Anda di halaman 1dari 9

MAKALAH

WESTERN BLOT

Di susun untuk memenuhi tugas


Mata kuliah : Teknik Analisa molekuler II
Dosen pengampu : Dhika Juliana sukmana, S.Si., M.Sc

OLEH
KELOMPOK 1

1. ADI FIRMANSYAH
2. AHMAD RONI SAPUTRA
3. ABDUL HAMID
4. AINUN LATIFAH
5. ANGGIA OKTAVIANI
6. AGUSTINA
7. AYUK PRADILA
8. AZZAHRA TARI ASTERLY
9. BAIQ ADINDA OKTAVIA

POLITEKNIK MEDICA FARMA HUSADA MATARAM


TEKNOLOGI LABORATORIUM MEDIK
2021
KATA PENGANTAR

Assalamu’alaikum,,, Wr,,, Wb,,,

Puji syukur kehadirat ALLAH SWT yang telah memberikan rahmat dan hidayah-Nya
sehingga kami dapat menyelesaikan tugas makalah yang berjudul “ WESTERN BLOT “
Ini tepat pada waktunya.

Adapun tujuan dari penulisan dari makalah ini adalah untuk memenuhi tugas dari dosen
pada matakuliah “ TEKNIK ANALISA MOLEKULER II “. selain itu, makalah ini juga
bertujuan untuk menambah wawasan tentang western blot bagi para pembaca dan penulis.

Kami mengucapkan terima kasih kepada IBU DHIKA JULIANA SUKMANA. S.SI.,
M.SC. selaku dosen matakuliah Teknik Analisa molekuler, yang telah memberikan tugas
ini sehingga dapat menambah pengetahuan dan wawasan sesuai dengan bidang studi yang
di tekuni.

Kami juga mengucapkan terima kasih kepada semua pihak yang telah membagi sebagian
pengetahuannya sehingga kami dapat menyelesaikan makalah ini.

Kami menyadari, makalah yang kami tulis ini masih jauh dari kata sempurna. Oleh karena
itu, kritik dan saran yang membangun akan kami nantikan demi kesempurnaan makalah ini

Wabiilahi tofil walhidayah


Wassalamu’alaikum Wr,,, Wb,,,

Kamis, 25 february 2021

penulis
DAFTAR ISI

JUDUL ………………………………………………………………………….. i

KATA PENGANTAR ………………………………………………………….. ii

DAFTAR ISI …………………………………………………………………… iii

BAB I PENDAHULUAN

A. Latar belakang masalah ………………………………………………. 1


B. Rumusan masalah ……………………………………………………... 1
C. Tujuan pembahasan …………………………………………………… 1

BAB II PEMBAHASAN

BAB III PENUTUP


A. Kesimpulan
B. Saran

DAFTAR PUSTAKA
BAB I
PENDAHULUAN

A. Latar Belakang

Western blot adalah teknik untuk mengidentifikasi antibodi spesifik pada protein yang
telah dipisahkan antara satu dengan yang lain menurut ukurannya melalui elektroforesis
gel. Blot merupakan sebuah membran, biasanya berbahan dasar nitroselulose atau PVDF
(Polyvynilidine fluoride). Gel diletakkan diatas membran dan aliran listrik akan
menginduksi protein pada gel untuk berpindah pada membran. Membran tersebut akan
menjadi replika dari pola protein pada gel yang kemudian diwarnai secara sekuensial
dengan antibodi.

Western blot digunakan secara luas untuk mengidentifikasi dan mengkuantifikasi protein
yang spesifik dalam campuran yang kompleks. Teknik ini memungkinkan deteksi tidak
langsung sampel protein yang diimobilisasi pada membran nitroselulose. Sampel protein
terlebih dahulu di running dengan SDS – PAGE dan secara elektroforesis ditransfer ke
membran. Setelah langkah blocking, membran di probe dengan antibodi primer baik
monoclonal maupun poliklonal yang jumlahnya meningkat dibanding antigen. Setelah
pencucian yang sekuensial, membran kemudian diinkubasi dengan antibody sekunder
yang dikonjugasi dengan enzim yang sifatnya reaktif terhadap antibodi. Pada akhirnya,
membran dicuci kembali dengan substrat dari enzim yang tepat yang akan memproduksi
sinyal yang dapat direkam (Pierce, 2011).

Saat ini, telah banyak reagen antibodi baik poliklonal maupun monoklonal untuk 10.000
jenis protein. Sehingga western blot sangat bermanfaat untuk digunakan bersama antibody
tersebut. Western blot dapat memberikan informasi tentang berat molekul protein dan
jumlah ekspresi protein. Western blot dapat menganalisis sampel protein dari sel maupun
jaringan.

B. Tujuan

Adapun tujuan nya adalah untuk :


1. mengetahui pengertian dari western blot
2. mengetahui tujuan dari western blot
3. Mengetahui prinsip kerja dari Western blot.
4. Mengetahui prosedur Western blot.

C. Rumusan masalah
Adapun rumusan masalah nya adalah :
1.apa penegrtian dari western blot ?
2. apa tujuan dari western blot ?
3. apa prinsip kerja western blot ?
4. apa prosedur kerja dari western blot ?
BAB II
PEMBAHASAN

A.pengertian western blot


Merupakan suatu Teknik untuk menandai suatu protein pada membrane nitroselulosa,
nilon, atau transfer membrane lain setelah protein tersebut terpisahkan melalui
elektroforesis. Protein tersebut kemudian dideteksi melalui meetode autoradiogrfi,
pelabelan dengan senyawa – senyawa fluoresen, pelabelan dengan antobodi yang terikat
protein, lektin atau gen pengikat spesifik lainnya ( Attwood et al., 2006 ).
Berdasarkan pengertian tersebut, WB dilakukan melalui beberapa tahap, yaitu : (gambar 1)
( kindt et al., 2007 )

Pada tahap pertama, protein yang diinginkan dari sampel secara elektroforesis.
Elektroforesis merupakan pemisahan protein berdasarkan ukuran molekul dalam suatu
tegangan listrik tertentu. Dalam elektroforesis, biasanya sampel yang mengandung protein
biasanya berhubungan dengan SDS. SDS merupakan suatu detergen yang memiliki
muatan negatif. Muatan negatif SDS tersebut mengganggu kestabilan protein, sehingga
protein mengalami denaturasi. Interaksi ionik, jembatan disulfida, ikatan hidrogen yang
menyebabkan suatu protein mengalami pelipatan untuk menjaga kestabilannya menjadi
tidak terganggu karena adanya SDS. Suatu protein multimer juga akan menjadi monomer
penyusunnya. Akibatnya, protein-protein yang ada dalam sampel membentuk suatu rantai
polipeptida lurus. Semakin besar molekul suatu protein, maka rantai polipeptida tersebut
semakin panjang. Sampel dengan protein rantai polipeptida lurus dimasukkan dalam suatu
membran poliakrilamid yang dialiri arus listrik. Protein yang telah bermuatan negatif akan
bergerak dari kutub negatif menuju kutub positif. Laju pergerakan protein dalam membran
poliakrilamid berbeda-beda tergantung pada daya hambat antara protein dan membran.
Protein yang berukuran lebih besar akan memiliki daya yang lebih lambat sehingga
pergerakannya menjadi lebih lambat dibandingkan dengan pergerakan protein yang
berukuran lebih kecil. Setelah dialiri arus listrik selama beberapa waktu, masing-masing
protein akan terpisah berdasarkan ukuran molekulnya. Protein yang lebih kecil atau
memiliki berat molekul rendah akan bergerak lebih jauh dibanding protein yang lebih
besar.

Tahap kedua dalam WB yaitu pemindahan protein dari gel poliakrilamid menuju gel
transfer. Tahap pemindahan tersebut menggunakan arus listrik sebagai faktor pendorong
transfer protein. Oleh karena itu, proses pemindahan tersebut disebut juga elektrotransfer.
Elektrotransfer dapat dilakukan dengan dua metode, yaitu (Bollag et al. , 1996):

1. Blotting semikering
Blotting semikering menggunakan kertas saring yang telah dibasahi dengan buffer
transfer. Kertas saring tersebut ditempatkan di antara gel poliakrilamid dan gel
transfer. Transfer seperti ini dapat dilakukan selama 10-30 menit dengan arus lstrik
tertentu.
2. Menyeka basah
Blotting basah tidak menggunakan kertas saring diantara gel poliakrilamid dan gel
transfer, tetapi kedua gel tersebut diimpitkan dan direndam dalam buffer transfer.
Susunan-lapisan pada blotting basah diperlihatkan pada Gambar 3 (Wenk dan
Fernandis, 2007). Transfer dengan blotting basah dapat dilakukan 45 menit hingga
1 malam. Metode blotting basah lebih umum digunakan karena solusi metode
tersebut yang lebih baik.
Transfer gel yang umum digunakan pada WB ada dua, yaitu nitroselulosa dan
nilon. Pada sebagian besar aplikasi, nitroselulosa lebih umum digunakan karena
relatif tidak mahal dan bloking mudah dan cepat dilakukan. Nilon juga digunakan
terutama pada beberapa keadaan khusus. Pertama, kapasitas pengikatan dengan
protein yang dibutuhkan jauh lebih besar dari kapasitas pengikatan nitroselulosa
dan protein. Kedua, protein yang terikat sangat lemah pada nitroselulosa. Ketiga,
adanya kebutuhan resistensi terhadap tekanan mekanik (Bollag et al. , 1996).

Tahap ketiga merupakan deteksi protein yang telah dipindahkan ke transfer membran.
Deteksi protein tersebut memanfaatkan interaksi antara antigen dan antibodi yang bersifat
spesifik. Variasi metode-metode tersebut terutama terletak pada penggunaan primer
antibodi dan sekunder, serta penggunaan molekul penanda. Berdasarkan penggunaan
antibodi primer dan antibodi sekunder, ada dua metode deteksi, yaitu: metode langsung
dan metode tidak langsung. Metode langsung menggunakan primer antibodi yang telah
terkonjugasi dengan molekul marker. Metode tidak langsung menggunakan antibodi
primer dan antibodi sekunder. Antibodi primer berfunsi mengikat protein target,
sedangkan antibodi sekunder berfungsi mengikat antibodi primer dan terkonjugasi dengan
molekul penanda. Molekul penanda yang digunakan juga bervariasi.125 I. Masing-masing
molekul penanda tersebut memiliki kelebihan dan kekurangan. Molekul penanda
immunogold memiliki sensitifitas paling tinggi, yaitu immunogold (1-25 pg). HRP, AP
dan 125 I memiliki sensitivitas relatif rendah yaitu 10-20 pg, 10-50 pg, dan 50-100 pg
(Bollag et al. , 1996).

B.Tujuan Western Blot

Untuk mendeteksi ptotein pada sampel jaringan. Immunoblot menggunakan elektroforesis


gel untuk memisahkan protein asli atau perubahan oleh jarak polipeptida atau oleh struktur
3-D protein.protein tersebut di kirim ke membrane, dimana mereka dideteksi
mengggunakan antibody untuk menargetkan protein

C.Prinsip Kerja Western Blot

Prinsip yang digunakan dalam western blot adalah prinsip ikatan antigen-antibodi
komplek.protein pada NC kita anggap sebagai antigen. antibodi primer adalah antibodi
yang dapat berikatan secara spesifik pada antigen NC.agar dapat melihat antigen-antibodi
komplek maka kita memberikan warna pada antigen-antibodi tersebut.

Metode pemberian warna dapat dikategorikan menjadi dua yaitu direct dan indirect. Direct
berarti antibodi primer yang diberikan sudah Ditempel yg dengan substrat yang
mengandung warna.indirect berarti kita perlu menambahkan antibodi sekunder yang akan
berkaitan dengan antigen antibodi komplek kemudian antibodi sekunder akan perikatan
dengan substrat berwarna.
BAB III
KESIMPULAN

A.Kesimpulan
Western blot Merupakan suatu Teknik untuk menandai suatu protein pada membrane
nitroselulosa, nilon, atau transfer membrane lain setelah protein tersebut terpisahkan melalui
elektroforesis. Protein tersebut kemudian dideteksi melalui meetode autoradiogrfi, pelabelan
dengan senyawa – senyawa fluoresen, pelabelan dengan antobodi yang terikat protein, lektin
atau gen pengikat spesifik lainnya

B.Saran
Mahasiswa/I tlm harus mempelajari materi western blot agar Untuk mendeteksi ptotein
pada sampel jaringan. Immunoblot menggunakan elektroforesis gel untuk memisahkan
protein asli atau perubahan oleh jarak polipeptida atau oleh struktur 3-D protein.protein
tersebut di kirim ke membrane, dimana mereka dideteksi mengggunakan antibody untuk
menargetkan protein
DAFTAR PUSTAKA

Attwood, T.K., P.N Campbell, J.H Parish, A.D Smith, J.L. Stirling dan F.Vella (Ed). 2006,
oxford dictionary of biochemistry and molecular Biology, Revised Edition, oxford
university press