilitas Laboratorium PCR
Gambar denah laboratorium PCRLab. Virologi
Terimakasih