Nindya Ajeng Mandasari / 4401419024

6 April 2020

MORFOLOGI BAKTERI
Pengecatan Negatif dan Pengecatan Sederhana

A. TUJUAN

Untuk melihat bakteri dengan metode yang cepat, dengan memberi warna latar belakang
gelap atau dengan memberi warna bakteri, dipakai untuk mengukur besarnya bakteri dan
mengamati morfologi bakteri.

B. LANDASAN TEORI

Mikroorganisme yang ada di alam ini mempunyai morfologi, struktur dan sifat-
sifat yang khas, termasuk bakteri. Bakteri yang hidup hampir tidak berwarna dankontras
dengan air, dimana sel-sel bakteri tersebut disuspensikan.
Salah satu cara untuk melihat dan mengamati bentuk sel bakteri dalam keadaan
hidup sangat sulit, sehingga untuk diidentifikasi ialah dengan metode pengecatan atau
pewarnaan sel bekteri, sehingga sel dapat terlihat jelas dan mudah diamati. Hal tersebut
juga berfungsi untuk mengetahui sifat fisiologisnya yaitu mengetahui reaksi dinding sel
bakteri melalui serangkaian pengecatan. Oleh karena itu teknik pewarnaan sel bakteri ini
merupakan salah satu cara yang paling utama dalam penelitian-penelitian mikrobiologi.

Sel bakteri tidak berwarna sehingga sulit dan sukar diamati secara langsung.
Untuk mempermudah pengamatan morfologi bakteri diperlukan pewarnaan. Proses
pewarnaan bakteri lazim disebut pengecatan (Gandjar dkk., 1992).
Zat yang digunakan untuk mewarnai bakteri termasuk biological dye. Zat
pewarna/cat yang digunakan untuk mewarnai bakteri mempunyai dua sifat utama, yaitu
mempunyai kelompok kromofor dan memiliki ikatan dengan sel secara ionik, kovalen,
atau hidrofobik. Kromofor merupakan gugus pemberi warna dari biological dye (Prescott
dkk., 2002).
Ada tiga macam pengecatan yang umum digunakan, yaitu pengecatan negatif,
pengecatan sederhana, dan pengecatan diferensial. Pengecatan negatif dilakukan untuk
mewarnai latar belakang preparat dan bakteri tidak terwarnai. Pengecatan sederhana
dilakukan dengan memakai satu macam larutan cat. Sel bakteri akan berwarna sesuai
dengan jenis cat yang dipakai. Sementara itu, pengecatan diferensial dilakukan dengan
memakai beberapa macam larutan zat. Hasil dari pengecatan diferensial
mengelompokkan bakteri ke dalam kelompok-kelompok tertentu (Gandjar dkk., 1992).
Pengecatan negatif memiliki prinsip dasar, yaitu dengan mengkontraskan latar
belakang sel (dibuat menjadi lebih gelap) sehingga sel yang tidak bewarna menjadi lebih
 terlihat. Pewarna yang digunakan adalah pewarna asam. Pengecatan negatif cocok
digunakan untuk observasi bentuk sel, ukuran sel, dan kapsul (Tortora dkk., 2010).
Pengecatan sederhana menggunakan satu macam zat warna. Pengecatan
sederhana biasanya digunakan untuk melihat bentuk dan susunan sel bakteri. Pewarna
yang digunakan biasanya pewarna basa. Terkadang pada pengecatan sederhana
digunakan zat mordant, yaitu zat yang dapat meningkatkan afinitas antara cat dengan sel
bakteri sehingga sel bakteri lebih terwarnai (Tortora dkk., 2010).

C. ALAT DAN BAHAN

ALAT :
 Mikroskop
 Objek glass dan gelas penutup
 Ose bulat (inoculum)
 Pipet tetes
 Tisu
 Lampu spiritus

BAHAN:

 Pewarna safranin 0,25%

 Larutan NaCl
 Biakan bakteri
 Cat nigrosin
 Minyak emersi
 Aquades

D. LANGKAH KERJA
I. Pewarnaan Negatif
1. Meneteskan nigrosin pada salah satu sisi ujung dari objek glass yang telah
steril
2. Memijarkan ose bulat pada api spiritus, gunanya untuk mensterilkan alat
3. Menunggu beberapa saat hingga pijar pada ose bulat mati
4. Kemudian, mengambil bakteri dari kultur murni
5. Setelah itu mensuspensikan bakteri dengan zat warna pada objek glass
6. Meletakkan objek glass lain di atas objek glass yang mengandunng
suspensi bakteri dan zat warna dengan sudut 45o
7. Menarik objek gass, sehinga suspense pewarna dapat menyebar merata
8. Membiarkan hingga kering (tanpa dipanaskan)
9. Lalu, meneteskan minyak imersi dan amati dengan mikroskop dengan
perbesaran 1000x
 II. Pewarnaan Sederhana
1. Mensterilkan objek glass menggunakan api spiritus
2. Meneteskan larutan NaCl pada objek glass kira-kira satu tetes
menggunakan pipet tetes
3. Memanaskan ose bulat hingga berpijar menggunakan api spiritus
4. Tunggu beberapa saat agar pijar pada ose bulat mati
5. Mengambil biakan bakteri menggunakan ose bulat
6. Kemudian, meletakkan biakan bakteri ke atas objek glass yang telah steril
hingga rata
7. Pijarkan kembali ose bulat yang telah digunakan untuk mengambil biakan
bakteri
8. Memanaskan preparat di atas api spiritus dengan cara di geser-geser
sebanyak 3 kali
9. Menunggu hingga preparat mengering
10. Setelah itu, meneteskan pewarna safranin 0,25% dan tunggu hingga 2
menit
11. Membilas preparat menggunakan aquades, lau mengeringkannya dengan
tisu
12. Mengamati preparat dengan mikroskop

E. PRINSIP PRAKTIKUM

I. Pewarnaan Negatif
Memberikan warna pada latar belakang bakteri dengan pewarna yang cenderung
gelap ( bukan mewarnai biakan bakteri) agar bakteri dapat diamati morfologinya.

II. Pewarnaan Sederhana

Memberikan warna pada bekteri dengan pewarna yang dapat berikatan dengan
permukaan sel bakteri sehingga bakteri dapat terlihat dan dapat diamati
morfologinya.

F. HASIL PENGAMATAN
I. Pewarnaan Negatif
Pada pewarnaan ini terlihat bahwa pada latar belakang bakteri berwarna lebih
gelap sehingga bakteri yang
berwarna putih dapat
teramati. Bentuk bakteri
batang dengan latar
berwarna biru.
 II. Pewarnaan Sederhana
Pada pearnaan ini
terlihat bahwa
bakteri diberikan
pewarnaan
dengan pewarna
yang dapat berikatan
dengan
permukaan sel
bakteri sehingga
bakteri dapat
diamati. Terlihat
bakteri berwarna merah dari pewarna safranin.

G. PEMBAHASAN

I. Pengecatan negatif menggunakan tinta cina atau nigrosin. Tinta cina atau
nigrosin merupakan jenis pewarna asam dan bermuatan negatif. Tinta cina tidak
akan bisa berikatan dengan dinding sel dari bakteri karena sama-sama bermuatan
negatif, sehingga tinta cina hanya akan mewarnai permukaan preparat atau
dengan kata lain membuat gelap latar belakang dari bakteri. Prinsip dari
pengecatan negatif adalah membuat kontras latar belakang objek sehingga objek
yang transparan dan tidak terwarnai menjadi lebih jelas terlihat.
Pengecatan negatif tidak memerlukan proses fiksasi terlebih dahulu,
karena proses fiksasi dapat membuat sel menjadi mengkerut. Biasanya,
 pengecatan negatif berfungsi untuk melihat bentuk, ukuran dan kapsul sel. Jika
pada pengecatan negatif dilakukan juga proses fiksasi, akan membuat perubahan
pada ukuran sel sehingga ukuran sel menjadi tidak akurat. Lagipula, salah satu
fungsi dari proses fiksasi adalah untuk membuat proses pewarnaan bakteri
menjadi lebih baik. Sementara itu, pengecatan negatif hanya mewarnai latar
belakang dan tidak akan mewarnai permukaan sel sehingga proses fiksasi tidak
perlu dilakukan.
Faktor-faktor yang memengaruhi proses pewarnaan adalah faktor warna,
dinding sel bakteri, dan proses pewarnaan. Cat atau pewarna bisa bersifat asam
atau basa, selanjutnya pemakaiannya disesuaikan dengan pengecatan yang akan
dibuat. Jika akan melakukan pengecatan negatif, pewarna yang digunakan adalah
pewarna asam karena pewarna asam tidak akan berikatan dengan dinding sel.
Sementara itu, proses pewarnaan dapat memengaruhi baik tidaknya hasil
pengecatan.
II. Pewarnaan sederhana dengan menggunakan pewarna safranin. Permukaan
sel bakteri akan menjadi berwarna merah setelah diwarnai dengan pewarna
safranin. Safranin adalah jenis pewarna basa yang bermuatan positif sehingga
dapat berikatan dengan permukaan sel bakteri.
Sebelum melakukan proses pewarnaan sederana, perlu dilakukan proses
fiksasi. Proses fiksasi mempunyai fungsi yang banyak dalam membantu proses
pengecatan menjadi lebih baik. Salah satu fungsi dari fiksasi yaitu dapat
menginaktivasi enzim yang dapat merusak morfologi sel atau menguatkan
struktur sel sehingga dapat menyulitkan proses pewarnaan. Selain itu, fiksasi
dapat mempertahankan posisi sel, membunuh sel, dan melekatkan sel dengan
preparat sehingga sel bakteri tidak hilang ketika proses pencucian. Fiksasi
dilakukan dengan cara melewatkan gelas objek di atas nyala api sebanyak 3-4
kali.
Faktor-faktor yang memengaruhi pewarnaan sederhana adalah faktor cat,
permukaan sel bakteri itu sendiri, dan faktor proses pewarnaan. Cat dan
permukaan sel bakteri harus yang mempunyai ion yang berlawanan sehingga cat
dapat berikatan dengan permukaan sel bakteri. Sebagai contoh, safranin yang
memiliki ion bermuatan positif akan berikatan dengan permukaan sel bakteri yang
umumnya memiliki ion bermuatan negatif. Proses pewarnaan sederhana yang
cukup penting adalah pada saat proses fiksasi. Pengerjaan proses fiksasi yang
tidak benar akan membuat pengecatan menjadi kurang baik, misalnya sel bakteri
masih hidup, sel bakteri hilang ketika proses pencucian, dan sel tidak mampu
diwarnai oleh zat pewarna.

H. KESIMPULAN
1. Pewarnaan bakteri dipengaruhi faktor-faktor antara lain fiksasi, pelunturan warna,
substrat, intensifikasi pewarnaan dan penggunaan zat warna penutup
 2. Pewarnaan sederhana digunakan untuk melihat bentuk dan struktur sel bakteri dengan
menggunakan satu jenis pewarna seperti safranin atau kristal violet dengan
memberikan warna pada bakteri.
3. Pewarnaan negative digunakan untuk melihat bentuk dan struktur sel bakteri dengan
menggunakan pewarna cat nigrosin dengan memberi warna pada latar belakang
bakteri.

REFERENSI

Dwidjoseputro, D. 2005. Dasar-Dasar Mikrobiologi. Jakarta : Djambatan

Hadiutomo. 1990. Mikrobiologi Dasar Jilid I . Jakarta: Erlangga
Prescott, L. M., Harley, & Klein. 2002. Microbiology, 5th ed.
Tamam, Badrut. 2016. Cara, Teknik, dan Prinsip Pewarnaan / Pengecatan Bakteri,
dalam https://www.generasibiologi.com/2016/12/jurnal-cara-teknik-prinsip-
tujuan-pewarnaan-morfologi-bakteri.html, diakses pada 6 April 2020
Tortora, G. J., B. R. Funke & C. L. Case. 2010. Microbiology: An introduction, 10th ed.

Jawaban Pertanyaan
1. Jelaskan prinsip antara p negatif dengan p sederhana
Pewarnaan negatif yaitu pewarnaan yang ditunjukan terhadap bakteri yang sulit diwarnai
dimana bakterinya tidak diwarnai melainkan latar belakangnya sedangkan pewarnaan
sederhana adalah mengidentifikasi morfologi sel bakteri dengan menggunakan zat warna
tunggal. Prinsipnya yaitu pewarnaan ini hanya menggunakan satu macam zat warna saja.
2. Menurut saya pada pewarnaan negatif tidak sepenihnya sesuai SOP Karena di
dalam video tersebut banyak yang sepertinya belum steril seperti meletakan preparat pada
meja yang tidak tau sebelumnya sudah disterilisasikan atau belum dan tidak menggunakan
sarung tangan lateks sedangka pada video pewarnaan sederhana menurut saya sudah sesuai
dengan SOP
3. Prinsip pewarnaan spora yaitu suatu metode pewarnaan yang menggunakan
malachite green dan safranin, yang dalam hasilnya pewarnaan akan muncul warna hijau
pada sporanya dan warna merah pada sel vegetatifnya . Crystal violet atau ungu gentian
adalah pewarna triarylmethane. Pewarna ini digunakan sebagai histologis noda dalam
metode gram klasifikasi bakteri. Crystal violet memiliki sifat sifat anti bakteri, jamur dan
obat cacing, dan sebelumnya penting sebagai antiseptik topikal .
Pengamatan spora khamir menggunakan metode pewarnaan tahan asam atau Ziehl Neelsen
(ZN). Pewarnaan ini menggunakan pewarna utama carbol fuksin yang berwarna merah.
Askus yang berisi spora khamir akan tampak sebagai kumpulan yang sedikit berwarna
kemerahan. Hal ini dikarenakan spora S. cerevisiae tersimpan dalam askus yang cukup
kuat bertahan dari berbagai cekaman lingkungan seperti kekeringan dan asam. Oleh karena
sifat askus ini, S. cerevisiae dapat diawetkan dalam bentuk ragi.S. cerevisiae memiliki 2
cara perkembangbiakan, yaitu secara seksual dan aseksual. Cara aseksual yaitu dengan
bertunas. Cara seksual yaitu dengan fusi (penggabungan) dua sel dengan mating type (tipe
perkawinan) yang berbeda. S. cerevisiae memiliki mating type a dan α. Zigot hasil fusi ini
kemudian akan membentuk 4 spora dalam askus. Normalnya askus ini berisi dari 2 spora a
dan 2 spora α. Spora ini akan tumbuh menjadi sel kemudian berkembang dengan cara
bertunas hingga terjadi fusi kembali (