Halaman 1

MIKROBIOLOGI TERAPAN, Oktober 1971, hlm. 659-665

Hak Cipta © 1971 American Society for Microbiology
Jil. 22, No. 4
Dicetak ilt USA

Metode Pelat Cakram

Pengujian Antibiotik Mikrobiologis
I.  Faktor-Faktor yang Mempengaruhi Variabilitas dan Kesalahan1
WW DAVIS DAN TR STOUT
Laboratorium Penelitian Lilly, Eli Lilly & Co., Indianapolis, Inidiana 46206
Diterima untuk publikasi 7 Juni 1971
Beberapa faktor yang diselidiki yang biasanya menyebabkan variasi dalam zona diameter
dalam prosedur uji difusi pelat cakram konvensional . Dari faktor - faktor tersebut yang paling
serius adalah paparan yang tidak merata dari masing-masing pelat di bagian atas atau bawah tumpukan
untuk suhu di atas dan di bawah suhu kamar . Ini tidak sama suhu mantan
postur dihindari dengan penanganan baru dan prosedur inkubasi. Sebuah variabel utama ,
tetapi satu yang dapat dikontrol, adalah interval waktu yang bervariasi antara penuangan
agar - agar yang diunggulkan dan waktu mengoleskan bantalan dengan antibiotik ke piring. Ini
pengaruh waktu pengaturan dan efek dari beberapa operasi berurutan lainnya
yang digabungkan menjadi sebuah variabel komposit. Variabel ini kemudian diperhitungkan dan
dinormalisasi dengan interposing "eksternal" referensi piring diatur dengan sebuah solusi referensi
dalam urutan sekitar 100 piring. Tidak ada zona referensi "internal" yang
dikerahkan. Faktor-faktor seperti sebagai volume agar dituangkan, bentuk irisan agar di sebuah piring,
volumetrik kesalahan dalam pengenceran, dan pertimbangan waktu yang dipelajari dan dibahas.
Hasil penelitian ini membentuk dasar untuk sebuah tes protokol yang disajikan dalam sebuah
kertas berikut .
The difusi assay dari antibiotik mempekerjakan seorang
disc metode plate memiliki besar kebajikan dari kenyamanan,
kesederhanaan, sensitivitas, efisiensi, dan ketergantungan
kemampuan (5, 10). The hubungan diameter inhibitor
zona tory untuk konsentrasi antibiotik di a
solusi diterapkan dalam cangkir telah dipertimbangkan
secara teoritis (2, 7). Dalam praktiknya, diameternya adalah
langsung responsif terhadap konsentrasi antibiotik ,
dan keterbatasan pada akurasi adalah pengakuan
dan kontrol dari banyak variabel halus. NS
penerapan dari sistem adalah umum, dan
bahan dan peralatan untuk pelaksanaan
Prosedur yang banyak tersedia. Cakram kertas dan
blow-dibentuk petri plastik hidangan yang tersedia. NS
instrumen untuk pembacaan diameter zona yang akurat
itu dijelaskan oleh Davis et al. (3) dan diproduksi
diproduksi dan dijual oleh Fisher Scientific Co., Pitts-
burg, Pa.
Ketika studi yang dilakukan dengan aplikasi antibiotik
pir untuk para eksperimen untuk menuntut tinggi akurasi
dari uji, alternatif dari mikrobiologi atau
uji fisikokimia muncul dengan sendirinya. Beberapa
perbandingan antara beberapa mikrobiologi
prosedur yang disajikan oleh Gavin (5, 6).
Tes kimia atau fisikokimia , jika divalidasi
sebagai benar - benar spesifik untuk komponen aktif ,
mungkin lebih akurat daripada hasil umumnya
Saya Dipresentasikan di BagianMikrobiologi Analitik, A dan IM
Divisi tersebut yang American Society untuk Mikrobiologi, Detroit,
Mich., 6 Mei 1968.
dicapai dengan prosedur mikrobiologi (1, 6).
Sebuah kimia atau fisik tes sering lebih setuju
untuk otomatisasi daripada prosedur mikrobiologis
(9). Untuk contoh, otomatisasi baru-baru ini membuat
lebih efisien dan akurat dengan menggunakan ofturbidimetric
dan tes kolorimetri (8). Bahan kimia atau
fisik tes kemungkinan untuk menjadi sangat sempit di nya
aplikasi dan jauh lebih sulit untuk dibangun
daripada uji mikrobiologi .
Mikrobiologi uji prosedur memberikan sebuah
ukuran aktivitas antibiotik yang valid dengan sedikit
bahaya, umumnya, dari gangguan dari biologic-
sekutu komponen tidak aktif atau produk degradasi ,
dan metode piring disc tetap di luas digunakan
(10).
Dalam pengalaman kami sendiri , secara mengejutkan besar di-
akurasi telah telah ditemui di dalam hasil dari
pengujian semacam itu . Oleh karena itu, kami memeriksa kembali beberapa
faktor-faktor dalam metode difusi pelat cakram
dan berusaha untuk meningkatkan para akurasi dari para
Metode tanpa mengorbankan yang besar umum,
sensitivitas, dan kenyamanan.
BAHAN DAN METODE
Tertentu yang apriori komitmen untuk peralatan dan
prosedur yang dibuat dalam memulai penelitian ini.
Cetakan tiup 3,75 inci (ca. 9,53 cm) sekali pakai
cawan petri plastik dan diameter 0,25 inci (6,3 mm).
cakram antibiotik yang digunakan; penerapan semua solusi
berasal dari pengisian otomatis yang sama dan -pengiriman-
ing kapiler pipet. Enam cakram yang ditempatkan pada masing-masing
659

Halaman 2
DAVIS DAN STOUT
, semua diisi dengan larutan yang sama , terdiri dari
cawan petri 

baik yang diketahui maupun yang tidak diketahui. Ini adalah di kontras

untuk yang lebih umum praktek menggunakan "internal yang
standar," yaitu, dua atau tiga cakram dengan referensi
larutan pada setiap cawan petri (10).
Pipet pengisian dan pengosongan otomatis em-
ployed di sini adalah sama di konstruksi untuk de- bahwa
ditulis oleh Davis dan McGuire (4) kecuali bahwa itu adalah
dibuat dengan sebuah kapasitas yang lebih kecil (17 jAliters) untuk memberikan
sebuah sesuai jumlah cairan ke dalam 0,25 inci
(ca. 0,64 cm) bantalan yang digunakan. Ca kapiler total
kecepatan bantalan ditempatkan pada permukaan yang kering adalah sekitar 27
uliter. Ketika sebuah pad yang ditempatkan pada agar permukaan, beberapa
kapasitas ini diisi oleh menyerap cairan dari dalam
agar dalam beberapa detik sebelum menerapkan pada uji
solusi dari para pipet. Kapasitas kapiler yang cukup
harus tetap berada di pad ketika pipet diterapkan  ke
tarik semua cairan keluar dari dalam pipet.
Solusi antibiotik tunggal [2 ,ug Keflin per ml
di pH 6,9 (0,2 molar) buffer fosfat] itu dipekerjakan
seluruh, yang sama jumlah yang telah diterapkan
untuk setiap pad setiap piring. Dengan prosedur ini, variabel
seperti sebagai urutan dari menuangkan piring, waktu dan
urutan "pengaturan" pelat (yaitu, menempatkan bantalan dan
larutan), dan menempatkan piring di tumpukan untuk inkubasi
tion, dll mengungkapkan pengaruh mereka yang terpisah . Bahkan sangat
variasi kecil dari diameter zona dapat dikaitkan dengan
variabel terkontrol ini. Diameter zona adalah
diukur secara reproduktif hingga plus atau minus 0,05 mm em-
ploying sebuah Fisher-Lilly Zona Pembaca (3). The penggunaan dari
Solusi Keflin dengan Bacillius sutbtilis sebagai yang tes atau-
ganism mengakibatkan di tajam zona tepi.
Biasanya sebuah total 102 piring, masing-masing bantalan enam bantalan,
Nvere mengatur dan ditangani di sebuah standar cara setiap hari oleh seorang
operator tunggal . Semua variasi diameter zona
di dalam pelat, di antara pelat di setiap tumpukan, dan di
tween tumpukan yang diperiksa untuk sistematis dan random
dom hubungan, dan variabilitas itu ditafsirkan
sebagai untuk penyebab dan sebagai untuk yang kemungkinan kontrol.
Sepanjang penelitian ini B. suibtilis itu dipekerjakan sebagai
yang tes organisme. Suspensi dari spora yang diadakan di 5 C
di suling air itu ditambahkan ke nutrisi panas agar. NS
hot unggulan agar itu umumnya dituangkan di 50 C. tertentu
prosedur atau bahan yang berubah di dalam saja dari
penelitian, dengan hanya sedikit akuntansi untuk efeknya
pada akurasi. Untuk contoh, kita bertekad bahwa
beberapa pakai petri hidangan yang unggul untuk orang lain,
dan, setelah sebuah pemeriksaan yang signifikan struktural
fitur dari piring, yang praktek hanya menggunakan satu
spesifik produk yang diadopsi. Ini adalah Berlian
Cawan petri plastik dari cetakan 3.
Operasi yang paling layak dengan tumpukan piring
muncul dari awal untuk menjadi untuk membuat suatu unit
penanganan sekitar 30 piring dengan kosong di atas dan
bagian bawah tumpukan. The kuantitas dari unggulan agar dituangkan
per piring itu bervariasi, menjadi baik 6, 8, atau 10 ml, tapi
8-ml tuangkan telah diadopsi dan dianggap standar.
The Komposisi dari nutrisi agar adalah sewenang-wenang
dipilih untuk zona yang terdefinisi dengan baik . [ Komposisi dari
agar nutrisi yang digunakan dengan B. subtilis adalah untuk liter:
1,5 g dari daging sapi ekstrak (Difco), 6,0 g dari pepton (Difco),
3.0 g ragi ekstrak (Difco), dan 20,0 g dari agar-agar
(BBL). Ini telah disesuaikan untuk 6.0 dengan encer HCl atau
NaOH dan tidak dibuffer.]
Sebuah awal keputusan itu dibuat untuk mempekerjakan hanya volu-
metrik perpindahan buret di membuat up yang sam-
prinsip keuangan dari standar atau solusi yang tidak diketahui. Dengan cara ini ,
ketidakakuratan karena untuk drainase kesalahan yang dihindari. Juga
mengantisipasi para keharusan untuk mempekerjakan yang sama pengencer
untuk larutan standar dan untuk yang tidak diketahui ( plasma tikus
plasma anjing , jus jaringan , dll.), prosedurnya adalah
dipilih sehingga untuk lebih terbuka untuk kerja dengan
cairan dalam jumlah mikro . Dengan demikian, distribusi standar
Penempatan prosedur microburette yang didirikan
untuk membuat semua pengenceran dan untuk memberikan akurat dan con-
pengiriman volumetrik venient dalam kisaran mikroliter .
Mikroburet perpindahan adalah 0,2 ml
atau total kapasitas 2,0 ml .
HASIL
Aplikasi larutan uji pada pad. The kuantitas
solusi diterapkan untuk sebuah pad memiliki sebuah besar proporsional
pengaruh nasional pada ukuran zona yang dihasilkan
diameter. Perbandingan itu terbuat dari variabel- yang
kemampuan volume larutan yang diterapkan pada bantalan dengan
a umum digunakan prosedur dan prosedur
diadopsi di sini. Ditimbang bantalan yang diisi dengan penyangga
solusi dengan salah satu dari dua prosedur dan kemudian
ditimbang ulang. Prosedur pertama adalah sentuhan-
ing pad untuk sebuah pasokan dari solusi di sebagai uni-
membentuk suatu cara yang menjenuhkan layak kapiler
kapasitas pad. Prosedur kedua di-
terlibat menerapkan solusi dengan self-filling dan
TABEL 1. Statisticail comparisont dari dippinig anid pipet methodls dari memberikan tes solhtioii
ke cakram uji
Volume yang dikirim (X)
Cairan dikirim
Metode pencelupan cakram
Metode pemipetan kapiler
tidak
x
Sz
>
S (%)
n
x
S2
ADALAH(%)
S2
S
S (%C)
10%,. NaCi
10
27.38
1,008
1,004
3.65
10
17.99
0,125
0,353
2.00
Air
10
27.21
2.096
1,447
5.35
10
16.86
0,020
0,143
0.83
Air
10
27.09
1.401
1.183
4.36
10
16.88
0,050
0.223
1.32
Rata-rata
4.45
Saya
1.31
N adalah yang nomor dari bantalan di setiap kelompok, X adalah yang berarti untuk para kelompok,
S2 adalah yang varians, S adalah yang standar
deviasi, dan S (% O) adalah yang koefisien dari variasi.
660
APL. MIKROBIOL.

halaman 3
ANTIBIOTIKA MIKROBIOLOGI . Saya
agar
KETEBALAN
(mm)
15.0-
12,5-
10,0-
7.5-
5.0-
2.5-
0
10
z
MENUANGKAN
VOLUME
(ml.)
12
14
16
18
DIAMETER 70NE  -

mm
ARA. 1. Depenzdence dari Zonte diameter uponi tuangkan
volume dan ketebalan agar . Diameter zona adalah rata-rata
dari enam zonze yang terbentuk di masing - masing dari dua piring yang diwakili oleh
dua titik data pada setiap volume cemberut .
-menyampaikan pipet seperti dijelaskan di atas. Tabel 1 set
keluarkan bobot solusi yang dihasilkan dan
variabilitas. The variabilitas dari berat badan atau volume yang
diterapkan adalah pada setidaknya tiga kali sebagai besar dari
mengisi bantalan oleh solusi menyentuh sebagai dari yang
menggunakan dari sebuah pipet pengiriman. The pipet mungkin menjadi mantan
diharapkan juga untuk menghindari kesalahan dalam pro-
prosedur dijelaskan karena untuk berbagai tegangan permukaan dan
viskositas dari sampel solusi.
Persiapan larutan uji . Kesalahan besar menghasilkan
sekutu terjadi dalam pengenceran volumetrik menggunakan
pipet pengiriman untuk volume kecil , terutama
di mana solusi kental dengan implisit besar
drainase kesalahan harus dapat digunakan. untuk menghindari
ini kesalahan, yang digunakan dari volumetrik perpindahan
perangkat itu diadopsi bukan de- volumetrik
perangkat livery . Signifikan kesalahan dari pengiriman dari
mikroburet perpindahan ini terjadi ketika
pengiriman kurang than1 , -liter adalah berusaha. NS
protokol yang disajikan dalam makalah berikut anti-
pate yang pengiriman dari tidak pernah kurang dari 2,0 uliters di
yang persiapan dari solusi.
Ketebalan agar-agar . Ketebalan yang tes agar
lapisan sangat mempengaruhi diameter zona yang dihasilkan .
Dengan demikian, para relasi dari zona diameter vs
ketebalan uji agar lapisan itu diperiksa. NS
hasil di Gambar. 1 menunjukkan bahwa ketebalan atau yang
tuangkan volume sebuah petri dish adalah sangat penting di tuangkan
volume biasanya digunakan. Sebuah kesalahan ketebalan
adalah konsekuensi langsung dan proporsional dari setiap
kesalahan dalam volume tuang. Perangkat penuang memungkinkan
pengiriman volume konstan karena itu penting.
Di samping kesalahan seperti ketebalan agar
dari piring ke piring yang dihasilkan dari volume tuang
kesalahan, ada juga kemungkinan variasi dalam
ketebalan agar dalam piring. Dua sumber seperti itu
kesalahan ketebalan ada di cawan petri sekali pakai.
Yang pertama adalah formasi berbentuk baji
lapisan agar sebagai hasil dari kemiringan dari pelat bawah
sementara agar yang meleleh mendingin dan mengeras.
Ini dapat disebabkan oleh pelat yang tidak sempurna atau
untuk kemiringan permukaan di mana piring yang
ditempatkan untuk menuangkan.
Luasnya bentuk baji agar-agar tersebut memiliki:
diukur dengan menggunakan pengukur kedalaman untuk
mengukur dalam kontur dari pelat bawah.
Kami menemukan bahwa para cetakan di mana para plastik
hidangan yang dibuat umumnya Menyebabkan sebuah yang cukup besar tilt
untuk yang karakteristik hidangan dari cetakan. Jumlah
kemiringan karakteristik dari empat cetakan nomor dari
Plat Diamond Plastics adalah 0,025, 0,125, 0,15,
dan 0,175 mm melintasi 2,5 inci (sekitar 6,4 cm)
diameter dari lingkaran pusat zona. NS
produk dari beberapa produsen lain adalah
sama diperiksa dan therange oftilt en-
balas itu umumnya lebih besar dari 0,125 mm.
Ketebalan rata-rata agar dalam 8 ml tuang
sebuah petri dish adalah sekitar 1,25 mm. Itu di sana-
kedepan jelas bahwa sebuah beberapa persepuluh milimeter dari
bentuk baji adalah persentase besar variasi dalam
ketebalan. Gambar 2 menunjukkan untuk satu eksperimen yang
keterkaitan dari kemiringan (dari dua sumber), wedge
bentuk agar, posisi zona, dan diameter zona
eter.
The wedge efek daun rata-rata ketebalan
agar-agar di sebuah piring terpengaruh. Sedangkan irisan
efek menyebabkan variasi besar dari diameter zona
dalam sebuah piring, ada adalah tentu saja kecenderungan yang
lebih besar zona dihasilkan di tipis sisi untuk mengkompensasi
memenuhi dan rata-rata keluar dari diameter zona yang lebih kecil
eters yang hasil dari tebal agar di dalam
sisi yang berlawanan. Meskipun pembatalan ini mungkin tidak
lengkap, tidak ada efek yang teratur bisa menjadi diamati
pada rata-rata dari enam zona diameter piring
saat kemiringan 0,00, 0,45, 0,72, 0,90, dan bahkan 1,20
mm sengaja dipaksakan. Saat rata-rata
dari semua zona di sebuah piring yang bergantung pada ke
hilangkan sumber kesalahan ini, seperti yang dilakukan di sini,
zona yang berlawanan harus dihilangkan juga jika
setiap zona di sebuah isimperfect piring atau tidak terbaca.
Seperti rata-rata keluar dari wedge efek akan tidak
terjadi dalam pengaturan yang tidak simetris dari zona seperti ,
sebagai mana tiga tidak diketahui dan tiga internal
zona standar digunakan (10).
Variasi sistematis kedua dalam bentuk
piring yang mengarah ke variasi dari ketebalan dari
agar dari zona ke zona dalam suatu piring adalah sebuah cup-
JOL. 22, 1971
661

halaman 4
DAVIS DAN STOUT
2
3
1
~~4
6
5

"akan<
~~~~~~~DISI
FOm
TILT 0,10 mm
H 

POSISI   SAMPAI 4.
1

-BENCH TILT
0.20mm PER 2'2"
-  TINGKAT
0.3mm KOMBINASI TILT
14
mm

DIAMETER ZONA
l1 mm (AVG. 18 PIRING)
ARA. 2. Hubungan diameter zona dengan posisi bantalan
dan agar ketebalan di sebuah piring dengan irisan berbentuk agar.
Karakteristik kemiringan piringan secara seragam terkait dengan
posisi sariawan terlihat pada cawan cetakan.
Piring ini yang berorientasi dan ditempatkan pada miring sur-
wajah dan dituangkan.
berbentuk kontur bagian bawah dari pelat. NS
deformitas terbalik, sebuah pusat tonjolan, juga promi-
nent dalam produk dari beberapa produsen. Ini
deformitas adalah minimal di Diamond Plastik
piring.
The Pengaruh faktor bentuk yang kedua ini tidak
dibatalkan dengan rata-rata. The penempatan bantalan di
jarak yang tidak sama dari pusat ketika cangkir
bentuk atau pusat tonjolan yang ada akan menyebabkan variasi
di zona diameter karena untuk variasi dari agar-agar
ketebalan di sepanjang garis dari pusat ke tepi. NS
penggunaan dari sebuah panduan visual untuk menempatkan para bantalan adalah Essen-
sial. Lokasi bantalan, dalam hal jarak
dari pusat, adalah lebih penting yang lebih besar seperti
deformitas bagian bawah pelat dan
semakin kecil jumlah agar yang dituangkan. Kita punya
tidak melakukan pengukuran pada kemiringan atau deformitas lainnya
di bawah piring kaca petri, tetapi mereka adalah
sangat mencolok sehingga mereka seharusnya tidak
harus dipertimbangkan untuk digunakan.
Konsentrasi inokulum. Pengaruh inok-
konsentrasi ulum pada ukuran zona yang dihasilkan adalah
diakui secara luas (11). Percobaan yang per-
dibentuk untuk menentukan bagaimana kritis kepadatan dari
spora inokulum mungkin menjadi di dalam sistem sekarang
ketika lainnya faktor yang konstan. Meskipun lebar
variasi dalam spora kepadatan lakukan menghasilkan zona
perbedaan diameter ( zona yang lebih kecil untuk yang lebih tinggi
inokulum), yang paling seriousconsequence adalah di
kualitas dari hasil zona tepi, yang berada
granular dan tidak terdefinisi dengan baik ketika terlalu encer
inokulum digunakan. Sebuah sesuai inokulum
Konsentrasi itu ditemukan setelah persiapan
setiap kumpulan spora baru dan dijaga konstan dengan
mempekerjakan seorang dilutuion seragam dalam dipanaskan agar.
Paparan suhu-waktu . Perhatian utama
itu diberikan ke beberapa rincian dari operasi yang
mungkin memaksakan suatu ketimpangan suhu mantan
posure dari para individu piring ditangani dalam satu
hari. Perhatian diberikan pada setiap langkah
prosedur penanganan antara menuangkan piring
dan tumbuh-out dari para tes organisme.
Dalam percobaan pendahuluan , suhu
dari unggulan agar diukur sebagai itu muncul dari
a menuangkan tabung dari pipetting otomatis
mesin. Hal ini dilakukan dengan memiliki tembaga-
termokopel konstantan di tabung outlet. NS
termokopel EMF langsung direkam pada a
perekam grafik strip sepanjang eksperimen ini
penuangan. The unggulan agar diadakan di sebuah konstanta
penangas air suhu 50 C selama penuangan
ing. The berlalunya agar panas melalui pipetter yang
dan tabung secara bertahap memanaskan pipet beberapa
derajat. Sebaliknya, agar-agar awalnya didinginkan
dalam melewati yang pipetter dan agar pertama
muncul tidak sampai ke kondisi mapan mengalir
suhu. Dengan demikian, ketika menuangkan adalah untuk
dilakukan pada 50 C, air pada 50 C adalah dipompa melalui
yang pipetter sampai suhu di menuangkan
Tip yang stabil sebelum memompa yang unggulan dipanaskan
agar.
Sebuah catatan itu dibuat dari suhu
agar benih yang muncul pada suhu 50 C setelah singkat (3 menit)
pembilasan dengan air pada 50 C dan kemudian menolak
lima tuang (40 ml) agar - agar yang diunggulkan pada suhu 50 C
suhu konstan sepanjang penuangan
100 piring untuk lebih baik dari 0,5 C.
Sebuah percobaan yang dilakukan untuk menentukan yang
tingkat di mana 8 ml agar panas didinginkan dalam petri
piring setelah dituang. Sebuah termokopel ditempatkan
di piring seperti itu dan suhunya diikuti
dengan sebuah grafik jalur perekam. jalannya waktu-
perature penurunan suhu kamar adalah asymp-
totik dan cepat. Secara umum, suhu memiliki
jatuh ke dalam 1 C dari suhu kamar dalam
15 menit setelah dituang.
The menempatkan piring dituangkan dalam tumpukan sebelum
mereka mencapai suhu kamar melambat dan memanjang
yang pendinginan waktu. Konsekuensi utama dari ini
pendinginan yang lebih lambat dalam tumpukan adalah bahwa pelat dilepas
dari bangku atas dan ditempatkan di tumpukan di a
suhu yang lebih tinggi ( waktu yang lebih singkat setelah penuangan)
mengalami sebuah lebih lama paparan ditinggikan
suhu dari satu ditempatkan di tumpukan setelah
pendinginan lebih lama di atas bangku.
Jika relatif lambat operasi dari menuangkan (10
mi), yang diikuti dengan cepat oleh relatif cepat
operasi dari susun (2 menit), piring pertama
662
APL. MIKROBIOL.
 halaman 5
UJI ANTIBIOTIK MIKROBIOLOGI. Saya
TABEL 2. Ketergantungan diameter zona
pada suhu inkubasi
Tekad
Tumpukan
37 C
30 C
26 C
Diameter zona
1
12,76 13,49 14,88
(mm) a
2
12.40 12.42 14.40
Sambungkan dengan sim-
1
1,70 2,00 2,77
standar yang ditentukan
2
1,77 2,00 2,80
kurva pada 30 C
a Rata - rata 12 piring.

dituangkan akan mendingin lebih jauh ketika

ditumpuk dari piring terakhir dituangkan. Eksperimen
di mana piring yang ditumpuk segera setelah
menuangkan telah mengkonfirmasi harapan ini, memproduksi
zona yang jauh lebih kecil . Dengan demikian, seorang biasa
Praktek itu diadopsi dari membiarkan piring dingin pada
bangku atas selama kurang lebih 20 menit setelahnya
menyelesaikan penuangan sebelum ditumpuk.
Untuk hakim bagaimana penting adalah suhu paparan
selama memegang atau inkubasi di zona yang dihasilkan
diameter dan di dalam uji hasil, inkubasi adalah
dilakukan pada beberapa suhu, dan hasilnya
yang disajikan sebagai zona diameter dibandingkan suhu
pada Tabel 2. Semua diameter zona untuk setiap tumpukan
dirata - ratakan. Data untuk hanya dua tumpukan yang pra-
dikirim. Sebuah konversi khas zona diameter untuk
"konsentrasi" menunjukkan sensitivitas tes yang tinggi
hasil, dinyatakan sebagai konsentrasi, yang akan
hasil dari variasi inkubasi yang tidak terhitung
suhu.
Setelah pendinginan di sebuah kulkas atau pemanasan di
sebuah inkubator, mengalir panas ke dalam atau keluar dari tumpukan
melalui beberapa termal kontak dari stack dengan sebuah
sumber panas atau heat sink. Misalnya bagian bawah
pelat tumpukan akan menyimpang secara mencolok di
termal eksposur jika stack yang ditempatkan pada sebuah
rak kulkas dingin atau di inkubator hangat
rak. Dalam semua percobaan di mana kedua pendingin
tion dan inkubasi pada 37 C yang digunakan, seperti
end-efek yang terlihat. The Konsekuensi ofrefriger-
asi adalah selalu untuk menanamkan suatu depresi tempera-
eksposur masa depan (dan zona tinggi konsekuen
diameter) di atas pelat yang berada paling dekat
kontak dengan rak kulkas. Bahkan membungkus
tumpukan dan penggunaan dari sebuah pad isolasi lakukan tidak
menghilangkan efek atas dan bawah.
Ketika tumpukan yang ditempatkan di sebuah inkubator di
37 C untuk tumbuh-out, serupa tapi lebih sulit dipahami atas
dan anomali dasar diameter zona adalah
diamati dalam tumpukan. Membungkus tumpukan dalam
aluminium foil dan menangguhkan mereka dengan cara dari
selotip untuk menghilangkan kontak padat dengan
inkubator gagal untuk menghilangkan sepenuhnya atas
dan anomali dasar dari diameter zona yang dihasilkan
eter. Dalam upaya gigih untuk menghilangkan bagian atas dan
anomali bawah dalam tumpukan yang disebabkan oleh inkubasi
pada 37 C, perubahan yang mencoba untuk membatasi, redirect,
atau menghilangkan arus udara di inkubator. Seperti
upaya menghasilkan perubahan tetapi tidak menghilangkan
anomali atas dan bawah. Sejak anomali
umumnya paling dibesar-besarkan di paling atas
dan pelat paling bawah, tetapi masih dapat dideteksi beberapa
piring dari atas atau bawah, ini sumber kesalahan
dapat diminimalkan dengan membiarkan yang terakhir tidak disetel
empat piring di dalam atas dan di bagian bawah. Bahkan
praktik ini tidak sepenuhnya menghilangkan
anomali.
Penguapan bahkan dalam jumlah yang sangat kecil
air dari piring yang dituangkan akan menyebabkan
penurunan suhu. Penguapan akan
terjadi jika pelat dalam tumpukan dibiarkan
kontak dengan atmosfer tak jenuh. jika
aliran termal masuk atau keluar dari pelat lambat
dibandingkan dengan laju penguapan, seseorang bisa
mengantisipasi dengan menurunkan suhu dari 8
ml agar sebesar 5,0 C dengan penguapan hanya 80 mg
dari air (1 % 7, dari yang 8-ml tuangkan volume). Sesuai-
ingly, kandang dari tumpukan itu disediakan untuk mengamankan
dan menjaga suasana jenuh tentang
piring untuk menghindari efek pendinginan dari penguapan tersebut
tion.
Semua upaya untuk mencapai pengurangan seragam atau linier
diameter zona ishing dalam tumpukan pelat gagal
ketika pendingin itu dipekerjakan antara pour-
ing dan pengaturan, dan ketika inkubasi pada 37 C adalah
digunakan. Oleh karena itu, prosedur suhu ruangan
dirancang untuk menyimpan dan inkubasi untuk mengelilingi
melampiaskan perubahan suhu yang besar . Ada yang melekat
keuntungan dalam penanganan suhu kamar (26 C)
atas prosedur konvensional yang menggunakan re-
frigeration dan inkubasi pada 37 C. ini adalah yang
tidak adanya perubahan suhu yang tidak dapat
dibuat persis sama untuk semua pelat dalam satu atau
lebih banyak tumpukan. Selanjutnya, bekerja di laboratorium ini
tories (J. F. Quay, data tidak dipublikasikan) telah menunjukkan
bahwa beberapa organisme uji menghasilkan zona yang lebih baik
ketika tumpukan, tertutup di dekat-pas baja
silinder, yang diinkubasi pada 30 C, oreven pada 37 C.
Hasil anomali akhir yang relatif kecil dari
inkubasi jika silinder baja yang digunakan sebagai
dijelaskan sebelumnya tanpa mengintervensi kulkas
penyimpanan.
Faktor lain yang mempengaruhi tingkat perkecambahan . Di dalam
Selain suhu, faktor lain yang mempengaruhi
tingkat pengaruh perkecambahan termasuk bahan kimia
komposisi media (yang, tentu saja,
dapat diperbaiki) dan pH, yang dapat disesuaikan
awalnya dan distabilkan dengan dimasukkannya buffer.
Tanpa buffer, pH agar-agar yang diunggulkan dengan B.
Spora subtilis umumnya melayang ke atas selama
tumbuh. PH seperti perubahan selama tumbuh-out
telah diamati, tetapi variabilitas pH dari pelat
untuk piring adalah tidak besar, dan pertumbuhan sering lebih
JOL. 22, 1971
663

halaman 6
DAVIS DAN STOUT
menguntungkan dalam buffer yang sangat lemah atau tidak
larutan buffer.
Pertimbangan waktu. Untuk menemukan dan mengontrol
sumber variabilitas dalam mikrobiologi difusi
pengujian, perhatian telah dipusatkan pada pa-
parameter dari proses difusi dan atas dasar
rameters dari proses tumbuh keluar dari uji
mikroorganisme. Hasil sebuah difusi
uji penghambatan adalah hasil dari perlombaan antara
penyebaran antibiotik oleh difusi dan grow-
keluar dari organisme uji . Kondisi yang
difusi pengaruh tingkat yang sebagian besar dikontrol,
dan kecil suhu variasi memiliki sebuah relatif
pengaruh kecil pada difusi.
The saat di mana berkecambah spora
mencapai beberapa tahap kritis-mungkin di mana re-
organisme vegetatif sulting pertama ganda-adalah
mekanisme "waktu" untuk menentukan posisi
dari tepi zona . Di dalam lingkaran ini yang berkecambah
organisme yang dicegah dari melewati kritis
panggung (penggandaan), sedangkan di luar lingkaran ini
konsentrasi antibiotik terlalu kecil untuk dicegah
yang acara. Secara umum dipahami bahwa ketika
konsentrasi inokulum meningkat (di sini
ganda) lebih banyak antibiotik diperlukan untuk mencegah
pertumbuhan lebih lanjut. Jadi, garis di mana
penggandaan dicegah dengan antibiotik yang cukup
Konsentrasi menjadi sebuah tetap zona tepi yang
menjadi lebih tajam tetapi tidak bergerak secara signifikan
dengan pembagian lebih lanjut dan penggandaan bilangan
bers dari tes organisme. Di luar lingkaran ini, sebuah kon-
tinuing peningkatan kepadatan terjadi sebagai yang penggandaan
dan melipatgandakan dari organisme terus.
Inisiasi perkecambahan untuk semua pelat adalah
mungkin itu saat ketika para spora suspensi
ditambahkan ke agar-agar panas . Dengan demikian, piring terakhir
dituangkan harus datang ke satu waktu kritis acara
disebut untuk di atas di tentang sama waktu, karena
semua piring yang dituangkan dalam suatu periode 10 menit. NS
pendinginan ke suhu kamar yang pertama dan terakhir
piring yang dituangkan hanya dipisahkan oleh short ini
selang. Pendinginan sama cepatnya untuk semua pelat
karena mereka semua keren di bangku atas.
Inisiasi difusi, bagaimanapun, adalah di dalam
saat ketika solusi antibiotik yang diterapkan
ke pad. Dari yang pertama piring set untuk yang terakhir
piring set di sebuah rangkaian 102 piring dapat menjadi 1 jam.
Jadi, ketika "waktu" disebut oleh perkecambahan
acara, set piring terakhir akan memiliki 1 jam lebih sedikit
untuk menyebar, dan zona ditentukan di bahwa
saat harus menjadi lebih kecil untuk sebuah diberikan konsentrasi
dari larutan uji .
Jika pengaturan bantalan uji dilakukan secara teratur
jadwal waktu, faktor ini dapat diperhitungkan dalam
pengolahan data selanjutnya . The fungsi dari
sebuah konstanta larutan standar (2 ug / ml) ditetapkan pada
secara teratur sepanjang yang jadwal adalah tode-
baik pengaruh urutan dan urutan waktu
ini dan semua operasi lain yang dilakukan di
urutan numerik yang sama . Pengaruh ketertiban
penanganan dalam percobaan 1 hari bisa
kemudian dipertanggungjawabkan dalam penanganan data.
Data representatif menunjukkan bahwa diameter berkurang
lipatan kira-kira secara linier dengan pengaturan
order, atau dengan yang waktu dari pengaturan, jika biasa
jadwal pengaturan diikuti. Kemiringan ini harus
lebih besar sebanding dengan waktu yang dibutuhkan untuk
menetapkan suatu jumlah tertentu piring.
Sebuah percobaan dilakukan untuk menentukan
efek dari waktu memegang dituangkan dan
piring bertumpuk pada suhu kamar sebelum pengaturan
mereka. The waktu antara pengaturan dan tumbuh-out
(waktu yang diperbolehkan untuk difusi) harus dikurangi
dengan menahan lebih lama antara penuangan dan pengaturan. A
penurunan reguler terjadi pada diameter zona
diproduksi oleh 2.0 ,ug antibiotik per ml diterapkan
ke piring yang dipegang untuk interval hingga sekitar 5 jam setelahnya
penuangan (lihat Tabel 3). Ketika piring-piring itu dipasang
di lain waktu, kecil, tidak dapat digunakan, didefinisikan dengan buruk
zona-zona terbentuk. Dari percobaan ini, kita
menyimpulkan bahwa zona yang dihasilkan tajam dan
dapat digunakan dari piring yang telah diangkat sebagai
sebanyak 3 jam setelah penuangan. Batasan ini mungkin
dari tentu saja sangat bervariasi dengan tes organisme.
The berikut hadiah kertas nyaman
metode akuntansi untuk semua faktor waktu;
TABEL 3. Pengaruh ruang suhu holding
waktu sebelum mengatur piring
Waktu tunggu
Diameter zona
Pengamatan
(jam)
(mm)'
Ekst 1
1
15.18
Zona normal
2
14.43
Zona normal
3
13.57
Zona normal
4
12.71
Zona normal
5
11.55
Zona normal
6
10.74
Tepi zona difus
7
9.8
Tepi zona difus
8
9.9
Tepi zona difus
10
10.16
Tepi zona difus
12
10.20
Tepi zona difus
Ekspektasi 2
1
15.04
Zona normal
2
13.96
Zona normal
4
11.83
Zona normal
5
10,75
Zona normal
6
9.71
Zona normal
7
8.60
Zona normal
8
8.10
Tepi zona difus
9
8.15
Tepi zona difus
10
8.25
Tepi zona difus
a Rata-rata 24 zona.
664
APL. MIKROBIOL.

halaman 7
UJI ANTIBIOTIK MIKROBIOLOGI . Saya
yaitu, urutan dari menuangkan, susun, dan
pengaturan. Untungnya, meskipun efek dari ini
variabel tidak dapat dihapus, mereka bisa menjadi regular
ized, digabungkan, dan dicatat dengan cara
yang Menghapus mereka sebagai sumber dari variabilitas atau
kesalahan dalam hasil assay .
DISKUSI
Dari faktor-faktor yang mempengaruhi variabilitas dan
kesalahan, beberapa dapat dikontrol dengan pilihan kondisi
dan beberapa dengan prosedur penanganan. Lainnya
faktor - faktor tersebut tidak dapat dikendalikan secara layak, tetapi, dengan
mendirikan sebuah ketertiban dan waktu dari opera-
tion, konsekuensi dari kombinasi
faktor adalah sebuah penurunan biasa di zona diameter untuk sebuah
konsentrasi yang diberikan sebagai nomor urut pelat
meningkat. Piring referensi dimasukkan di regular
interval memungkinkan normalisasi gabungan ini
variabel.
Di antara faktor-faktor yang dapat dikendalikan, kami telah menunjukkan
yang khusus perawatan harus diambil untuk menerapkan sebuah konstanta
volume larutan ke bantalan. Keunggulan dari
menggunakan sebuah otomatis mengisi dan mengosongkan kapiler
pipet untuk mengoleskan larutan antibiotik di atas
prosedur alternatif ditunjukkan. The penggunaan dari
pipet cepat dan layak. Pengaturan piring
adalah mungkin pada suatu rutin tingkat dari dua piring atau 12
bantalan per menit.
Akurasi larutan uji pengenceran buruk karena
gelas pengiriman volumetrik konvensional jika sangat
volume kecil yang digunakan. Kesulitan seperti itu bisa
dielakkan dengan menggunakan perpindahan
microburettes, yang tidak hanya memberikan akurasi
membaca volume tetapi juga menghilangkan bahaya
dari kesalahan drainase .
Ketebalan agar adalah sebuah faktor penting dalam menentukan
yang zona diameter. The faktor yang berkontribusi untuk
Variasi dalam agar ketebalan adalah yang jumlah dari agar-agar
menuangkan (menyebabkan sebuah berbanding lurus kesalahan di
ketebalan) dan bentuk baji. Hasil yang terakhir
dari cawan petri miring atau dari menuangkan a
permukaan dengan kemiringan.
Kesalahan lain dari cawan petri yang menyebabkan un-
variasi terkontrol dalam ketebalan agar - agar adalah
Kehadiran dari sebuah bawah nonplanar. Sedangkan baji
bentuknya menghasilkan variasi diameter zona yang sangat besar.
tions dalam sebuah piring, rata-rata AU zona diameter
di sebuah piring menghilangkan sebagian besar kesalahan dari ini
sumber. Dalam protokol pengujian di mana referensi "internal"
zona ence digunakan, baik referensi dan un-
zona yang diketahui harus ditetapkan hanya sebagai pasangan yang berlawanan ,
dan, jika salah satu zona dari agar-agar adalah tidak dapat digunakan, sebaliknya
zona harus dijatuhkan.
Paparan suhu yang berbeda dari pelat di
posisi yang berbeda dalam tumpukan (yaitu, atas dan
bawah) tidak dapat dihindari tetapi dapat diminimalkan dengan
kandang tumpukan dalam silinder baja yang pas
dan penghindaran perubahan suhu yang besar ,
biasanya antara suhu kamar dan kulkas
masa depan. Pendinginan tidak boleh digunakan, dan
inkubasi harus pada suhu kamar jika
memungkinkan pertumbuhan organisme uji yang memuaskan .
Beberapa faktor yang terkait dengan penuangan dan penumpukan
ing telah ditemukan yang menyebabkan ketidaksetaraan
paparan suhu . Tindakan korektif adalah
ditemukan.
Pertumbuhan karakteristik organisme uji dan
zona ukuran dan ketajaman merespon untuk perubahan di pH
dan buffering. Tidak ada upaya yang dilakukan di sini untuk
mengoptimalkan faktor-faktor ini untuk pengujian. Ini seharusnya
dilakukan untuk setiap organisme uji dan untuk setiap anti-
biotik, jika pengujian berulang-ulang adalah untuk dapat dilakukan.
UCAPAN TERIMA KASIH
Kami menghargai diskusi yang bermanfaat dengan Jack Westhead dan
dermawan bantuan teknis oleh anggota -nya laboratorium staf.
DAFTAR PUSTAKA
l. Alicino, JF 1946. Metode lodometric untuk assay dari
sediaan penisilin. Ind. Eng. Kimia dubur. 18:619-620.
2. Cooper, KE, dan AH Linton. 1952. Pentingnya suhu
suhu selama jam-jam awal inkubasi pelat agar - agar
dalam tes. J. Gen. Mikrobiol. 7:8-17.
3. Davis, WW, JM McGuire, dan TV Parke. 1949. Beberapa
baru prosedur dan instrumen yang berguna untuk mikrobiologi
pengujian antibiotik dengan metode difusi. SAYA.
Sebuah zona baru
pembaca. J. Amer. Farmasi. Soc. Sci. Ed. 38:459-462.
4. Davis, WW, dan JM McGuire. 1949. Beberapa pro baru
prosedur dan instrumen yang berguna untuk mikrobiologi anti-
pengujian biotik dengan metode difusi. II. Sebuah otomatis
pipet pengantar untuk digunakan dengan cakram berpori . J. Amer. Farmasi.
Pantat. Sci. Ed. 38:462-463.
5. Gavin, J. 1956. Laporan proses mikrobiologi . analitis
mikrobiologi. II. Metode difusi. aplikasi I Mikro-
biol. 5:25-33.
6. Gavin, J. 1956. Laporan proses mikrobiologi . analitis
mikrobiologi. AKU AKU AKU.
Metode Turbidimetri. aplikasi Mikro-
biol. 5:235-243.
7. Humphrey, JH, dan JW Lightbown. 1952. Sebuah teori umum
untuk uji pelat antibiotik dengan beberapa aplikasi praktis
tion. J. Gen. Mikrobiol. 7:120-143.
8. Kuzel, NR, dan FW Kavanaugh. 1971. Automated sistematis
tema untuk mikrobiologi. Dia.
Konstruksi sistem dan
evaluasi antibiotik dan vitamin.J. Farmasi. Sci.
60:767-773.
9. Niedermayer, A. O., F. M. Russo-Alesi, CA Lendzian,
dan J. M. Kelly. 1960. Sistem otomatis untuk kontinuitas
ous penentuan penisilin di fermentationmedia
menggunakan reagen hidroksilamin . dubur. Kimia 32:664-666.
10.Simon, J
S., dan EJ Yin. 1970. Mikrobioassay anti-
agen mikroba . aplikasi Mikrobiol. 19:573-579.
11. Thompson, F. V. 1964. The hubungan betweeninoculum dan
Zona ukuran sensitivitas tes oleh para agar difusi metode.
Akta Patol. Mikrobiol. Pindai.61:303-316.
JOL. 22, 1971
665