Pelatihan Pemeriksaan COVID-19

Prinsip Dasar Real Time Polymerase Chain Reaction (PCR)

Holy Arif Wibowo dan Kartika Dewi Puspa

Target
•Peserta pelatihan mampu memahami Teknik dasar
PCR/qPCR dan mengetahui perbedaan PCR
(Konventional) dan qPCR (Realtime)
•Peserta pelatihan mengetahui cara melakukan
analisa diagnostik menggunakan qPCR (single dan
multiplex)
•Peserta pelatihan dapat melakukan deteksi Covid-19
dengan menggunakan berbagai macam kit qPCR
Outline
•Pengenalan qPCR
•Perbedaan PCR (konventional) VS qPCR (Realtime)
•Melakukan analisis sederhana qPCR (Kualitatif)
•Troubleshooting
Tradisional PCR
Tradisional RT-PCR .. (2)
Tradisional PCR .. (3)
•Elektroforesis biasanya
menggunakan agarose dengan
konsentrasi tertentu yang
digunakan sebagai fase diam
ditambahkan larutan/buffer
yang dapat berubah menjadi ion
negatif dan positif sebagai
mobile phase.
•Produk Amplifikasi akan
melewati cetakan agarose ? 0 0.1 1 10

tersebut dan terjebak sesuai PCR condition

dengan ukuran amplikonnya, 95oC for 2 min
# of cycles 30
untuk kemudian dilakukan 95oC for 15
sec
analisis menggunakan sinar UV. 62oC for 30 sec
72oC for 30 sec
Real Time PCR
Real time PCR
(RT PCR / rt PCR / q PCR)

• Real time PCR qPCR (Quantitative real time PCR) /

rtPCR (Bukan Reverse Transcriptase)
• Update/modifikasi dari Tradisional PCR
•Teknik amplifikasi (perbanyakan) DNA dimana
produk amplifikasi dapat dianalisis pada setiap
siklusnya dengan menggunakan fluorogenic probe
•Perbedaannya adalah Real time PCR membutuhkan
2 alat yaitu
• Thermalcycler
• Kamera (detection)
Apa itu Real Time PCR ?

PCR Real time PCR

Applikasi qPCR
•Deteksi/diagnostic
•Gene Expresion
•SNP
•Viralload
Komponen PCR (tadisional) Vs
Komponen Real Time PCR
Tradisional PCR Real Time PCR

•dNTPs (dATP, dGTP, dCTP, •dNTPs (dATP, dGTP, dCTP,

dTTP) dTTP)
•Enzim (Reverse Transcriptase •Enzim (Reverse Transcriptase
dan atau Polymerase) dan atau Polymerase)
•Buffer •Buffer
•Mg 2+ (kovaktor) •Mg 2+ (kovaktor)
•Primer F •Primer F
•Primer R •Primer R
•Moleculer Water (Nuclease •Moleculer Water (Nuclease
free Water) free Water)
•Template (DNA / RNA) •Dye (Syber Green, Probe, dll)
•Template (DNA / RNA)
 RT-PCR vs realtime RT-PCR
Konvensional Real Time
1. Reverse Transciption 1. Reverse Transcripsion
2. PCR 2. PCR
- Denaturasi
- Denaturasi
- Annealing
- Annealing
- Elongasi
3. Elektroforesis (koleksi - Elongasi (koleksi data)
data) band 3. Nilai Ct
Syber Green Vs Probe
 Hasil qRT-PCR
Specimen Thermal Fluorescence Analysis by
Preparation Cycling detection Computer

Sinyal fluorescence vs siklus

PCR direkam dalam bentuk
kurva amplifikasi.

Hasil akhir berupa nilai Ct yang

merupakan perpotongan antara
garis threshold dengan kurva
amplifikasi

Semakin banyak DNA copy, semakin

awal sinyal terdeteksi semakin
rendah nilai Ct
 Threshold
Threshold berada diatas baseline sinyal fluorescence. Sinyal fluorescence
yang terdeteksi diatas threshold adalah sinyal yang digunakan dalam
menentukan nilai threshold cycle (Ct).

Pengaturan threshold manual diletakkan diatas noise atau background

kurva amplifikasi

Threshold
 Analisis Hasil qRT-PCR
•Kualitatif (pos/neg) • Kuantitatif
 Validasi Hasil
•Tidak terbentuk kurva amplifikasi pada kontrol negatif

•Terbentuk kurva amplifikasi pada kontrol positif dan nilai CT

dalam kisaran yang diharapkan

•Pemeriksaan housekeeping gene yang merupakan gen

yang terdapat di dalam sel epitel manusia

•Hasil housekeeping positif menunjukkan bahwa proses

ekstraksi asam nukleat dan proses pengambilan
spesimen telah dilakukan dengan benar
 Multiplex
Realtime RT-PCR
 Multiplex real-time RT-PCR
Identifikasi dua atau lebih DNA target dalam 1 reaksi PCR,
dalam hal ini menggunakan metode Realtime PCR
Multiplex real-time RT-PCR
Kelebihan:
• Mendeteksi dua atau lebih DNA target dalam 1
assay
• High through-put
• Lebih ekonomis
• Efisien ketika jumlah specimen terbatas

Kekurangan:
• Optimisasi dan validasi untuk memastikan
efisiensi dari amplifikasi pada masing-masing
target DNA
• Reagesnia Realtime dengan kemampuan high
through-put
• Memerlukan instrument dengan beberapa
channel detection
 Sistem Deteksi Multiplex qRT-PCR

5’ 3’

Dye pada Reporter akan

berpendar pada saat
probe terhidrolisis dan
sinyal emisi akan
tertangkap oleh kamera
pada alat Real time PCR
Contoh beberapa alat realtime PCR >< probe
Sistem Deteksi Multiplex qRT-PCR

Masing-masing Probe spesifik untuk target DNA

tertentu dilabel dengan Reporter Dye yang
berbeda

No. Nama Reporter Quenche

r
1. RdRp FAM None
2. E HEX None
3. RP Cy5 None
 Hasil Multiplex qRT-PCR

RP No. Target Reporter Quenche

r
1. RdRp FAM None
2. E HEX None
E
3. RP Cy5 None
RdRp
RdRp E RP Interpretasi Hasil

+ + + Positif SARS-CoV2
Hanya salah satu + Inconclusive
target positif Dilakukan tes ulang

- - + Negatif
SARS-CoV2
- - - Invalid
Troubleshooting
 TROUBLESHOOTING

Masalah Kemungkinan penyebab

Komposisi mastermix tidak optimal
Suhu PCR tidak optimal
Tidak ada amplifikasi Ada inhibitor
Template RNA/DNA rusak
Probe terdegradasi
Kontaminasi
Sinyal pada negative
Probe terdegradasi
control
Primer Dimer
Konsentrasi template terlalu tinggi
Sinyal terdeteksi terlalu
Probe terdegradasi
awal
Primer Dimer
Terima Kasih